Emergencia de influenza aviar fatal en focas de New England Harbor

Emergence of Fatal Avian Influenza in New England Harbor Seals Emergence of Fatal Avian Influenza in New England Harbor Seals S. J. Anthony,a,b J. A. St. Leger,c K. Pugliares,d H. S. Ip,e J. M. Chan,f Z. W. Carpenter,f I. Navarrete-Macias,a M. Sanchez-Leon,a J. T. Saliki,g J. Pedersen,h W. Karesh,b P. Daszak,b R. Rabadan,f T. Rowles,i and W. I. Lipkina Center for Infection and Immunity, Mailman School of Public Health, Columbia University, New York, New York, USAa; EcoHealth Alliance, New York, New York, USAb; SeaWorld, San Diego, California, USAc; New England Aquarium, Boston, Massachusetts, USAd; National Wildlife Health Center, United States Geological Survey, Madison, Wisconsin, USAe; Center for Computational Biology and Bioinformatics, Department of Biomedical Informatics, Columbia University, New York, New York, USAf; Athens Veterinary Diagnostic Laboratory, University of Georgia, Athens, Georgia, USAg; National Veterinary Services Laboratory, United States Department of Agriculture, Washington, DC, USAh; and National Oceanic and Atmospheric Administration, Washington, DC, USAi ABSTRACT From September to December 2011, 162 New England harbor seals died in an outbreak of pneumonia. Sequence analysis of postmortem samples revealed the presence of an avian H3N8 influenza A virus, similar to a virus circulating in North American waterfowl since at least 2002 but with mutations that indicate recent adaption to mammalian hosts. These include a D701N mutation in the viral PB2 protein, previously reported in highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses infecting people. Lectin staining and agglutination assays indicated the presence of the avian-preferred SA_-2,3 and mammalian SA_-2,6 receptors in seal respiratory tract, and the ability of the virus to agglutinate erythrocytes bearing either the SA_-2,3 or the SA_-2,6 receptor. The emergence of this A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 virus may herald the appearance of an H3N8 influenza clade with potential for persistence and cross-species transmission. IMPORTANCE The emergence of new strains of influenza virus is always of great public concern, especially when the infection of a new mammalian host has the potential to result in a widespread outbreak of disease. Here we report the emergence of an avian influenza virus (H3N8) in New England harbor seals which caused an outbreak of pneumonia and contributed to a U.S. federally recognized unusual mortality event (UME). This outbreak is particularly significant, not only because of the disease it caused in seals but also because the virus has naturally acquired mutations that are known to increase transmissibility and virulence in mammals. Monitoring the spillover and adaptation of avian viruses in mammalian species is critically important if we are to understand the factors that lead to both epizootic and zoonotic emergence. Received 31 May 2012 Accepted 29 June 2012 Published 31 July 2012 Citation Anthony SJ, et al. 2012. Emergence of fatal avian influenza in New England harbor seals. mBio 3(4):e00166-12. doi:10.1128/mBio.00166-12. Editor Anne Moscona, Weill Medical College, Cornell University Copyright © 2012 Anthony et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported License, which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Address correspondence to S. J. Anthony, sja2127@columbia.edu, or W. I. Lipkin, wil2001@columbia.edu; for questions on computational modeling, contact R. Rabadan, rabadan@dbmi.columbia.edu. S.J.A. and J.A.S.L. contributed equally to the study. T.R. and W.I.L. are joint senior authors. Fatal pulmonary epizootics of influenza have been observed previously in seal populations, including outbreaks of H7N7 in 1979 to 1980 (1, 2), H4N5 in 1983 (3) and H4N5 and H3N3 in 1991 to 1992 (4). Such outbreaks are significant not just because of the detriment they pose to animal health but because influenza in mammals can act as a source for human pandemics (5). In a _4-month period beginning in September 2011, 162 harbor seals (Phoca vitulina) were found dead or moribund along the New England coast. This number is approximately four times the expected mortality for this period. Most of the affected individuals were less than 6 months old, and common causes of death (including malnourishment) were ruled out. Five of the affected animals were investigated to identify a causative agent, and here we demonstrate that avian influenza virus subtype H3N8 was responsible for the observed clinical and pathological signs in these animals. Unlike any previous outbreak in seals, this H3N8 virus has naturally acquired mutations that reflect adaptation to mammalian hosts and that are known to increase virulence and transmissibility in avian H5N1 viruses infecting mammals. The virus has further acquired the ability to use the SA_-2,6 receptor commonly found in the respiratory tracts of mammals, including humans. The existence of a transmissible and pathogenic influenza is of obvious public concern. RESULTS AND DISCUSSION Five animals were submitted for anatomical and microbiological analysis. All were collected from the peak of the outbreak (late September to October) and had pneumonia and ulcerations of the skin and oral mucosa (Fig. 1). Nucleic acids extracted from lung, trachea, liver, kidney, thoracic lymph node, mesenteric lymph node, spleen, skin lesion, and oral mucosa were tested by PCR for the presence of a wide range of pathogens, including herpesviruses, poxviruses, adenoviruses, polyomaviruses, caliciviruses, paramyxoviruses, astroviruses, enteroviruses, flaviviruses, rhabdoviruses, orbiviruses, and influenza viruses. Influenza A virus was detected in several tissues from all five animals, and PCR cloning and sequencing of genes for hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) revealed the subtype to be H3N8, a subtype RESEARCH ARTICLE July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 ® mbio.asm.org 1 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org typically associated with infection of avian, equine, and canine hosts (6-8). Influenza virus was isolated from the allantoic fluid of specific-pathogen-free (SPF) eggs inoculated with homogenates of PCR-positive tissues, including lung, lymph nodes, tonsil, and kidney, and all isolates were reconfirmed to be H3N8. In accord with conventional nomenclature, the virus is provisionally named A/harbor seal/Massachusetts/1/2011. In situ hybridization (ISH) using oligonucleotide probes for influenza virus H3N8 segments 4 (HA) and 7 (matrix) and immunohistochemistry using polyclonal antibodies against H3N8 HA antigen confirmed the presence of influenza virus in lung, where signal was concentrated in the bronchiole epithelium and mucosa of the pulmonary parenchyma (Fig. 2 and see Fig. S1 in the supplemental material). The average load of HA and NA RNAs in lung was 300 copies/100 ng of extracted RNA. ISH staining in nonrespiratory tissues was limited to sporadic infection of single cells in intestine, kidney, and lymph node, and the averageHA/NA RNA load was five copies/100 ng. These results are consistent with the histological observation that the main site of viral replication is the respiratory tract. Cellular morphology and terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) consistent with apoptosis was observed in virusinfected pulmonary epithelial cells (Fig. 3). TUNEL staining also revealed the widespread presence of apoptotic cells in areas where no virus was observed but not in negative-control tissue, suggesting an additional host-mediated response to the infection. Full-genome sequencing was completed following PCR cloning of all eight influenza genome segments directly from infected tissue. Sequences were submitted to GenBank and assigned accession numbers JQ433879 to JQ433882. Phylogenetic analyses of these nucleotide sequences with avian, canine, and equine H3N8 influenza virus genomes demonstrated the closest relationship to a virus identified in North American waterfowl in all 8 segments (Fig. 4). These data are consistent with the recent transmission of the H3N8 virus from wild birds to seals. The closest avian relative, A/blue-winged teal/Ohio/926/2002, had an overall 96.07% nucleotide sequence identity across the genome (Hamming distance), with no individual segment having less than 94% identity. This level of similarity across all segments with an isolate separated by a span of 10 years suggests that this virus has been circulating in the aquatic bird populations since at least 2002. A total of 37 amino acid substitutions separate the seal H3N8 and avian H3N8 viruses, which are summarized in Table 1. The corresponding amino acids found in other seal influenza viruses, in the canine and equine H3N8 viruses, and in selected human influenza viruses are included for comparison. Of these, mutations PB2-701N and HA-260M are shared exclusively by the seal and mammalian (canine/equine) H3N8 viruses, while mutations NA-399R, PB2-382V, and PA-184N are shared by the seal H3N8 and human H3N2 viruses, all of which suggests adaptation to mammalian hosts. Mutations PB2-60N, PB2-376R, PB1-174I, PB1-309G, PB1-359G, PB1-376V, PB1-377G, PB1-464E, NP- 63V, NP-128G, and NP-296H are all exclusively found in the seal H3N8 virus (Table 1). Future studies will be required to assess the functional significance of many of these mutations, especially in sealH3N8PB1, where a significant number of exclusive mutations were observed. Given the importance of PB1 in viral replication, it is probable that these mutations represent adaptive selection to accommodate host-specific differences in intracellular replication. The seal H3N8 genome was interrogated for any genetic features that might contribute to enhanced transmissibility and virulence in seals. Expression of a second peptide (PB1-F2) from segment 2 has been associated with an increase in pathogenicity by inducing apoptosis and increasing both inflammation and secondary bacterial pneumonia (9, 10). The seal H3N8 virus contains an intact open reading frame for the pathogenic version of this accessory protein, which includes a serine at amino acid position 66 (9). All five seals had evidence of apoptosis and secondary bacterial pneumonia. Glycosylation can also affect pathogenicity in influenza viruses (11-14). Six potential glycosylation sites were detected in the seal H3N8 HA, based on the sequence X_2X_1NX(S/T) X_1, at amino acid positions 24, 38, 54, 181, 301, and 499. None had features FIG 1 Hematoxylin and eosin staining of the lung at a_10 magnification. There is diffuse acute interstitial pneumonia and a mix of acute hemorrhagic alveolitis with necrotizing bronchitis. Multifocally, alveoli are either filled with hemorrhage and scant inflammatory cells or expanded with emphysema. There is irregularity to the bronchial mucosa due to necrosis, a mild to moderate edema, and mucous partially filling the bronchial lumen. There is mild to moderate expansion of the interlobular septa, with edema and hemorrhage. Anthony et al. 2 ® mbio.asm.org July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org suggestive of inactivity or reduced efficiency, as was previously demonstrated for H5N2 (12). Many H5N1 viruses have an additional glycosylation site at positions 158 to 160, and previous work demonstrated that the deletion of this site is critical for H5N1 viruses to bind to human-SA_2,6-like receptors and to transmit between mammals (15). This glycosylation site is missing in the seal H3N8 HA. In order to investigate the specificity of sialic acid binding, the seal virus was compared to avian H5 and swine H9, both of which bind to the sialyloligosaccharide SA_2,3 ligand in a structuralhomology model (Fig. 5). All structures confirmed the presence of a highly conserved serine at position 152 (corresponding to S136 by H3 numbering [16, 17]), which lies in a binding pocket, where its hydroxyl group contacts the axial carboxylate of sialic acid (17). While the seal virus contains the same conserved S152, it also harbors a neighboring G151E mutation (Table 1), which introduces a large residue capable of both donating and receiving hydrogen bonds with residues in close proximity to the ligandbinding pocket. Rotamer hydrogen bond analysis of the modeled seal structure indicates that HA’s altered conformation results in reduced hydrogen bonding between the conserved serine and SA_2,3 compared to that of H5 and H9 influenza viruses. Such changes in sialic acid binding play important roles in novel host adaptation (18). Mutations at positions 226 and 228 (H3 numbering) in the H3 HA can also affect receptor-binding preferences and can either completely abrogate (Q226L) or reduce (G228S) affinity for the avian-preferred SA_-2,3 interaction (18, 19). Seal H3N8 virus maintains the avian phenotype at positions 226 (Q) and 228 (G), which correlates with a continued ability to use SA_-2,3. Together, these findings suggest that the seal virus may still be able to use SA_2,3, but perhaps with less efficiency than in its original FIG 2 (A and B) Fluorescent in situ hybridization (ISH) of H3N8 virus-infected seal cells with DAPI counterstaining. A probe targeting the viral hemagglutinin demonstrates diffuse infection of the bronchial mucosal epithelium. ISH was also performed using probes for the matrix gene. Staining was identical to that shown here for HA. (C and D) Lectin staining to demonstrate the distribution of SA_-2,3 and SA_-2,6 in seal pulmonary parenchyma. The SA_-2,6 (green) was detected using fluorescein-labeled Sambucus nigra agglutinin (SNA) lectin, while SA_-2,3 (red) was detected using Maackia amurensis II (MAL II) lectin. Both infected and uninfected control tissues were stained, and the results were consistent for both. High levels of SA_-2,6 are observed on bronchiole and alveolar epithelial cells and on endothelial cells. The images in panels C and D were selected because they show staining for both sialic acids; however, the expression of SA_-2,3 was rarely observed (arrows) and limited to bronchiole luminal (C) and occasional alveolar (D) epithelia. (E and F) Costaining of SA_-2,6 and H3N8 HA. SA_-2,6 (green) is expressed on the respiratory epithelium of an intrapulmonary bronchus (E). H3N8 virus-infected cells (red) are present. A serial section was also stained for SA_-2,3, and none was detected. A high-magnification image of infected mucosa clearly shows H3N8 virus infection of cells expressing SA_-2,6 (arrows). All composite images are presented separately (single stains) in Fig. S1 to S3. Fatal Avian Influenza in New England Harbor Seals July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 ® mbio.asm.org 3 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org avian host. Given this, we investigated whether seal H3N8 may have adapted and acquired an additional or increased affinity for the SA_-2,6 receptors that are more prevalent in mammalian respiratory tissue (20-23). The pulmonary distribution of SA_-2,3 and SA_-2,6 influenza receptors was investigated using the receptor-specific lectins Sambucus nigra agglutinin (SNA) for SA_-2,6 and Maackia amurensis lectin II (MAL II) for SA_-2,3. SA_-2,6 was widely expressed in both infected and noninfected pulmonary parenchyma, with the highest concentration seen on endothelial cells, followed by alveolar/ bronchiole epithelia (Fig. 2 and see Fig. S2 in the supplemental material). SA_-2,3 was also observed, but less frequently, and was generally limited to the luminal surfaces of epithelial cells of the bronchioles. This broadly agrees with the expression of these SA saccharides in humans and pigs (20-23) and demonstrates that seals do express receptors that would allow avian viruses to initiate infection. This observation is supported by the H3N3 seal virus from the 1991 epizootic (4), which was shown to preferentially bind SA_-2,3 in vitro (19). However, the limited prevalence of SA_-2,3 in the lower lung suggests that the process of infection is inefficient and may help to explain why epizootics of avian influenza occur but are infrequent in harbor seals. Importantly, the rare expression of SA_-2,3 is insufficient to explain the diffuse infection seen throughout the pulmonary parenchyma (Fig. 2). In contrast, the wide distribution of SA_-2,6 is far more consistent with the level of infection observed. Costaining of infected lung with viral HA and SA_-2,3 or SA_-2,6 demonstrated clear infection of SA_-2,6-positive cells, in which no SA_-2,3 was seen (Fig. 2 and S3). Hemagglutination assays were also performed to confirm sialic acid binding preferences. Seal H3N8 isolates were first sequenced to confirm that passage in eggs had not altered the HA phenotype detected in the infected tissues, and the viruses were then tested for their ability to agglutinate erythrocytes that preferentially express SA_-2,3 (horse) or SA_-2,6 (guinea pig, pig) (24, 25), relative to several avian H3N8 viruses (Fig. 6). Average agglutination titers for seal H3N8 virus with horse erythrocytes (1:48) show that the virus can still bind to SA_-2,3. However, titers were appreciably higher with guinea pig (1:192) and pig (1:144) erythrocytes, demonstrating a preference for SA_-2,6. These findings show that seal H3N8 can use both avian and mammalian receptors and add to previous studies that have demonstrated changes in receptor preferences following a host switch event (26). The patterns of SA_- 2,3 and SA_-2,6 binding to seal H3N8 virus also agree with the patterns observed for H3 avian viruses adapting to humans (18). A further mutation was observed in HA, this time at position 110 (Table 1). In avian H3 viruses, phenylalanine (Phe/F) is consistently seen, while seal H3N8 uses Ser (F110S). The significance of this (if any) is currently unknown; however, previous work has suggested that this amino acid (position 110) is a critical component of the influenza fusion peptide (27), and given the essential role of fusion in viral replication and the host-specific differences that presumably exist in this process, the F110S substitution may well represent further adaption of this virus to mammalian replication. The ability of avian influenza viruses to adapt to SA_-2,6- mediated cell entry and replication is regarded as a significant driving force in the emergence of global pandemics (19, 28-30), especially for viruses with phenotypes that confer increased virulence. Such phenotypes are often, though not exclusively, dictated by mutations in segment 1 (PB2), which is an important determinant of host range for influenza viruses. Previous studies have experimentally demonstrated the effect of various PB2 substitutions on virulence and transmissibility in mammalian hosts (15, 31-38), including the modification of the aspartic acid (D) avian phenotype to an asparagine (N) mammalian phenotype at amino FIG 3 (A) Immunohistochemistry (IHC) of seal bronchus. Polyclonal antibodies were raised against H3N8 virus-specific HA antigen. Brown staining (DAB reporter system) indicates the presence of viral antigen. There is irregularity of the mucosal surface, with sloughed epithelium. IHC demonstrates the presence of viral antigen, pyknosis, and apoptosis (arrows). No viral antigen or apoptosis was seen on negative-control tissue. (Bi) ISH staining of H3N8 virus in lung epithelium (HA probe). (Bii) TUNEL staining (green) in the same region (serial section) of the lung, showing the presence of apoptotic cells. Comparison of virus and TUNEL staining shows localization of apoptosis to virally infected cells. (Biii) DAPI (with dihydrochloride) staining for cell nuclei. Anthony et al. 4 ® mbio.asm.org July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org acid 701 (15, 31, 32, 36, 39, 40). This D701N mutation has been experimentally introduced into an adapted version of the H7N7 seal influenza virus isolated in 1982 (1, 2) and was shown to increase the pathogenicity of the virus to mice (32). The seal H3N8 virus from the 2011 outbreak has naturally acquired this D701N substitution (Table 1), which was confirmed by clonal sequencing directly from infected tissue (50 clones/animal) to be the only phenotype present in all five animals. None of the previous outbreaks of influenza in seals showed this 701N phenotype, but it is consistently found in H3N8 viruses from horses and dogs, demonstrating further adaptation to replication in mammalian hosts. These observations raise significant concern about the virulence and transmission of this virus between mammals. Interestingly, analysis of HA sequences over the course of the outbreak show the introduction and maintenance of two nucleotide polymorphisms (Table 2), and while this is insufficient to convincingly demonstrate seal-to-seal transmission, it leads us to postulate that mammalian spread might already have occurred. Together, the adaptations observed in A/harbor seal/Massachusetts/ 1/11 suggest that it may be able to persist within the seal FIG 4 Phylogenetic trees of representative influenza H3N8 genome segments. Nucleotide sequence alignments for all genome segments were created using ClustalW, and trees were produced using neighbor-joining, maximum-likelihood, and Bayesian algorithms. Models of evolution were selected usingModelTest, and a tree was selected based on a consensus of the results of the three algorithms. Only the trees for HA and NA are shown; however, all eight segments showed strong association with sequences of avian origin. Trees are constructed with H3N8 viruses only, and published sequences were selected to represent variation in the year, host, and location of isolation. *, A/blue-winged teal/Ohio/926/2002; NY, New York; LA, Louisiana. Fatal Avian Influenza in New England Harbor Seals July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 ® mbio.asm.org 5 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org population and evolve into a new clade within the H3N8 group, as happened with the canine and equine viruses. An additional concern is the potential zoonotic threat that this virus poses, as it has already acquired mutations in both PB2 and HA that are often, though perhaps not exclusively, regarded as prerequisites for pandemic spread (19-23, 28, 30, 37) and it is uncertain how any persistence of the virus in mammals may continue to alter its phenotype. A comparison of A/harbor seal/Massachusetts/1/11 with human H3N2 viruses revealed three substitutions that are already common to both seal H3N8 and human H3N2 viruses. These are NA-W399R, PB2-I382V, and PA-S184N (Table 1). In all cases, these substitutions are shared by the seal H3N8 and human H3N2 viruses but are not found in influenza viruses isolated previously from seals, in avian, equine, or canine H3N8 viruses, or in either seasonal or pandemic H1N1 viruses. Further studies will be required to establish the functional significance of these substitutions; however, the natural epizootic emergence at this time of a pathogenic virus that can transmit between mammals, found in a species that can become infected with multiple influenza virus subtypes, must be considered a significant threat to both wildlife and public health. MATERIALS AND METHODS Extractions, PCR, and sequencing. RNA was extracted from all tissues using Trizol reagent, and cDNA was synthesized using Superscript III (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. PCR for the detection of influenza A virus was performed using primers FLUAV-MU44 (GTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG) and FLUAV-M-L287 (GCA TTTTGGACAAAGCGTCTACG), to produce a 243-bp product of seg ment 7 (coding for matrix protein). For full-genome sequencing, fulllength cDNAs were amplified for all eight influenza segments. Primers were designed to target terminal sequences for each segment, based on alignments of avian, canine, and equine H3N8 sequences from the Influ enza Research Database (http://www.fludb.org). All PCRs were performed using fast-cycling chemistry (Qiagen), according to the manufac- TABLE 1 List of amino acid substitutions between seal H3N8 and avian H3N8 virusesa Segment (protein) nt position aa position Amino acid substitution Seal H3N8 (2011) Avian H3N8 Seal H7N7 (1980) Seal H4N5 (1982) Seal H3N3 (1992) Equine H3N8 Canine H3N8 Human H3N2 Human H1N1 (seasonal) Human H1N1 (pandemic) 1 (PB2) 178 60 N D D D D D D D D D 441 147 M I I I I V V I I T 1127 376 R K K K K K K K K K 1144 382 V I I I I I I V I I 2101 701 N D D D D N N D D D 2 (PB1) 522 174 I M M M M M M M M M 925 309 G W W W W W W W W W 1075 359 G S S S S S S S S S 1126 376 V I I I I I I I I I 1130 377 G D D D D D D D D D 1392 464 E D D D D D D D D D 3 (PA) 253 85 A T T T T T T T T I 551 184 N S S S S S S N S S 794 265 L P P T P P P P P P 4 (HA) 242 81 (65) K T G D T T T T S N 323 108 (92) S N E T N S N K N S 329 110 (94) S F S V F F F Y E D 452 151 (135) E G A K G R R T V V 527 176 (160) V A A A A S S K L S 713 238 (222) L W Q W W W L R K K 778 260 (244) M V T V V M M L I T 802 268 (252) V I I I I V V I I V 859 287 (271) N D D A D D D D N D 1114 372 K Q Q Q Q Q Q Q Q Q 1247 416 L S T E S S S S N N 5 (NP) 187 63 V I I I I I I I I I 383 128 G D D D D D D D D D 886 296 H Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1336 446 G R R R R R R R K R 6 (NA) 440 147 E V I None I V I V V I 849 283 D E N None D E E Y T S 937 313 R G Q None G G G S G G 958 320 S P L None H P P V F F 1186 396 D N N None N N D R I I 1195 399 R W W None W W W R W W 1295 432 A E A None N E E E R K 8 (NS1/NS2) 263 88 H R R R R R R R R R a A total of 40 amino acid substitutions were observed in a comparison of seal H3N8 virus with avian H3N8 virus. Sequences of other seal influenza viruses, canine and equine H3N8 viruses, and selected human influenza viruses were included for comparison. Amino acid positions presented in parentheses represent corresponding H3 numbering. None, no sequence available for comparison; nt, nucleotide; aa, amino acid. Anthony et al. 6 ® mbio.asm.org July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org turer’s instructions. Amplified products were cloned into the pGEM T-easy vector (Promega) and sent for commercial sequencing. Virus isolation and intravenous pathogenicity index test. Homogenates from PCR-positive tissues were inoculated into SPF embryonated chicken eggs, and virus growth was determined by PCR. Tissue homogenates were also used to infect the Vero andMDCKcell lines in the presence of trypsin. Virus isolates were sent to the National Veterinary Services Laboratory (Ames, IA), where the chicken intravenous pathogenicity index test was performed according to the OIE manual (41). Molecular pathology. Fluorescent in situ hybridization (FISH) was performed using the Quantigene ViewRNA ISH tissue assay (Affymetrix), according to the manufacturer’s instructions. FISH conditions were optimized to include a 10-min boiling and 20-min protease treatment. Oligonucleotide probes were designed commercially by Affymetrix using sequences of HA and M (accession numbers JQ433879 and JQ433882, respectively). Immunohistochemistry (IHC) was performed by pretreating deparaffinized tissue sections with a 1:10 dilution of antigen retrieval solution (DAKO) for 20 min in a steamer. Samples were then washed three times in distilled water (dH2O), incubated in 3% hydrogen peroxide (in phosphate-buffered saline [PBS]) for 10 min, washed again twice in dH2O and once in PBS, and then blocked (10% normal goat serum, 0.1% bovine serum albumin [BSA]) for 20 min. Sections were treated with HA polyclonal H3N8 antibody (Novus Biologicals; catalogue number NBP1- 46796) at a 1:250 dilution for 2 h at room temperature. Following three washes in PBS, sections were incubated in Signal Stain Boost IHC reagent (Cell Signaling; catalogue number 8112) for 30 min at room temperature. Sections were again washed three times in PBS, stained with 3,3- diaminobenzidine (DAB; Dako), and counterstained with hematoxylin. TUNEL staining was performed using the in situ cell death detection kit and fluorescein (Roche) with deparaffinization and protease treatment as described for the FISH protocol. Simultaneous detection of SA_-2,3 and SA_-2,6 glycans. Deparaffinized tissue sections (5 _M) were blocked with 1_Carbo-Free solution (Vector Laboratories; catalogue number SP-5040) for 1 h at room tem- FIG 5 Structural-homology model showing the interaction of influenza HA with the SA_2,3 ligand. Seal H3 (gray), avian H5 (orange) (Protein Data Bank [PDB] accession number 1JSO), and swine H9 (pink) (PDB accession number 1JSH) were compared. The mutation G151E causes a conformational shift and interrupts H bonding between seal H3 S152 and SA_2,3, which suggests a reduction in SA_2,3 binding efficiency. A lost H bond in seal H3 is depicted in green. Fatal Avian Influenza in New England Harbor Seals July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 ® mbio.asm.org 7 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org perature. Sections were then stained for SA_-2,6 using fluorescein SNA (Vector Laboratories; catalogue number FL-1301) at 10_g/ml for 30 min at room temperature, and rinsed twice for 3 min each time in PBS. Sections were then reblocked in 1_ Carbo-Free solution for 30 min, before being stained for SA_-2,3 with 10 _g/ml of biotinylated MAL II (Vector Laboratories; catalogue number B-1265) for 30 min at room temperature. The MAL II was poured off, and Texas Red streptavidin (Vector Laboratories; catalogue number SA-5006) was laid over the sections at 10 _g/ml for a further 30 min. Sections were rinsed twice for 3 min each time in PBS and mounted with Vectashield hard-set mounting solution with DAPI (4=,6-diamidine-2-phenylindole) counterstaining. Hemagglutination assays. Hemagglutination assays were performed according to the WHO diagnostic manual (42). Briefly, red blood cells (RBCs) from rooster chicken, guinea pig, horse, and pig were obtained from Lampire Biological Laboratories (Ottsville, PA). The RBCs were washed in PBS and resuspended to 0.5% (chicken) or 0.75% (guinea pig and pig). Equine RBCs were resuspended to 1% in PBS with 0.5% BSA (43). Viruses were diluted to 64 HA units using chicken red blood cells. Serial dilutions were then made, added to equal volumes of washed RBCs of each species, and incubated in U-bottom plates, with the exception of chicken RBCs, which were incubated in V-bottom plates. Reaction mixtures were incubated at room temperature for 1 h, with the exception of those with chicken RBCs, which were incubated for 30 min. The HA titer endpoint is the reciprocal of the highest dilution which causes complete hemagglutination. The seal H3N8 virus was compared with several avian H3N8 isolates, including A/common eider/Massachusetts/20507-001/ 2007 (H3N8), A/northern pintail/Oregon/44249-547/2006 (H3N8), A/mallard/Washington/44338-052/2007 (H3N8), A/blue-winged teal/ Kansas/44440-003/2008 (H3N8), A/American black duck/Maine/44411- 174/2008 (H3N8), and A/American black duck/Maine/44411-532/2008 (H3N8). An H5N2 virus was also included: A/turkey/Minnesota/3689- 1551/1981 (H5N2) virus. Sequence analysis. Nucleotide sequences were aligned using ClustalW. Phylogenetic trees were constructed using neighbor-joining, maximum-likelihood, and Bayesian algorithms. Models of evolution were selected using ModelTest, and a representative tree was selected based on FIG 6 Hemagglutination assays were performed on an isolate of the H3N8 seal virus (A/harbor seal/New Hampshire/179629/2011) to confirm sialic acid binding preferences. Viruses were tested for their ability to agglutinate erythrocytes that preferentially express SA_-2,3 (horse) or SA_-2,6 (guinea pig, pig). Average agglutination titers for seal H3N8 with horse erythrocytes (1:48) show that the virus can still bind to SA_-2,3, though weakly. Titers were appreciably higher with guinea pig (1:192) and pig (1:144) erythrocytes, demonstrating a preference for SA_-2,6. Given that horse erythrocytes express SA_-2,3, it is interesting that the avian H3N8 viruses did not agglutinate with horse RBCs (red blood cells) efficiently, even following repeated attempts. Ito et al. (25) showed that avian H3N8 viruses from Asia in the early 1980s could bind to horse RBCs, while Wiriyarat et al. (43) gave examples of avian viruses (albeit not H3 viruses) that did not bind to horse RBCs. It is not known whether the avian viruses included here simply have a preference for the N-acetyl (NeuAc) sialic acid species, which is not found on horse RBCs, while the seal virus uses N-glycolyl (NeuGc) SA_-2,3. Ck, chicken; GP, guinea pig; Eq, equine; Sw, swine; 179629 Seal H3N8, A/harbor seal/New Hampshire/179629/2011; 53968 COEI H3N8, A/common eider/Massachusetts/20507-001/2007 (H3N8) virus; 16232 NOPI OR 06 H3N8, A/northern pintail/Oregon/44249-547/2006 (H3N8) virus; 52290 MALLWA07 H3N8, A/mallard/Washington/44338-052/2007 (H3N8) virus; 93866BWTEKS 08 H3N8, A/blue-winged teal/Kansas/44440-003/2008 (H3N8) virus; 96016ABDUMA07 H3N8, A/American black duck/Maine/44411-174/2008 (H3N8) virus; 96647 ABDUMEH3N8, A/American black duck/Maine/44411-532/2008 (H3N8) virus; TurkeyMnH5N2, A/turkey/Minnesota/3689-1551/1981 (H5N2) virus. TABLE 2 Sequence analysis of the HA genes isolated from various tissuesa Animal Sample Date Nucleotide at position: 1347 1499 278-Pv Kidney 28 Sept 2011 C C 286-Pv Trachea 29 Sept 2011 C C Mes LN C C Kidney C C 295-Pv Mes LN 3 Oct 2011 C C Lung C C Tonsil T C Kidney T A Tonsil 3 Oct 2011 T A Trachea T A Cerv LN T A a Two polymorphisms were observed in HA at positions 1347 and 1499, relative to avian H3N8 sequence CY041887. Isolates from animals earlier in the outbreak showed C at position 1347 and C at position 1499. The variations C1347T and C1499A were observed in animal 295-Pv, in addition to the wild-type sequence. Animal 294-Pv showed only the variant genotype. Anthony et al. 8 ® mbio.asm.org July/August 2012 Volume 3 Issue 4 e00166-12 Downloaded from mbio.asm.org on August 6, 2012 - Published by mbio.asm.org a consensus of the results of the three algorithms. Published H3N8 sequences included in the analyses were selected to represent the diversity of year, host, and location of isolation. Structural modeling. To create a homology model of the seal 2012 outbreak HA sequence, 10 template models were selected based on their super-secondary structures, with use of the LOMETS meta-threading approach (44, 45). Continuous fragments excised from these templates were then reassembled into full-length models by replica exchange Monte Carlo simulations (44). Ab initio modeling of threaded unaligned regions was then used to complete the structure. Low free-energy states were subsequently identified through clustering of simulation decoys by the SPICKER near-native model selection algorithm (46). Chimera was utilized for structural analysis and visualization (47). Hydrogen bonding analysis was based on geometric criteria established through survey of small-molecule crystal systems and Dunbrack rotamer libraries (48, 49). Nucleotide sequence accession numbers. The sequences of all eight influenza genome segments were submitted to GenBank and assigned accession numbers JQ433879 to JQ433882. SUPPLEMENTAL MATERIAL Supplemental material for this article may be found at http://mbio.asm.org /lookup/suppl/doi:10.1128/mBio.00166-12/-/DCSupplemental. Figure S1, JPG file, 0.1 MB. Figure S2, JPG file, 0.2 MB. Figure S3, JPG file, 0.2 MB. ACKNOWLEDGMENTS We acknowledge funding from the NIH: AI57158 (NBC-Lipkin), LM010140, and CA121852; NIH/NSF TW005769; USAID PREDICT; and DTRA. We thank Nicole Arrigo for editing and Wendy Barclay and Jennifer Howard for comments on the manuscript. We thank Johnice Miller for technical assistance. REFERENCES 1. Geraci JR, et al. 1982. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus. Science 215:1129 –1131. 2. Webster RG, et al. 1981. Characterization of an influenza A virus from seals. Virology 113:712–724. 3. Hinshaw VS, et al. 1984. 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VIRUS INFLUENZA, TEMIDO Y CAMBIANTE 1986

El virus influenza, temido y cambiante ( Publicado en Revista Creces, Agosto 1986 ) Son los receptores de las células respiratorias los que interactúan con la superficie externa del virus y le abren las puertas para que este llegue hasta apoderarse de la maquinaria metabólica de la célula infectada. Lo impredecible es la forma como cambia la superficie externa del virus, lo que ha dificultado hacer una vacuna que ofrezca protección eficiente y duradera. Los españoles solían llamarle "garrotazo", y lo cierto es que la influenza, y más concretamente el virus que la provoca, representa una seria amenaza para la humanidad. Durante el transcurso del siglo pasado el virus influenza causó varias epidemias en la población mundial, siendo la más devastadora la que dejó un saldo de 20 millones de muertos en 1918. A pesar de las frecuentes vacunas que se aprueban y salen al mercado en todos los países, hoy resulta imposible evitar que pueda volver a ocurrir algo como lo de 1918. El problema tiene también consecuencias económicas porque las ausencias laborales debido a cuadros de influenza dejan saldo de millones de dólares en pérdidas cada año, perjudicando la economía de cualquier país. Y la foca estornudó El virus causa epidemias, no tan sólo en el Hombre sino también en diversas especies de vertebrados entre las cuales se encuentran aves, focas, cerdos, caballos y primates. Se han reportado casos que parecen indicar la factibilidad de contagio de una especie a otra. Es decir virus de cualquiera de estas especies podría intercambiarse en la naturaleza y generar enfermedad. Un ejemplo que merece mención lo constituye un suceso acontecido en Islandia hace algunos años. Mientras un científico y su asistente examinaban una foca infectada por el virus influenza, una mala maniobra indujo el estornudo de la foca. Todo fue a dar en la cara del tecnólogo, quien sabia que el virus había causado la muerte de cientos de focas en ese lugar. Este contagio natural podría representar una seria amenaza para su salud. Afortunadamente, 48 horas después se produjo un cuadro de conjuntivitis, se aisló el virus a partir del ojo del asistente y no hubo mayor trascendencia con respecto a la enfermedad. Transmisiones de virus similares a éstas pueden ocurrir, representando un peligro potencial para la humanidad. El virus influenza infecta principalmente células del aparato respiratorio porque éstas presentan en su membrana estructuras específicas denominadas receptores, los cuales interactúan con la superficie externa viral (figura 1A). Luego de establecido el contacto virus-célula, el virus influenza penetra al citoplasma celular y se apodera de la maquinaria metabólica de la célula infectada. Como consecuencia se producen innumerables partículas virales y la lenta destrucción celular. Nuevos virus infectan células vecinas y se va comprometiendo el tejido pulmonar. Esta necrosis en desarrollo puede producir desde síntomas de resfrío común hasta el cuadro clínico fatal que todos conocemos como influenza. Defensa El sistema inmune de defensa humano actúa mediante el reconocimiento de las proteínas superficiales del virus. La estructura de la capa externa del virus influenza puede visualizarse como una membrana dinámica y polimórfica de la cual emergen 2 tipos de glicoproteínas: la hemaglutinina y la neuraminidasa (figura 2). La hemaglutinina es la más abundante y la encargada de establecer contacto con los receptores de las células a infectar. Al igual que toda proteína, ambas son codificadas por secuencias específicas de RNA (ácido ribonucleico). El genoma (conjunto de genes de los cromosomas), en el virus influenza está compuesto por ocho segmentos discretos de RNA, cada uno de los cuales originará al menos una proteína viral. Una característica singular del proceso de replicación de todos aquellos virus cuyo genoma es RNA, es su alta frecuencia de mutación. (Replicación es el proceso según el cual una molécula origina otra idéntica a la preexistencia). No existe un mecanismo de corrección para la incorporación de nucleótidos (los productos de la ruptura del ácido nucleico), efectuada por polimerasas que copian RNA. Este fenómeno mutacional genera innumerables alteraciones en el genoma viral y, por ende, proteínas diferentes a las del virus del que derivan. Tales mutaciones que afecten los genes involucrados en la producción de hemaglutinina y neuraminidasa pueden inducir cambios en estas glicoproteínas por lo que la superficie externa de virus ya no será la misma. Alteraciones peligrosas Dos tipos de cambios es posible advertir a este respecto: Mutaciones menores y mutaciones mayores. Estas últimas llamadas también reasociaciones genéticas, (Figura 2). Las mutaciones menores se deben al cambio de un nucleótido en el gen viral, lo que genera un cambio específico de un aminoácido en la glicoproteína superficial. Este fenómeno origina una superficie viral muy similar a la del virus nativo sin mutación. La relevación de la presencia de este nuevo agente infeccioso en la población no es trascendental. Individuos infectados por el virus nativo, ya sea mediante vacunación o por contagio natural, no serán afectados seriamente por este nuevo agente causal. La acumulación de mutaciones menores puede derivar en un cambio mayor. En este caso, las diversas alteraciones experimentadas por la hemaglutinina viral la transforman en un antígeno considerablemente distinto al original. El virus portador de esta glicoproteína mutante, nueva en la población, puede causar estragos a nivel mundial. Otro tipo de mutación mayor (la reasociación genética), se produce mediante intercambio de genes entre dos virus diferentes. Algo así como si en el ejemplo del tecnólogo y la foca, el tecnólogo también hubiera estado con influenza. Podría producirse infección de una sola célula, en cualquiera de los dos, por ambos tipos de virus. Como resultado se originaría progenie viral con características que son una mezcla entre aquellas de los virus participantes. En este caso el virus mutante podría diferir considerablemente con respecto a la partícula original. Un virus influenza humano con una membrana externa de un virus de foca podría representar un serio peligro de infección a nivel mundial. Este virus mutante podría replicarse en humanos, y la hemaglutinina, derivada de la foca, representaría un antígeno nuevo contra el cual no habría inmunidad protectora en el Hombre. En resumen, la superficie externa del virus influenza está cambiando frecuentemente. Los cambios, pueden ser sutiles o drásticos dependiendo del tipo de mutación. Cualquiera sea el tipo de cambio, éstos tienden a acumularse en ciertos sitios específicos de la hemaglutinina viral (figura 3). Por último, esta alta frecuencia mutacional dificulta el desarrollo de una efectiva vacuna antiinfluenza, considerado aún como el mejor método preventivo de una enfermedad viral. Vacunas virales Una vacuna viral es un virus que ha sido atenuado o inactivado en su virulencia. El individuo vacunado será expuesto a una dosis pequeña de antígeno inmunizante, la cual inducirá protección en lugar de causar enfermedad. Las vacunas contra la influenza en uso en la actualidad son hechas de virus inactivados. Su producción comienza con el aislamiento de la última cepa infectante, a partir de secreciones nasales de individuos con influenza. El virus se hace crecer en grandes cantidades en huevos embrionados de gallina para finalmente someterlo a tratamiento de inactivación con agentes químicos como cloformo o ácidos. Esta vacuna inducirá protección de corta duración y sólo contra virus muy semejantes en su superficie externa. Otro tipo de vacuna antiinfluenza es la por virus atenuados. Consiste en hacer crecer al virus artificialmente, a temperaturas más bajas que lo habitual. De este modo se selecciona un virus mutante que es resistente al frío, incapaz de replicarse eficazmente a la temperatura fisiológica normal. Se le combina en el laboratorio con el último virus influenza aislado de la población y el resultado de esta asociación será un virus que presenta las glicoproteínas superficiales del agente que está, produciendo enfermedad, pero que es incapaz de replicarse con eficacia a 37°C, la temperatura corporal. El virus se replicará en el organismo sólo lo suficiente para inducir protección. Una aproximación más en boga al respecto son los denominados péptidos sintéticos, pequeñas cadenas de aminoácidos que representan segmentos de una proteína completa. Las proteínas muestran estructuras conformacionales complejas, producto de su secuencia de aminoácidos. Se ha postulado que aquellos segmentos de una proteína que están expuestos al medio ambiente representan los péptidos que el organismo reconocerá como antígenos. Todos estos péptidos tienen la capacidad potencial de estimular una respuesta inmune, muchas veces efectiva contra la proteína completa. En el caso del virus influenza, se conoce en detalle la secuencia y la estructura de la hemaglutinina, proteína crucial en la interacción del virus con la célula blanco. El problema reside en la identificación de aquellos péptidos que inducirán la neutralización de la partícula viral completa. En el virus influenza, debido a los cambios mencionados, esto no es fácil. Sin embargo, estudios al respecto parecen indicar la existencia de un péptido neutralizante, común para varios virus influenza de distinto origen. Si esto fuera cierto, el péptido podría producirse a muy bajo costo mediante el uso de un sintetizador automático. La vacunación con este péptido sintético induciría protección eficiente y duradera. Finalmente, los últimos intentos consideran la producción de virus con mutaciones en aquellos genes que codifican la polimerasa viral, enzima encargada de la replicación del genoma. Algo similar a lo que se está haciendo para combatir el SIDA.

CRUCE DE LA CORDILLERA DE LOS ANDES POR ESTUDIANTES DE MEDICINA VETERINARIA. Febrero de 1954

El 1 de febrero de 1954 se inició el cruce de la Cordillera de Los Andes que hiceron estudiantes de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile liderados por el Decano Dr Hugo K. Sievers. El regreso de este raid ecuestre Santiago - Mendoza - Santiago fue el 25 de febrero. La idea fue del aventurero Dr Sievers. Motivó a sus estudiantes a cruzar la Cordillera de Los Andes a caballo, recordando las andanzas del patriota Manuel Rodríguez. En cierto modo el viaje constituiría una suerte de viaje de estudios. El Dr Sievers coordinó el viaje con el Ejército de Chile de tal manera que oficiales experimentados acompañaran a la delegación de estudiantes. El teniente Jaime Deichler estuvo a cargo de la expedición. Luego de una adecuada preparación ecuestre el grupo partió desde Antonio Varas donde estaba el Regimiento de Caballería, pasando por la mina Disputada, por Los Cobres hasta Río Blanco por el interior de la cordillera.

Durante el trayecto el grupo de estudiantes, militares y arrieros, pernoctaron en regimientos chilenos y argentinos. La caravana regresó por la calle Independencia, alcanzando el centro de Santiago, cuyo destino final era el Palacio de Gobierno. Luego de rendir un homenaje al Monumento de Bernardo O"Higgins el presidente Carlos Ibáñez del Campo los recibió junto a Ministros de Estado y el Embajador de la República Argentina. La prensa chilena elogió el acontecimiento ecuestre enfatizando la presencia femenina en el grupo. El grupo de estudiantes protagonistas de esta hazaña estaba constituido por: Paulina Martínez, Marta Escudero, Ketty Arias, Anelio Aguayo, Eduardo Fuenzalida, Hugo Unda Sergio Basulto, Farouk Allay, Sócrates Leporati, René Cobarrubias, Rubén Danovaro, Gregorio Gatica, Alejandro Cerda, Carlos Gaete, Ismael Soto, Ronald Walker, Añejandro Cáceres, Mario Carreño, Mario Castro, Arnoldo Köhler y Boris Jorquera, y por el líder indiscutido Huko K Sievers.

A casi 60 años de esta epopeya cabe señalar el asombro que causa al entrever las dificultades técnicas propias de la época que los estudiantes de Medicina Veterinaria lograron superar! Fuente informativa: La epopeya de Los Andes Revista LECTUS Vol II Nº 4, 69 -75 En la revista de veterinaria ZOOIATRIA se encuentra lo siguiente: Raid ecuestre Santiago . Mendoza - Santiago (Año III Nº 12, 25 - 30, 1954) escrito por Jaime Dreichler Guzmán. Y en las páginas siguientes: Distinción al General Abdón Parra y premio a los participantes del raid ecuestre.

BOSÓN DE HIGGS

¿Qué es el bosón de Higgs? Es la última pieza perdida del Modelo Estándar de la física, teoría que describe las piezas básicas que componen el universo. Las primeras 11 partículas que predecía el modelo fueron encontradas, y descubrir el bosón de Higgs validaría al modelo. Si el bosón, por el contrario, no existe, entonces hay que pensar en otra teoría que explique cómo está armado el universo. Los científicos piensan que después del Big Bang, el Universo era una “sopa” gigante de partículas que viajaban a la velocidad de la luz, y que no tenían masa. ¿Cómo llegaron a ganar masa para formar la materia que conocemos hoy, como los planetas y estrellas? La explicación fue propuesta en 1964 por seis físicos, entre ellos el británico Peter Higgs. La idea es que existe un campo de energía invisible llamado el “campo de Higgs” que cubre todo el universo. Algunas partículas, como los fotones (que componen la luz), no se ven afectadas por este campo, y por eso no tienen masa y pueden viajar tan rápido. Otras partículas, en cambio, sí se ven afectadas y se frenan con el campo de Higgs, ganando masa. Según ejemplifica el científico del CERN, John Ellis, es como si hubiera un manto de nieve en todo el universo, “como si estuvieras en medio de Siberia. Ahora imagina que tratas de cruzar este campo de nieve. Quizás eres un esquiador, y te deslizas por encima. Eso es como una partícula que no interactúa con el campo de Higgs, no se hunde en la nieve, va muy rápido. Es como una partícula sin masa que viaja a la velocidad de la luz”. “Quizás estás usando zapatos de nieve, en cuyo caso te hundes en el campo de Higgs, tienes menos velocidad que la del esquiador, menos de la velocidad de la luz, es como una partícula con masa. Porque estás interactuando con ese campo de nieve de Higgs. Y por último si sólo tienes tus botas, entonces te hundes mucho en la nieve, y vas muy muy lento. Y eso es como una partícula con mucha masa”, explica. El bosón de Higgs es la partícula que posibilita el mecanismo por el cual las demás partículas como quarks y electrones ganan su masa. ¿Se puede encontrar el bosón de Higgs? Si, eso es lo que ha estado intentando hacer el CERN con el Gran Colisionador de Hadrones (LHC), una máquina gigante enterrada bajo la frontera de Francia y Suiza que hace chocar protones, intentando reproducir (en miniatura) lo que había después del Big Bang. El problema es que el bosón se desintegra rápidamente después de ser creado, lo que impide que los científicos lo vean directamente. En lugar de eso lo que hacen es buscar las partículas que deja como residuos al desintegrarse, por lo que el trabajo consiste en recopilar muchos, muchos datos para intentar probar la existencia del bosón de Higgs. También hay que separar las señales del Higgs de los demás elementos producidos en el proceso en que chocan los protones. ¿Qué es el Modelo Estándar? Es, hasta el momento, la mejor explicación que los científicos han encontrado sobre cómo se componen las piezas que forman el universo. Describe a 12 partículas fundamentales, gobernadas por cuatro fuerzas básicas. Sin embargo, el Modelo Estándar no explica todo, y hay cosas como la “materia oscura” y la “energía oscura” que no entendemos y que podrían formar nada menos que el 96% de lo que existe en el universo. Sin embargo, confirmar el Modelo Estándar, o modificarlo, sería un paso más para comprender cómo funciona nuestro mundo y acercarnos quizás a una teoría que pueda explicar también la energía oscura, la materia oscura y la gravedad, que tampoco es explicada por este modelo. Si encontraron el bosón de Higgs, ¿se acaba el trabajo del LHC? No. Todavía hay muchas cosas que explicar, como mencionábamos recién, y el LHC puede ayudar a investigarlas. Es posible que partículas de materia oscura aparezcan en este experimento, entre otras cosas. ¿Por qué le dicen “la partícula de Dios”? El nombre viene de un libro escrito por el físico Leon Lederman, llamado “La partícula de Dios: Si el Universo es la respuesta, ¿cuál es la pregunta?”, que habla de la historia de la física de partículas. Lederman afirmó haberle dado el nombre de la “partícula de Dios” al bosón porque “es tan central para la física hoy, tan crucial para entender la estructura de la materia, sin embargo tan esquiva”. Agregó después sin embargo que le puso así porque el editor “no nos dejó ponerle la partícula maldita (goddamn), aunque eso podría ser más apropiado, dada su naturaleza villana y los costos que está causando”. Muchos científicos están en contra del nombre, porque si bien ha contribuido a darle importancia al tema, sobredimensiona la importancia del bosón, que como hemos visto, no responde todas las interrogantes sobre el origen del universo. Links: - CERN experiments observe particle consistent with long-sought Higgs boson (CERN) - El bosón de Higgs en 9 claves (Publico) - Higgs fever: Your guide to the most wanted particle (New Scientist) - The Higgs particle – what it is and what it does (Vancouver Sun)

HISTORIA DEL Clostridium botulinum Walter Ledermann 2003

Historia del Clostridium botulinum Walter Ledermann D.* Rev Chil Infect Edición aniversario 2003: 39 - 41 The History of Clostridium botulinum La historia de este bacilo se inicia oficialmente en 1820, con las investigaciones realizadas por Justinus Kerner (1786-1862), en el reino de Würtenburg, sobre los envenenamientos producidos por salsas con carne, conocidos como botulismo (de botulus, salsa) 1. Suele afirmarse con ligereza que este investigador no era un científico, sino un poeta y místico, pero ya que no figura en las más rigurosas historias de la literatura ni en las mejores enciclopedias, debemos estimarlo como poeta “menor”, a diferencia de su contemporáneo Theodor Kerner, gran vate militar, famoso por su Lira y espada2. El destino, burlón, conservó el nombre de nuestro poeta en la “enfermedad de Kerner”, como se llamó al botulismo, y no ligado a poema alguno digno de recordarse. En realidad Justinus era médico y alcanzó bastante fama en su profesión, en el curso de la cual tuvo, paradojalmente, una relación con la gran poesía cuando sólo era estudiante de medicina al cuidar al famoso escritor romántico Johann Christian Friedrich Hölderlin (1770-1843). Recordemos que Hölderlin, “a quien Apolo sonriera”, luego de alcanzar la cúspide de su genio a la edad de 37 años, se hundió en una tranquila locura3, en la que permaneció 36 años en una torre de Tubinga4, al cuidado del ebanista Ernest Zimmer, escribiendo aún versos notables bajo el seudónimo de Scardanelli: según una teoría, no estaba loco y sólo “dejó de hablar al mundo porque no tenía ganas de hablar y no porque fuera incapaz de hacerlo”...¡ Ojalá muchos políticos siguieran su ejemplo ! En el hospital o clinicum de la Universidad de Tubinga, Suabia, había sólo 6 camas, de las cuales dos estaban dedicadas a pacientes psiquiátricos; en una de ellas era Holderlin atendido por el profesor Autenrieth, secundado por el alumno Justinus Kerner...5 ¿Cómo diablos, luego de conocer al divino Hölderlin en 1808, pudo el joven Justinus derivar hacia las salsas envenenadas en 1920? Como dijera el mismo Hölderlin: Diversas son las líneas de la vida cual sendas y límites de montañas. Tanto en Würtenburg como en el gran ducado de Baden eran frecuentes las intoxicaciones por el veneno de los embutidos o alantiasis, cuya alta mortalidad impactó a Kerner y también a Paulus, quien prosiguió las investigaciones en 1834. Entre 1793 y 1827 se registraron en Würtemberg 234 casos; y 400 hasta 1853, con 150 fallecidos6. Müller publicó en 1869 y 1870 extensas monografías sobre el tema7,8, aprovechando el gusto de los alemanes por los embutidos y las salsas de carne, que le suministraban abundante casuística. A lo largo del siglo pasado el interés se fue centrando cada vez más en los embutidos, y hasta el mismo Virchow, que abominaba de las bacterias9, las buscó infructuosamente en estos alimentos. Van den Corput6 postuló que el agente causal era un hongo, que denominó Sarcina botulina, el cual aparentemente sólo existió en su imaginación, pues nadie pudo cultivarlo. Bien pronto se observó que el veneno se encontraba en el centro de los embutidos, con mayor probabilidad cuanto más gruesos fueran éstos; que no se desarrollaba en presencia de oxígeno; que los embutidos no mostraban signos de putrefacción y que muchas veces eran frescos, recién preparados. Se pensó en ptomaínas, sustancias encontradas en cadáveres exhumados, así como en una serie de compuestos químicos, como ácidos prúsico, pícrico y grasos, o bases orgánicas volátiles. Hasta llegó a hablarse de un ácido botulínico... Sin embargo, el hecho más claro es que ninguna de estas sustancias podía reproducir en animales de laboratorio la característica parálisis del botulismo. Entre 1895 y 1897, los microbiólogos belga Emile Pierre van Ermengem, de Ghent, y alemán Wilhelm Kempner, de Berlín, pondrían término a la incertidumbre, al demostrar que el botulismo era causado por la toxina de un bacilo anaerobio. Todo comenzó en diciembre de 1895, en la villa de Ellezelles, Hainault, Bélgica, donde concurrió una sociedad musical invitada para tocar una elegía funeraria. Después de la ceremonia fúnebre, la orquesta fue invitada a servirse una colación fría, donde el plato fuerte era un típico jamón salado. Este cerdo, narra el historiador William Bulloch10, había sido sacrificado cuatro meses antes, en agosto, “y en su estado fresco había sido parcialmente comido with impunity” El remanente quedó en salmuera hasta el día del mencionado funeral. Enfermaron 34 personas, incluyendo a todos los músicos, cuyos síntomas se presentaron entre las 24 y 36 horas siguientes a la ingestión e incluyeron estrabismo, diplopia, ptosis palpebral, afonía y disfagia. Tres intoxicados fallecieron, lo que arroja una letalidad cercana al diez por ciento. De los restos del jamón, así como del bazo de una de las víctimas aisló van Ermengem esporas de un bacilo anaerobio, que denominó Bacillus botulinus. Además, utilizando un filtrado del cultivo, libre de bacilos y de esporas, pudo reproducir en animales de laboratorio signos de parálisis, demostrando la existencia de una toxina. Trabajando con la cepa del belga, Kempner logró 40 producir en cabras una antitoxina neutralizante. A mayor abundamiento, la etiología del botulismo pudo ser rápidamente confirmada por Römer durante un pequeño brote en Hesse, en 190011; y por Landmann y Gaffky10, cuatro años después, al investigar en Darmstadt una epidemia provocada por la ingestión de porotitos en conserva. Este último brote fue muy significativo, pues era la primera vez que se involucraban alimentos vegetales en el botulismo. Digamos, de paso, que también el primer brote documentado de botulismo en Chile, en la década de los setentas, fue provocado por porotitos en conserva, preparados para consumo interno por religiosas de una colectividad española. Las monjitas reían inocentemente porque veían doble, pero luego parálisis severas siguieron a la diplopia, y varias de las afectadas, de edad avanzada, fallecieron. Restos de los porotos fueron analizados, comprobándose la presencia de toxina bolutínica por el Instituto de Salud Pública, que recién había montado la técnica para su detección. Sucesivos estudios a nivel mundial demostraron que el C. botulinum era capaz de producir 7 toxinas antigénicamente distintas, designadas con letras A, B, C, D, E, F, G, en tanto que otras especies del mismo género, como C. barati y C. butyrum podían también producir intoxicaciones, al poseer toxinas similares a las F y E, respectivamente12. Todas estas toxinas actúan en la sinapsis periférica, en la placa motora, bloqueando la acetilcolina, con lo que generan parálisis muscular. La toxina A, la más frecuente y mejor estudiada, es termolábil, bastando calentar los alimentos a 80º C por un minuto para destruirla. El interés por estudiar la toxina recrudeció a raíz de dos hechos: primero, la aparición de casos de botulismo en lactantes por la ingestión de miel, y segundo, su posible uso terapéutico. En 1976 describió Picket13 los primeros casos de botulismo infantil, aunque Arnon, que ha estudiado el problema a fondo, piensa que en 1931 ya se habían presentado otros, no debidamente diagnosticados14. La hipótesis es que el bacilo esporula, las esporas son llevadas por el viento hasta los panales e infectan la miel. Engullida ésta, las esporas van al colon, germinan y liberan la toxina, que por vía hemática va a fijarse en las sinapsis. Experiencias en ratones demostraron que la microflora normal impide la colonización aunque la miel contenga hasta un millón de esporas, cifra que cae a diez si se trata de ratones criados cell-free15. Arnon logró reunir una casuística de 26 lactantes, menores de un año, que enfermaron entre los 14 y los 351 días de vida, porque sus torpes padres les dieron a comer miel conteniendo entre diez y cien esporas16. Considerando que la toxina botulínica es el veneno más potente conocido, con una dosis letal 50 de 1 mg/kg peso corporal, los efectos fueron desastrosos. Algunos niños tuvieron muerte súbita17. Más interesante y más productivo es el asunto del uso terapéutico. En 1885 ya Claude Bernard había dicho que “los venenos pueden emplearse tanto para destruir vidas como para el tratamiento de los enfermos”18; en 1968 los norteamericanos Allan Scott y Edward Schantz le tomaron la palabra e iniciaron los estudios de las bondades curativas de la toxina botulínica19. La historia comenzó en 1943, durante la Segunda Guerra Mundial, cuando los servicios de inteligencia británicos informaron que los alemanes estaba estudiando bombardear toxinas sobre Gran Bretaña, usando como “vectores” las célebres bombas V-1. La Academia Nacional de Ciencias de EE.UU., a través de los profesores Fred y Baldwin y bajo los auspicios del ejército, montó un laboratorio en Camp Detrick (luego Fort Detrick) para investigar el problema de la guerra tóxica y proponer soluciones defensivas. Allí pudo Carl Lamanna obtener la toxina botulínica tipo A en su forma más pura y cristalina, con una fracción tóxica de 150.000 dalton, unida a otra fracción no-tóxica de 750.000 dalton que la protegía de la digestión enzimática en el intestino17. Los alemanes nunca llegaron a bombardear esporas o toxinas sobre Londres, pero los estudios de Fort Detrick no fueron inútiles y tuvieron una aplicación pacífica a partir de 1970, con un intento para controlar el estrabismo rebelde. En 1972, Estados Unidos fue una de las naciones firmantes de la Convención de Armas Biológicas y Toxinas, que ponía término a la investigación en este campo, de modo que el presidente Nixon ordenó cerrar Fort Dixon para estos fines. Schantz se fue a la U. de Wisconsin y su investigación con la toxina botulínica se centró en su posible utilidad terapéutica y así pudo proporcionar a Scott la preparación que, con permiso de la FDA, éste inoculó a voluntarios humanos que sufrían de estrabismo, previo ensayos en monos rhesus20. Pronto las indicaciones se extendieron al blefarospasmo, ciertas formas de tortícolis y otros desórdenes musculares. En 1989 la FDA aprobó la toxina como orphan drug, siempre que proviniera del único lote certificado, uno de 200 mg fabricado en 1979 con la cepa Hall, capaz de generar diez millones de DL 50 para el ratón en 24 horas, en un medio muy simple. Las dosis terapéuticas se expresan en nanogramos, de los que 10 pueden curar una tortícolis ( si hay trastornos de la deglución, bajar la dosis) . Gracias a la toxina botulínica, artistas que sufrían de distonías musculares han vuelto a tocar el piano y el violín, y de esta manera el Clostridium botulinum, que diezmara la banda musical de Ellezeles en 1895, ha podido casi un siglo después pagar su deuda con el arte. No conozco ningún verso de Justinus Kerner que pudiera cerrar la historia de este bacilo, tan relacionada con la poesía y la locura, la música y la carne, la miel y la guerra, de modo que he de recurrir a su célebre paciente Hölderlin en la torre de Tubinga: Su vida escoge el hombre, su objetivo, gana, libre de error, sabiduría, pensamientos y así contempla la verdad y el más alto sentido y las más singulares preguntas Humildemente, Scardanelli (1841) Historia del Clostridium botulinum - W. Ledermann D. 41 P.S. Was bleibet aber, siften es die Dichter (“Pero lo que permanece, lo fundan los poetas”. Y esto último lo escribió, mis estimados científicos, cuando aún no estaba loco) Bibliografía 1.- Schaffner W. Clostridium botulinum. En: Mandell, Douglas & Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. Mandell GL, Bennett JE and Dolin R, editors. 3rd. edit., Churchill Livingstone, NY 1990, pp: 1847-50. 2.- De Riquer M, Valverde J M. El romanticismo alemán. En: Historia de la Literatura Universal, 7a. edic., Planeta S.A , Barcelona 1968; 3: 30-43. 3.- Peters Uwe Henrik. Hölderlin: el más famoso esquizofrénico alemán. El Mercurio 1997; 21 Diciembre: E 10-2. 4.- Bruns F. Hölderlin, Johann Christian Friedrich. En: Collier’s Encyclopedia. Crowell Collier and MacMillan Inc ,USA 1967; 12: 191-2. 5.- Hesse H. En el pabellón de Pressel. En : Libro de fábulas, Obras completas, Aguilar S.A. Ediciones, Madrid 1961; vol II: 1178-203. 6.- Eulenburg A. Botulismo. En : Diccionario Enciclopédico de Medicina y Cirugía prácticas, Agustín Jubera editor, Madrid 1886; t II: 113-9. 7.- Müller H. Botulus. Deuts Klin 1869; 22: 321-9. 8.- Müller H. Uber botulus. Deuts Klin 1870; 23: 27-36. 9.- Vaccarezza RF. Vida y obra de Robert Koch. En : Koch R. La etiología de la tuberculosis y otros trabajos. Editorial Universitaria, Buenos Aires 1965; p: 22. 10.- Bulloch W. History. En: Medical Research Council. A System of Bacteriology in Relation to Medicine, His Majesty’s Stationery Office, London 1929; vol III, chapter XI: 373-4. 11.- Römer P. C. botulinum in Hesse. Zblt Bakt 1900; I- 27: 857-67. 12.- Hatheway C L. Clostridium botulinum. En: Gorbach S L, Bartlett J G, Blacklow N R. Infectious Diseases. WB Saunders Co. Phi. 1992; 1583-7. 13.- Pickett J, Berg B, Chaplin E et al. Syndrom of botulism in infancy: clinical and electrophysiologic study. N Engl J Med 1976; 295: 770-2. 14.- Arnon S S, Werner S B, Faber H K et al. Infant botulism in 1931: discovered of a misclassified case. Am J Dis Child 1979; 133: 580-2. 15.- Arnon S S, Midura T F, Clay S A et al. Infant botulism : Epidemiological, clinical and laboratory aspects. JAMA 1977; 237: 1946-51. 16.- Arnon S S, Midura T F, Damus K et al. Honey and other environmental risk factors for infant botulism. J Pediatr 1979; 94: 331-5. 17.- Sonnabend O A R, Sonnabend W F F, Krech U et al. Continuous microbiological and pathological study of 70 sudden and unexpected infant deaths: Toxigenic intestinal Clostridium botulinum infection in 9 cases of sudden infant death syndrome. Lancet 1985; 1: 237-40. 18.- Bernard C. An introduction to the study of experimental medicine, 1st edition, Mac Millan, N.York 1927. 19.- Schantz E J, Johnson E A. Botulinum toxin: the story of its development for the treatment of human disease. Persp Biol Med 1997; 40 (4): 317-27. 20.- Schantz E J, Johnson E A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol Rev 1992; 56: 80-99.

ESTRATEGIA MUNDIAL PARA EL CONTROL DE LA FIEBRE AFTOSA

La FAO y la OIE presentan una estrategia mundial para el control de la fiebre aftosa El objetivo final es alcanzar la condición de libre de la enfermedad La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) han unido sus fuerzas para luchar contra la fiebre aftosa y han presentado una estrategia conjunta para controlarla. Ambas organizaciones han subrayado que la estrategia solamente será posible si existe un compromiso sólido de los socios mundiales. Presidiendo hoy la sesión de apertura de la conferencia mundial FAO/OIE en Bangkok, el viceprimer ministro tailandés Chumpol Silpa-archa aseguró que "Tailandia está trabajando para erradicar la FA en 2015 en una zona piloto al este del país, así como a nivel regional de la Asociación de Naciones del Sudeste Asiático (ASEAN) en 2020". La FAO está haciendo hincapié en la necesidad de una acción colectiva para mejorar el control de la FA allá donde suponga una pesada carga para millones de agricultores, pastores y operadores comerciales ya que los "recientes brotes de FA en todo el mundo demuestran que las enfermedades animales no tienen fronteras, pueden tener un impacto devastador y requieren una respuesta global", según señaló Hiroyuki Konuma, representante regional de la FAO para Asia y el Pacífico. La fiebre aftosa no constituye una amenaza directa para la salud humana. Sin embargo, la pérdida de oportunidades comerciales para los países afectados es una carga económica mundial y un obstáculo para el desarrollo humano. Más importante resulta que, para los campesinos más pobres, que a menudo dependen únicamente de unos pocos animales, la fiebre aftosa significa hambre y ruina económica, cortando su única fuente de ingresos y proteína de la carne y la leche. Más de 100 países asisten a la reunión FAO OIE en Bangkok. Estrategia mundial "Uno de los principales objetivos de la Estrategia Mundial es permitir el control de la FA en todo el mundo a través del fortalecimiento de los servicios veterinarios encargados del control de las enfermedades animales", explicó Bernard Vallat, Director General de la OIE. "Los beneficios de la estrategia irán mucho más allá del control de la FA, ya que representa una oportunidad para iniciar medidas a largo plazo que mejorarán la capacidad de los servicios veterinarios para luchar contra otras enfermedades ganaderas de elevado impacto. A nivel regional el programa de la campaña contra la fiebre aftosa en China y el Sudeste Asiático (SEACFMD, por sus siglas en inglés) gestionado por la OIE Bangkok está considerado como un modelo muy eficiente ", añadió. "La exitosa erradicación de la peste bovina, un esfuerzo conjunto de científicos, gobiernos, donantes, veterinarios y agricultores, demuestra claramente que la amenaza de las principales enfermedades se puede reducir e incluso eliminar", aseguró Juan Lubroth, Jefe del Servicio Veterinario de la FAO. "Podríamos aplicar -añadió- las enseñanzas aprendidas y los enfoques adecuados a la fiebre aftosa: mejor vigilancia, coordinación y control para reducir los brotes de FA y finalmente eliminar el virus, y para garantizar la seguridad alimentaria, la sanidad animal y la salud humana". La Estrategia Mundial combina dos herramientas desarrolladas por la FAO y la OIE. La herramienta de la OIE, llamada Evaluación de las Prestaciones de los Servicios Veterinarios (PVS, por sus siglas en inglés), evalúa los servicios veterinarios nacionales con el objetivo del cumplimiento de las normas de calidad de la OIE. Unos servicios veterinarios fiables garantizan la calidad y seguridad de la producción ganadera. A su vez, unos sistemas veterinarios sólidos protegen la seguridad de las fuentes alimentarias, el comercio y la sanidad animal, y como tal, son un bien público mundial. La FAO desarrolló la senda progresiva de control para la fiebre aftosa, la PCP-FMD (por sus siglas en inglés), que guía a los países a través de una serie de pasos graduales para gestionar mejor los riesgos de la FA, empezando por la vigilancia activa para determinar qué tipos de cepas del virus de la FA están circulando en el país y las zonas colindantes. El proceso lleva continuamente a los países a mejorar los niveles de control de la FA y, por tanto, a una eventual apertura al comercio y los mercados internacionales. Un pilar fundamental de la PCP-FA conlleva coordinar los esfuerzos con los países de la misma región para controlar la enfermedad de forma sistemática a través de las permeables fronteras nacionales. El objetivo de la Estrategia Global de la FA es reducir el impacto de la FA en todo el mundo, disminuyendo el número de brotes de enfermedades en los países infectados hasta que en última instancia se alcance la condición de libre de fiebre aftosa, y manteniendo ese estado oficial en aquellos países que ya estén libres de la enfermedad. Muchos países se encuentran en las primeras etapas de control de la FA y la PCP-FMD compara el progreso con el objetivo de solicitar eventualmente a la OIE el reconocimiento oficial de sus programas nacionales de control y de su condición de libre de fiebre aftosa, con o sin vacunación. La Estrategia Mundial de la FA ha sido desarrollada por la FAO y la OIE en el contexto de su Marco mundial para el control progresivo de las enfermedades transfronterizas de los animales (GF-TAD, por sus siglas en inglés), en colaboración con expertos, países y donantes seleccionados, así como con organizaciones regionales e internacionales. Se hace especial hincapié en las regiones del mundo donde la enfermedad es endémica, incluyendo la mayor parte del África subsahariana, Oriente Medio y Asia. La estrategia contribuye significativamente a la reducción de la pobreza mediante el aumento de las oportunidades comerciales y la contribución y protección de los ingresos diarios de los mil millones de agricultores pobres en todo el mundo que dependen de la ganadería. Pérdidas billonarias Aunque en raras ocasiones la FA es mortal, la enfermedad puede provocar elevada mortalidad en animales jóvenes y recién nacidos, pérdida de peso, reducción de la producción de leche y menor fertilidad. El coste anual mundial de la FA en términos de pérdidas de producción y necesidades de prevención mediante vacunación se ha estimado en aproximadamente 5 000 millones de dólares EEUU. En un grave brote en 2001 en el Reino Unido, se estima que el impacto directos e indirectos tuvieron un coste 30 000 millones de dólares. Los brotes anteriores supusieron gastos similares: en 1997 una gran epidemia en la provincia china de Taiwán costó a la economía 15 000 millones de dólares, mientras que Italia sufrió en 1993 unas pérdidas económicas de 130 000 millones de dólares EEUU.

LA VUELTA DEL ANTRAX Eduardo Labarca

La vuelta del ántrax Eduardo Labarca Con la llegada a nuestro Ministerio de Relaciones de una encomienda cargada real o supuestamente de ántrax, los chilenos del siglo XXI estamos redescubriendo una plaga que nuestro país ha conocido y sufrido desde antaño y la humanidad desde siempre. Cuando yo acababa de cumplir ocho años, en el pueblito del Sur donde nací estalló la noticia de que la oveja del mapuche Lorenzo Manquilef tenía la picada. Alertado de urgencia, el campero del fundo vecino llegó a caballo con un fusil y un tambor de bencina resuelto a atajar el contagio del carbunclo, sin esperar al veterinario que pasaba una vez al mes ni al practicante –médico no teníamos– que venía todos los viernes. La oveja yacía en un barranco con una llaga en el lomo en la que los jotes hundían sus picos y el único afán del animal moribundo era proteger a su cachorro de los gallinazos. Yo quise llevarme al huachito para criarlo, pero el campero no estaba para bromas: la primera bala, disparada desde veinte metros de distancia, fue para la madre y la segunda para la cría. La fogata que envolvió los cuerpos fue alimentada con combustible a lo largo de tres días. Ninguna institución pública indemnizó a Manquilef por su pérdida. Con la llegada del siglo XXI el bacilo, manipulado por un psicópata estadounidense, volvió a escapar de su escondrijo para terror de los humanos y esta vez llega supuestamente a Chile y no es Jehová quien nos lo envía. En 1929 Luis Durand había publicado su cuento La picada, sobre la muerte del toro Solimán víctima de una epidemia de carbunclo. El campesino Pedro Andaur descuera al toro con su cuchillo y sin revelar que el animal fue víctima de la picada le vende la piel a don Polidoro. Con el dinero se va de juerga, pero en medio de la borrachera comienza a asfixiarse. Andaur muere junto al río acompañado por su perro Calluza que le lame las pústulas: –¡La picá ha de ser! ¡Tengo la picá! –se lamenta agónico. Una de las plagas que en tiempos de Moisés envió Jehová al Faraón cuando tenía prisionero al pueblo de Israel fue la del ántrax: “…y hubo sarpullido que produjo úlceras tanto en los hombres como en las bestias… en los hechiceros y en todos los egipcios” (Éxodo 8, 8-9). La epidemia recurrente que llagaba a los animales y condenaba a una muerte horrible a los pastores fue registrada desde la antigüedad por Homero, los padres de la medicina Hipócrates y Galeno, los poetas Ovidio, Virgilio… El terrible flagelo contagiado por las esporas de la bacteria Bacillus anthracis azotó los territorios de Asia Menor y la Península Arábiga, cruzó varias veces Europa y pasó a América con los conquistadores, siendo conocido como carbunclo o carbunco en castellano, maladie du charbon en francés, anthrax en inglés y sólo pudo ser contenido gracias a una vacuna desarrollada por el propio Pasteur. Desde entonces la vacuna veterinaria contra el carbunclo es de rigor en las explotaciones ganaderas de Chile y el mundo. Hasta el estallido del actual conflicto en Afganistán, la Cruz Roja Internacional mantenía en ese país un laboratorio que producía vacunas contra el carbunclo para las ovejas y cabras de los pastores locales. Gracias a una lucha iniciada hace varios milenios, en el siglo XX la humanidad había logrado por fin tener a raya al Bacillus anthracis. Pero los aprendices de brujos no dormían y concibieron el proyecto diabólico de utilizarlo como arma. Con la llegada del siglo XXI el bacilo, manipulado por un psicópata estadounidense, volvió a escapar de su escondrijo para terror de los humanos y esta vez llega supuestamente a Chile y no es Jehová quien nos lo envía