sábado, 19 de mayo de 2018

PRINCIPIOS DE VIROLOGÍA APLICADOS A LA MEDICINA VETERINARIA. I. Patricio Berríos E. 2018

PRINCIPIOS DE VIROLOGÍA VETERINARIA


Dr. Patricio Berríos Etchegaray
Médico Veterinario  Ph.D
Profesor titular Universidad de Chile
2018

 "Los virus y las enfermedades virales han jugado un rol importante en la infectología humana y animal" Junto a las bacterias son viejos conocidos de la humanidad. Han estado con nosotros desde tiempos inmemoriales y al parecer no hay indicios que nos quieran dejar. La historia de los virus y sus enfermedades es fascinante, siendo intrigante su origen y evolución. En este relato, junto a la historia de los virus se mencionan a los principales hombres de ciencia que han contribuido a su conocimiento. No es posible dejar de reconocer uno de los grandes logros de la virología que se refiere a la erradicación de dos enfermedades virales  la viruela en humanos, y la  peste bovina en la medicina veterinaria contemporánea. En Chile se han erradicado junto a la fiebre aftosa, la peste porcina clásica, anemia infecciosa equina, enfermedad de Newcastle. Logros nacionales que prestigian a los organismos agropecuarios del país. 




1.  INTRODUCCIÓN
Históricamente fue Cornelius Aulus Celsius, 50 años d.C.,  el primero en emplear el término virus al referirse a la rabia como una enfermedad causada por un virus. Sin embargo, es el holandés Martinus W. Beijerinck quien, en 1898, acuñó el término virus al referirse  a un extraño y desconcertante agente infeccioso relacionado con la etiología del mosaico del tabaco,  al que llamó “contagium vivum fluidum”, “líquido vivo contagioso o “virus”, el que por su tamaño y otras características biológicas evidentemente no era una bacteria.


La palabra "virus" proviene del latín y significa veneno. Es una palabra  neutra que no tiene plural.


Los virus afectan tanto a organismos pluricelulares como a unicelulares y se han detectado en animales, vegetales y protistas. Estas entidades biológicas se encuentran en mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces; invertebrados; protozoos, bacterias, hongos, algas y  mycoplasmas. Es lícito entonces aceptar que los virus son capaces de infectar a cualquier célula viva.


El grado de parasitismo de los virus es absoluto. Para multiplicarse deben forzosamente introducir su ácido nucleico en el interior de una célula. El parasitismo se ejerce a nivel genético, dentro de la célula; es allí donde el genoma viral expresa su  capacidad informacional que le permitirá, en último término, la síntesis de sus propias macromoléculas, replicando una nueva progenie viral mediante autoensamblaje de sus componentes. La replicación viral puede inducir algún tipo de efecto citopático, el que producirá a su vez un cierto daño al órgano o tejido al que pertenezcan las células infectadas. Los virus como buenos parásitos tienden a coevolucionar con su hospedero.  


Según algunos autores los virus no carecen totalmente de vida aunque tampoco están funcionalmente vivos. De hecho esperan a ser activados lo que ocurre al entrar a una célula.


Los virus siempre han sido reconocidos por sus efectos, es decir  por las enfermedades que producen tanto en animales como en vegetales. Algunos virus no producen daño visible y pasan desapercibidos; incluso pueden replicarse en alguna especie animal sin causar una patología determinada, pero al romper la barrera interespecies son capaces de inducir  enfermedad en la nueva especie que ha sido afectada. Tal sería el caso del virus del sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) originario de los chimpancés africanos y que posteriormente habría pasado al ser humano con las desastrosas consecuencias por todos conocidas.


Otro grupo  de virus, denominados oncogénicos, al integrar su genoma con el genoma celular y portar oncogenes, serán capaz de transformar a las células en tal grado que éstas se dividirán desordenadamente y sin freno produciendo cáncer.


Las enfermedades virales de los animales superiores no tienen tratamiento. Sólo existen escasos fármacos antivirales que puedan ser usados con éxito. La prevención, a través de la aplicación sistemática y oportuna de vacunas antivirales, junto a medidas generales de higiene, es la única arma eficiente para impedir la diseminación de los virus patógenos en una población de animales susceptibles.


Según Lederberg (1988), la mayor amenaza individual para el dominio continuado del ser humano sobre el planeta son los virus, que nos afectan directamente o indirectamente al actuar sobre los animales, vegetales y bacterias, nuestros compañeros de ruta  por años.


1. 1.  Antecedentes  históricos


Los virus probablemente han coexistido con los animales superiores desde siempre, no hay razones valederas para pensar en lo contrario. Al menos las enfermedades causadas por ellos han sido detectadas desde hace mucho tiempo. En  Egipto, cuna de la civilización, se ha encontrado un bajorrelieve que data de la XVIII dinastía egipcia, aproximadamente 1.500 años a.C., que representa a un individuo aparentemente recuperado de poliomielitis paralítica. Esta enfermedad  mataba sin piedad a los afectados que se asfixiaban por parálisis respiratoria o dejaba graves secuelas en quienes sobrevivían.


Por otra parte, existen evidencias de que la viruela humana, causada por un poxvirus, había afectado desde muy antiguo a los egipcios al encontrarse pústulas secas de viruela en la cara momificada de Ramses V. La viruela era una enfermedad común en India y China entre los años 300 y 200 años a.C. Sin embargo, fue el médico persa Rhazes, quien vivió entre los años 860 y 932 d.C., el que primero describió una enfermedad viral en humanos al hacer  referencias gráficas de los síntomas de la viruela y el sarampión.


No deja de llamar la atención que fuera Aristóteles, 400 años a.C., quien describiera la rabia furiosa canina, estableciendo que la enfermedad se transmitía a  animales sanos por la mordedura de un animal enfermo, concepto epidemiológico bastante adelantado para su época.


Las enfermedades virales de los vegetales también han sido conocidas desde mucho tiempo atrás, así en 1576, el mosaico del tulipán (Tulipa gesneriana), enfermedad que afecta a las flores de este vegetal, se extendió violentamente desde Turquía al continente europeo, causando un serio daño al floreciente comercio del tulipán. Situación tan grave en aquella época como la ocurrida recientemente en el Reino Unido con la encefalopatía espongiforme o “enfermedad de las vacas locas”.  En el siglo XVII los bulbos del tulipán, infectados probablemente por un virus, produjeron una nueva variedad de flores con colores muy llamativos, lo que creó en Holanda una verdadera tulipomanía, con graves consecuencias económicas para el estado.


En 1850 se describe la poliedrosis del gusano de seda,  enfermedad que también tuvo repercusiones económicas en su época, añadiendo a los efectos sociales que causaba un factor incentivante de su estudio y prevención.


El conocimiento sistemático de los virus, como entidades infecciosas patógenas, se inició en 1876 cuando el alemán Adolf  Mayer, un químico agrícola,  demostró el carácter infeccioso de la enfermedad conocida como “mosaico del tabaco” (Nicotiana tabacum), al transmitir la enfermedad  a hojas de plantas sanas, mediante escarificaciones con material proveniente de una hoja afectada con el mosaico.


El botánico ruso Dmitrii Ivanovsky dio un paso adelante, cuando el 12 de febrero de 1892 informó a la Academia Imperial de Ciencias de San Peterburgo en Rusia,  que los macerados de hojas con el mosaico del tabaco mantenían su infecciosidad luego de ser filtrados por bujías Chamberland. Estos antiguos filtros retenían el paso de las bacterias y dejaban pasar a los pequeñísimos virus.  ¡Los virus eran filtrables!


En 1898, Martinus W. Beijerinck, considerado como el padre de la virología, al repetir las experiencias de Ivanovsky descubrió que los filtrados eran capaces de difundir en gel de agar  en vez de permanecer sobre el gel como lo hacían las bacterias, además de precipitar con alcohol. Este precipitado mantenido a 40º C retenía su capacidad infecciosa,  la que sólo se destruía por ebullición o tratamiento con formalina.


En el mismo año los investigadores alemanes Freidrich Löeffler y Paul Frosch establecieron el carácter infeccioso de los filtrados de linfa contenida en las aftas de bovinos que padecían de fiebre aftosa. Este hallazgo sugería un  tamaño pequeño para el agente etiológico, tal vez una toxina bacteriana presente en la linfa vesicular. Sin embargo, considerando que luego de sucesivas infecciones en seis animales diferentes la linfa mantenía su carácter infeccioso, se pensó en un agente replicante. Estos científicos observaron que otras enfermedades como la viruela, el sarampión y el “rinderpest” o peste bovina eran causadas por agentes semejantes al de la fiebre aftosa, los que  fueron denominados genéricamente como virus filtrables.


En 1915 y 1917,  los bacteriólogos  F. W. Twort y Felix d’Herelle encontraron, independientemente, virus que infectaban a las bacterias, actualmente denominados virus bacterianos, bacteriófagos  o simplemente fagos.


En 1958, Bergold describió la existencia de virus en insectos. Los virus de los hongos fueron reconocidos en 1962, los de las algas verde-azules en 1964, y los virus de  mycoplasmas y protozoos en 1972.


El médico inglés Edward Jenner,  modificó la variolización usada  en China en el siglo XV para combatir la viruela, utilizando pústulas de vacas con viruela bovina o cow-pox, método denominado vacunación. Jenner  publicó en 1798 “Estudios sobre las causas y acciones de la Variolae vacciniae”, estableciendo que las personas que habían sufrido de viruela o que eran inoculadas con virus viruela bovina quedaban protegidas contra la viruela humana.


El descubrimiento de la naturaleza química del VMT tuvo un tremendo impacto en las ciencias biológicas y médicas, siendo el significado biológico del VMT significativamente mayor que su importancia como patógeno vegetal, de manera que muchos científicos se sintieron estimulados a estudiar la exacta naturaleza de los virus a nivel físico y químico.  La oportunidad de trabajar con preparaciones virales purificadas, el uso del microscopio electrónico iniciado en 1940 y el desarrollo de sofisticadas ultracentrífugas, influyeron notablemente en el avance del conocimiento de los virus en cuanto a su tamaño, forma y propiedades químicas y biológicas.


En 1930 el inglés William Elford construyó  filtros de membrana de colodión de diferentes rangos de diámetro de poros y estimó el tamaño de varios virus,   aproximadamente 10 nanómetros para el virus aftoso, estableciendo además que los virus son entidades que presentan un tamaño definido entre 25 y 300 nanómetros.


Uno de los descubrimientos más importantes de la virología moderna, referente a la transmisibilidad de la leucosis aviar, fue publicado en 1908 por V. Ellerman y  O. Bang; sin embargo, este hallazgo fue  considerado como una curiosidad y relegado al olvido durante más de 40 años cuando recién se reconoció su importancia en medicina y virología.


El estudio de las interacciones entre bacteriófagos (serie T1) y células bacterianas   (Escherichia coli) sirvió como modelo para conocer los procesos de infección con otros tipos de virus  animales o vegetales, lográndose avances de gran importancia en el desarrollo de la biología molecular. Estos nuevos conocimientos incluyen, entre otros,  el descubrimiento que el ácido desorribonucleico (ADN) constituye el material genético en algunos bacteriófagos y que este ácido nucleico se podía integrar en el ADN celular (lisogenia), aceptándose además que los genes celulares podían ser transportados de una célula  a otra por virus.


El éxito conseguido por el “Phage Group”, creado por Max Delbruck en USA, inspiró a los investigadores en virología animal a desarrollar técnicas para multiplicar células en cultivos “in vitro”.  Previamente algunos virus animales fueron replicados en huevos embrionados de gallina, siendo el virus influenza cultivado exitosamente en el embrión de pollo por F. M. Burnet.     


El hecho de que los virus influenza aglutinen eritrocitos de pollo en proporción a la concentración del virus y que el grado de aglutinación puede ser medido por un simple densitómetro, permitió a G. K. Hirst desarrollar un seguro método de cuantificación viral.


En 1956, Spiegelman logró obtener la síntesis de ARN del bacteriófago Q-β, incubando parte del ácido ribonucleico (ARN) del virus con una enzima, Q-β replicasa, produciendo nuevas moléculas de ARN que tenían la misma capacidad de infección que el ARN viral. Consecuentemente la infección de Escherichia coli con el ARN sintetizado inducía a las bacterias a producir partículas virales completas. Posteriormente, un grupo de investigadores de la Universidad de Stanford logró obtener la síntesis de ADN del bacteriofago X-174  el que resultó biológicamente idéntico al ADN viral.


Otros importantes hitos históricos de la virología  han sido: el desarrollo de los cultivos de células “in vitro” por Alexis Carrel  (1910), el establecimiento de una línea celular inmortal por Williams Earle (1940) y la multiplicación del virus de la poliomielitis humana en cultivos celulares de embrión humano (Enders, 1940); el descubrimiento de la transcriptasa reversa por David Baltimore y H. M. Temin; la caracterización de los oncogenes por J. M. Bishop y  R. A. Weinberg, y en forma contemporánea el aislamiento del virus del SIDA por los grupos de Robert Gallo (USA) y Luc Montagnier del Instituto Pasteur (Francia). En 1979, dos años después de conocerse el último caso de viruela humana en el mundo, la OMS declara que la enfermedad ha sido erradicada.


En  cuanto  a inmunoprofilaxis,  en medicina veterinaria,  cabe destacar que  en  la década del 40, O. Waldmann y colaboradores desarrollaron la primera vacuna realmente efectiva contra la fiebre aftosa, conocida con el nombre de vacuna de Vallée-Schmidt-Waldmann. La lucha sistemática contra las virosis humanas se inicia en 1955 cuando se aplica  la vacuna contra la poliomielitis desarrollada por Jonas Salk y que contiene virus inactivado. En 1957, Albert Sabin desarrolló una vacuna oral contra la poliomielitis preparada con virus vivo modificado lo que constituyó otro gran avance en la inmunoprofilaxis antiviral.


Con respecto a los virus causantes de enfermedades emergentes como el SIDA y las fiebres hemorrágicas, es oportuno precisar que estos virus no son  nuevos, no son muchos y no todos producen muerte en el ser humano. Muchos de ellos han existido desde hace tiempo y han reaparecido debido a que afectan a ciertos hospederos como los roedores en el caso del virus Hanta, causándoles una enfermedad crónica inaparente, lo que les permite coexistir con ellos. El hombre se infecta al aumentar las posibilidades de contacto con algunos ratones como el Apodemus agrarius reservorio del virus Hanta. Esta interacción estaría dada fundamentalmente por alteraciones en el medio ambiente que favorecen el aumento del número de  ratones.


Los virus de la influenza son un buen ejemplo de los cambios que sufren los virus en su antigenicidad y virulencia causando desastrosas epidemias en el hombre y en animales. En 1983 el serotipo H5 N2 produjo una elevada mortalidad en pollos que alcanzó más de un 80% lo que significó un costo aproximado a los 60 millones de dólares a la industria avícola norteamericana. La diferencia entre las cepas virulentas y las más benignas se ubica en siete nucleótidos los que determinan cambios en cuatro aminoácidos de la hemoaglutinina (HA) viral y el consiguiente aumento de la virulencia del virus influenza aviar. En 1987, en Hong Kong, se detectaron casos de influenza en pollos causados por el serotipo H5 N1  lo que obligó a las autoridades a sacrificar millones de aves. En este brote se presentaron casos humanos con varias muertes causadas por el virus aviar.


1. 2.  Definición de virus


No ha sido fácil definir a los virus. Generalmente las definiciones de virus no son más que descripciones de sus principales características. Conceptualmente, en cualquier intento de definición hay que considerar sus singularidades como son la infecciosidad viral, su capacidad de existir en un estado no celular y el obligado parasitismo que exhiben a nivel genético.


En 1933, Wendell M. Stanley empezó a estudiar la naturaleza química de los virus, encontrando que el virus del mosaico del tabaco (VMT) era destruido por el tratamiento con  pepsina en un determinado pH. Este investigador dedujo que los virus estaban constituidos exclusivamente por proteínas. Posteriormente, mediante repetidas precipitaciones con sulfato de amonio saturado 0,5 obtuvo paracristales en forma de aguja,  los que mantenían su infecciosidad a altas diluciones y luego de sucesivas recristalizaciones. Con estos resultados, Stanley concluyó que “el VMT era una proteína autocatalítica que requería la presencia de células vivas para su multiplicación”.


Tres años después Bawden, Pirie et al,  descubrieron que el VMT contenía ácido ribonucleico además de las proteínas, determinándo que  los virus eran realmente nucleoproteínas.


Lwoff definió  a los virus como “entidades estrictamente intracelulares y potencialmente patógenas, con una fase infecciosa, que poseen un solo tipo de ácido nucleico, se multiplican  a partir de su material genético, están desprovistos de sistemas enzimáticos para producir energía, y no son capaces de crecer ni de reproducirse por división binaria”.


Luria y Darnell en 1967 definen a los virus como “entidades cuyo genoma es ácido desoxirribonucleico  o ácido ribonucleico, que se reproducen dentro de células vivas usando la maquinaria metabólica celular para dirigir la síntesis de partículas especializadas, conformando el virión que contiene el genoma viral y que será,  en último término, transferido de una célula a otra”. Esta definición funcional se basa en el obligado parasitismo intracelular de los virus en un nivel genético.


S. Harrison describe a la partícula viral como “estructuras que transfieren ácido nucleico de una célula a otra”. Para muchos autores modernos, los virus “son paquetes de ácidos nucleicos envueltos por proteínas que los protegen y les permiten ingresar específicamente a una célula”.


Según Peter y Jane Medawar los virus son genes  envueltos en proteínas que alteran las actividades normales de una célula. Los virus serían programas genéticos que llevan un mensaje muy simple de una célula a otra, que dice: “¡reprodúceme!”. En otras palabras los virus serían genes con capacidad de movimiento que atacan a las células para reproducirse en ellas y luego abandonarlas para penetrar en otras.


De acuerdo con van Regenmortel (1990) una especie viral es definida como una clase de variadas características que constituyen un linaje replicante que ocupa un nicho ecológico particular.  Virus del mismo tipo poseen exactamente el mismo tamaño y forma.


Una especie viral es una población compleja de entidades afines, que actúa como un todo y se autoperpetúa.  Según M. Eigen la substitución de especie por "cuasiespecie" no es un mero cambio semántico sino que se refiere al comportamiento de los virus, lo que ayuda a responder preguntas tales como ¿Cuándo empezó a evolucionar un virus determinado? ¿De dónde proceden los virus? Pareciera ser que los actuales virus tuvieron un origen celular o tal vez descienden de programas genéticos de sus hospedadores. Si aceptamos que la selección evolutiva es consecuencia de la capacidad que tiene un genoma de autorreplicarse, en los virus un aspecto vital es su información genética que implica capacidad de autoconservación, a través de mutaciones y adaptación a un medio ambiente en continuo cambio.


Los virus han sido considerados como genes de vida libre o fragmentos de ADN extraviados. En 1957, Roberto Donoso B. profesor de Biología en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile sostenía que los virus eran genes aberrantes.


Cualquiera sea la fineza de la definición de virus, hay que consignar que ellos presentan básicamente  tres características definitorias: Poseen un ácido nucleico con capacidad infectiva, lo que asegura la continuidad genética de las estirpes virales. Presentan un grado de parasitismo absoluto lo que implica una gran dependencia con la célula hospedadora. Tienen un tamaño muy pequeño, una organización estructural simple y una composición genómica elemental.
De cualquier forma, aún no pierde vigencia lo establecido por Lwoff en 1957: Los virus deben ser considerado como virus, porque los virus son virus. Concepto que implícitamente establece la unicidad de los virus en el mundo biológico.


Según el diccionario de la lengua española “Real Academia Española” XXII Edic.2001. Virus son organismos de estructura muy sencilla, compuesto de proteínas y ácido nucleico, y capaz de reproducirse sólo en el seno de células vivas utilizando su metabolismo.  Y los virus informáticos son programas introducidos subrepticiamente en la memoria de un ordenador que al activarse, destruyen total o parcialmente la información almacenada. Es sorprendente la analogía entre virus y virus informáticos, con antivirales y todo.


1. 3.  Ubicación de los virus en la naturaleza


Los virus junto a  los microorganismos unicelulares pueden ser clasificados considerando un factor decreciente en su complejidad y tamaño, siempre considerando que nada existe por separado en ninguno de los sistemas de procesos jerárquicos (Eldredge, 2001) Así tenemos:
      
               Protozoos (Protistas superiores)
                       hongos
                                   bacterias  (Protistas inferiores)
                                                  mycoplasmas
                                                                        rickettsias
                                                                                        clamydias (falsos virus)
                                                                                                         virus
                                                                                                          priones y viroides


Desde los protozoos hasta las clamydias  todos son celulares; pequeños y simples. Después de las clamydias,  denominadas “falsos virus”, siguen los virus que no se consideran como protistas inferiores. Son  más pequeños y acelulares. Contienen un solo tipo de ácido nucleico. No poseen ribosomas, mitocondrias ni ATP. Son completamente dependientes de la célula hospedadora para la síntesis de proteínas y  de energía. Son los parásitos más parásitos. No son autopoiéticos. Fuera de la célula son inertes. Sólo dentro de la célula presentan las características de la vida, interfiriendo y controlando el metabolismo celular, lo que en último término dirige la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas virales que constituirán la estructura de la progenie viral.




Cuadro 1.  Diferencias básicas entre virus y bacterias
                                      
                                                 Virus Bacterias
---------------------------------------------------------------------------------------------------
Unidad estructural:               Virión   Célula
Composición química:           Un solo ácido nucleico Dos tipos de ácido nucleico
                                                 Escasas proteínas Muchas proteínas
                                                 Pocas enzimas Muchas enzimas
                                                 No generan ATP Generan ATP
                                                Algunos virus tienen Tienen glúcidos
                                                glúcidos y lípidos y lípidos
--------------------------------------------------------------------  ----------------------------------
Naturaleza de su crecimiento:
                                                   
División binaria:                       No Sí
Síntesis independiente
de sus partes                              Sí No
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Crecimiento en medios
artificiales                                 No Sí


Sensibles a antibióticos            No     Sí


Sensibles a interferón               Sí     No


Presencia de ribosomas            No      Sí


Contienen ácido
murámico                                    No Sí


Tamaño menor de 300 nm          Sí       No   
--------------------------------------------------------------------------------------------------------

En términos generales, a diferencia de las células, los virus tienen una estructura simple y estática, no tienen un sistema metabólico propio y dependen de la maquinaria de la célula hospedera para su replicación (son parásitos intracelulares estrictos).
Con los virus no termina la apasionante historia de la materia organizada. Después de los virus siguen los virus no convencionales o entidades patógenas sub-virales: viroides y priones, con las características de las macromoléculas que los constituyen, exclusivamente ARN en los viroides, y  proteínas en los priones.


Los viroides son patógenos de los vegetales, causando la enfermedad de los tubérculos fusiformes de las papas, exocortis de los cítricos, enanismo del crisantemo, clorosis del pepino, enanismo del lúpulo, entre otras.


Los priones son patógenos de los mamíferos, causan el scrapie de las ovejas y cabras, la encefalopatía transmisible del visón, y la  enfermedad crónica devastante del alce y venado. En el hombre: el kuru, la enfermedad de Creutzsfeldt-Jacob y el síndrome de Straussler-Gerstmann. Y la encefalopatía espongiforme en bovinos o enfermedad de las vacas locas.


Los virus de la hepatitis delta  son los virus más pequeños y son considerados como “satélites subvirales del virus de la hepatitis B” al que necesitan para replicarse. También se denominan “virusoides”. Los virusoides, también llamados ARN satélites, son similares a los viroides en el sentido de que son ácidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular, extremadamente resistentes al calor y a las radiaciones ultravioletas e ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicación. Los virusoides se replican en el citoplasma de la célula a través de una polimerasa ARN dependiente de ARN.


Los virus defectivos son virus cuyos genomas carecen de uno o más genes, debido a mutaciones o a deleciones.   Necesitan al igual que los virusoides de un virus ayudante para replicarse. En el caso de algunos virus, durante la infección se produce una mayor cantidad de virus defectivos que de viriones infecciosos (tanto como 100:1). La producción de partículas defectivas es característica de algunas especies virales y se cree que modera la severidad de la relación infección/enfermedad in vivo.


Pseudoviriones son virus que contienen  fragmentos de ADN celular en vez del ADN viral. No se pueden replicar. Los pseudoviriones pueden ser producidos durante la replicación viral cuando el genoma del hospedero se fragmenta. Como resultado de este proceso algunos fragmentos del ADN del hospedero se incorporan en la cápside en lugar del ADN viral.


Pseudotipos: Son virus que tienen igual envoltura pero uno de ellos tiene el genoma diferente, ejemplo virus leucosis felina y su pseudotipo el virus sarcoma felino.


¿Son los virus verdaderos microorganismos?  “De acuerdo con el biólogo chileno Humberto Maturana Romesín los virus no serían seres vivos porque no son autopoiéticos, es decir porque no son capaces de replicarse por si mismos”.


Desde un punto de vista epidemiológico los virus se comportan como agentes infecciosos semejantes a las bacterias. Sin embargo, se diferencian netamente de los clásicos microorganismos en cuanto a su unidad estructural, composición química y naturaleza de su crecimiento.  


Los virus tiene un solo tipo de ácido nucleico, ADN o ARN, escasas proteínas, hidratos de carbono y lípidos; pocas enzimas; y su crecimiento es por síntesis independiente de sus componentes.


Los microorganismos son células con ADN y ARN, abundantes proteínas, hidratos de carbono, lípidos y gran cantidad de enzimas; además tienen  capacidad para generar ATP, y crecen por división binaria. Cabe destacar que las clamydias y rickettsias, al igual que los virus, no crecen en medios artificiales, y son por lo tanto parásitos intracelulares obligados.  


Los virus no son sensibles a los antibióticos de acción farmacológica. La única excepción la constituye el rifampin, un derivado  de la rifamicyna producida por el Streptomyces mediterranei, que actúa sobre los virus pox. Solamente los virus y clamydias son sensibles a los interferones.
      
¿Son los virus seres vivos o elementos inanimados? Los virus están en el umbral  entre lo vivo y lo inanimado. Al ingresar a una célula suplantan a los genes celulares y bloquean la síntesis de macromoléculas celulares, reemplazándola por la producción de ácidos nucleicos y proteínas virales, constituyéndo la forma más perfecta de parasitismo.


Los virus tienen una composición química simple, aunque presentan una gran variedad de formas y tamaño, e importantes diferencias en los tipos de genoma y estrategias de replicación. Para reproducirse deben necesariamente introducir su ácido nucleico en el interior de una célula viva, por lo tanto los virus serían verdaderos parásitos genéticos que al suplantar a  los genes celulares, dirigen el metabolismo celular a generar productos virales, algunos de los cuales bloquean la síntesis de proteínas y ácido nucleicos celulares.


La continuidad fenotípica de los virus está dada por la información codificada en su genoma; sin embargo, los virus presentan una gran plasticidad, siendo capaces de mutar con la probabilidad de que se presente  un cambio en un aminoácido una vez en 1 x 10.000 ó 10.000.000 de la progenie.

Muy equivocado estaba William H. Stewart, quién en 1969, es decir hace casi 50 años, se atrevió a afirmar que había llegado "el momento de cerrar el libro de las enfermedades infecciosas" olvidando que en ambientes nuevos hay peligros nuevos y si las enfermedades infecciosa fueron entre el 2000 a.C. hasta el 2000 d.C, prioritariamente, un peligro para la salud humana y animal, actualmente en el año 2010 son las nuevas enfermedades infecciosas como el SIDA, virus Ebola, virus Hanta en el hombre, las que constituyen peligros reales para la salud.

       

viernes, 9 de febrero de 2018

HITOS DE LA INFLUENZA EQUINA EN CHILE. P. Berríos E. 2018

Hitos de la influenza equina (IE) en Chile ¿Endémica, cíclica?
Patricio Berríos E.
2018

1) En junio de 1963 se describió el primer brote de IE en Chile. Según Fuschlocher en 1957 se habría presentado un cuadro similar, incluso recordaba que en 1936 había ocurrido una enfermedad semejante (Fuschlocher et al, 1963).
2) En otoño de 1973 se presentó IE en un brote de larga duración (Ríos, 1973).
3) En enero de 1977 se presentó IE de inusitada intensidad causando cuantiosas pérdidas económicas. El virus causante fue el H7 N7 (Casanova et al, 1977; Muñoz et al, 1979).
4) En diciembre de 1985 se describe IE con una tasa de ataque alta. El virus causante fue el H3 N8 (Berríos et al, 1986).
5) En enero de 1992 se presentó IE más suave causado por el H3 N8.
6) En junio de 2006 se describe IE causada por el H3 N8 (Méndez et al, 2006).
7) En enero de 2012 se inició en Los Andes un brote de enfermedad respiratoria causado por el H3 N8.
8) En 2013 se presentaron casos en Magallanes en que el SAG confirmó la presencia del virus IE.
9) En enero de 2018 se determina la presencia de IE causada por el H3 N8. Brote en curso...

¿Es endémica la IE en Chile? ¿Se presenta siguiendo ciertos ciclos epidemiológicos? ¿Dónde se inició el brote 2018?

viernes, 19 de enero de 2018

Especial verde y sustentable: Términos que cuentan 2018

Agujero en la capa de ozono
Se refiere a la pérdida periódica de ozono -cuya función es la protección contra las radiaciones ultravioletas emitidas por el Sol- en las capas superiores de la atmósfera en la zona de la Antártida. El agujero, provocado por los clorofluorocarbonos (CFC) y otros elementos químicos usados por mucho tiempo como refrigerantes, se presenta durante la primavera antártica y dura varios meses antes de cerrarse de nuevo. Gracias a las progresivas restricciones a los CFC, la NASA cree que el agujero podría desaparecer en 2065.

B
Biodegradable
Sustancia que puede descomponerse a través de procesos biológicos realizados por diversos microorganismos. La biodegrabilidad de los materiales depende de su estructura física y química, por lo que el plástico tradicional es menos propenso a este proceso que el papel. Por ejemplo, algunas bolsas biodegradables que se usan en el retail nacional se desintegran por completo en 15 meses, mientras que las de plástico tradicional demoran hasta 300 años. Mucho del plástico que se utiliza va a dar al mar, lo que ha generado una crisis en los océanos, razón por la cual a comienzos de este mes en Chile se aprobó un proyecto que busca prohibir gradualmente la entrega de bolsas plásticas por parte del comercio, primero en las 102 comunas costeras y luego para que en las demás se establezca una ordenanza para regular su uso.
Biodiversidad
Es la variedad de plantas, animales, hongos y microorganismos que viven en un espacio determinado, además de su variabilidad genética y los paisajes o regiones en donde se ubican. Los países con mayor biodiversidad del mundo son Brasil, Colombia, Indonesia, China, México, Perú, Australia, India, Ecuador y Venezuela.
Biomasa
Fresh and mature home compost piles.
Materia orgánica de origen vegetal o animal, incluyendo los residuos y desechos orgánicos, susceptible de ser aprovechada energéticamente. Es el caso del biogás, que se produce cuando se pudren elementos de la basura y sirve para tareas como la calefacción. Otro ejemplo es el de la Región de Biobío, donde ya hay 13 plantas de biomasa que procesan desechos forestales como astillas, y generan energía que aportan al sistema interconectado central.
C
Cambio climático
Alteraciones de los ciclos naturales del planeta por efecto de la actividad humana, especialmente las emisiones masivas de dióxido de carbono (CO2) a la atmósfera provocadas por las industrias y el uso masivo de combustibles fósiles. Según cifras de 2017, los niveles en la atmósfera de CO2 –gas que atrapa el calor- superan en 46 por ciento a los existentes a inicios de la revolución industrial.
Calentamiento global
Es el aumento de la temperatura del planeta producto de la actividad humana en los últimos 100 años, lo que modifica las estaciones de lluvia y aumenta el nivel del mar. Durante el pasado siglo, se calcula que la temperatura media global ha aumentado 0,76 °C, mientras que en zonas como el Ártico ese índice llega hasta los 5 °C.
Combustibles fósiles
Son aquellos que proceden de la biomasa producida hace millones de años y que pasaron por procesos de transformación hasta generar sustancias de gran contenido energético y no renovables, como el carbón y el petróleo. Estos combustibles liberan compuestos como CO2 y conformarán el 70 por ciento del consumo mundial de energía hasta el año 2040.
Garbage lie at Dbayeh's seaside shore north of Beirut on November 28, 2017 after it was washed away by the sea from the nearby seaside garbage dump of Karanatina. The open burning of waste in Lebanon poses serious health risks, Human Rights Watch warned in a report released today, blaming decades-old, across the board government failure. The New York-based watchdog said the crisis, which escalated in 2015 when waste management largely collapsed across Lebanon, was a particular threat for children and old people, and constituted a rights violation. / AFP PHOTO / JOSEPH EID LEBANON-ENVIRONMENT-WASTE
Contaminación
El término proviene del latín “contaminare” (manchar) y alude a la introducción de sustancias u otros elementos físicos en un medio que provocan un cambio perjudicial en las características químicas, físicas y biológicas de un ambiente o entorno. Esta alteración, que puede ser provocada por factores como las sustancias químicas del esmog, un sonido o radiactividad, entre otros, afecta o puede incidir en la vida de organismos y humanos. Actualmente, la ciudad con el aire más contaminado del mundo es Zabol, en Irán.
Consumo responsable
También conocido como “consumo justo”, consiste en elegir productos no sólo en base a su calidad y precio, sino también por su impacto ambiental y social, y por los procesos de producción, transporte y distribución que realizan las empresas que los elaboran. La idea es cambiar los hábitos de compra ajustándolos a las necesidades del planeta y escogiendo opciones que favorezcan el medioambiente y la igualdad social.
Cumbre ODS
Se realizó en septiembre de 2015 en Nueva York y en ella los estados miembros de la ONU aprobaron la Agenda 2030 para el Desarrollo Sostenible, que incluye 17 Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS) para poner fin a la pobreza, luchar contra la desigualdad y la injusticia, y hacer frente al cambio climático. Entre los fines está gestionar los bosques de forma sostenible, luchar contra la desertificación, resguardar los recursos marinos y lograr que las ciudades y los asentamientos humanos sean inclusivos, seguros, resilientes y sostenibles.
D
Deforestación
Desaparición o disminución de las superficies cubiertas por bosques, producto de labores madereras, uso de los árboles como combustible y la creciente extensión de superficies destinadas a cultivos y pastoreo. Según estudios internacionales, el bosque nativo chileno de la zona central ha perdido el 83 por ciento de su vegetación original.
Desertificación
Proceso por el cual un territorio que no posee las condiciones climáticas de un desierto adquiere sus características, como resultado de la destrucción de su cubierta vegetal y de la fuerte erosión. La sobreexplotación de los suelos, el abuso de pesticidas y plaguicidas, la tala indiscriminada de árboles y el cambio climático favorecen este fenómeno. Por ejemplo, Conaf estima que en 2050 la zona de Coquimbo tendría las condiciones de aridez de Atacama.
E
Ecología
Ciencia que estudia a los seres vivos en sus distintos niveles de organización y sus interrelaciones entre ellos y con el medioambiente. El término fue acuñado en 1869 por el naturalista y filósofo alemán Ernst Haenckel, quien unió las palabras griegas oikos (casa, hogar) y logos (estudio).
Ecosistema
Complejo dinámico de comunidades vegetales, animales microorganismos y su entorno. La zona de la Amazonía se considera como el ecosistema más rico del mundo: sólo en el río que recorre el sector conviven más de 2.500 especies de peces.
Educación ambiental
Proceso de formación que permite la toma de conciencia de la importancia del medioambiente, promueve en la ciudadanía el desarrollo de valores y actitudes que contribuyan al uso racional de los recursos naturales y a la solución de los problemas ambientales. Desde 2003, más de 1.300 establecimientos de nivel parvulario, básico y medio en Chile han iniciado procesos de certificación ambiental que incluyen currículo y metodologías de educación ambiental.
19 de julio 2017/SANTIAGO Inauguran la planta de energía solar fotovoltaica, mas grande la Región Metropolitana llamada Quilapilún, el evento contó con la presencia del ministro de Energía, Andrés Rebolledo y el de Medio Ambiente, Marcelo Mena FOTO: FRANCISCO CASTILLO D./AGENCIAUNO
Energías alternativas
También llamadas renovables. Se renuevan siempre y se refieren, por ejemplo, a la energía solar, la eólica, la hidráulica, la biomasa o la geotérmica (calor natural de la Tierra). En Chile la energía solar ya genera el siete por ciento de la electricidad del país y representa el 44 por ciento de la producción de energías limpias.
G
Gases de invernadero
Gases como el dióxido de carbono o el metano que se acumulan en la atmósfera y actúan como un techo que limita el ritmo de escape del calor de Sol desde la superficie terrestre. En el caso del metano, proviene de fuentes como la digestión que realiza el ganado: un estudio divulgado en 2017 por la NASA señala que sólo en 2011 vacas y otros animales liberaron 119 millones de toneladas de ese gas.
H
23 de Septiembre del 2013/PAINE Una garza camina por un humedal, durante este segundo día de primavera. Oficialmente esta estación comenzó el día de ayer, al mediodía, cuando se produjo el "Equinoccio de primavera", momento en que el sol pasa desde el hemisferio norte hacía el hemisferio sur, teniéndo desde entonces, el día, la misma duración que la noche. FOTO: HANS SCOTT/AGENCIAUNO.
Humedal
Se refiere a una amplia variedad de ambientes que comparten la presencia del agua como elemento característico. Según la Convención sobre los Humedales (Ramsar, Irán, 1971), estas áreas abarcan marismas, pantanos, turberas y extensiones de agua marina que regulan procesos hidrológicos y operan sobre todo como hábitats de aves acuáticas. Chile tiene 13 sitios designados como “Humedales de Importancia Internacional”, con una superficie de 361,761 hectáreas.
Huella de carbono
Es la totalidad de gases de efecto invernadero emitidos por efecto directo o indirecto de un individuo, organización, evento o producto. Por ejemplo, gracias a la popularidad de serviciosstreaming como YouTube, Netflix y Spotify la industria del entretenimiento ha reducido 40 por ciento sus emisiones de dióxido de carbono, que venían de la elaboración de CD, DVD, el celofán y las cajas de acrílico o plástico necesarias para empacar los discos.
I
Impacto ecológico
Abarca los efectos producidos por las actividades humanas en organismos vivientes y en su medioambiente no viviente. Estos incluyen, por ejemplo, desde la contaminación del mar con petróleo, los desechos radiactivos y la emisión de gases nocivos.
L
Lluvia ácida
Fenómeno contaminante que se produce al combinarse el vapor de agua atmosférico con óxidos de azufre y de nitrógeno, formando ácido sulfúrico y ácido nítrico. Esto cae como precipitación que deteriora los lagos, los árboles y otras especies y se origina sobre zonas donde se queman combustibles fósiles. Uno de los países donde este fenómeno empeora día a día es la India, a raíz del alto uso del carbón. 25 Marzo de 2015/ HUALPEN Vecinos de la comuna de Hualpén denunciaron nuevo episodio de malos olores emanados desde Enap, en donde la alcaldesa de Hualpén, Fabiola Lagos, llegó hasta la Corte de Apelaciones de Concepción para presentar un recurso de protección y que incluye una serie de mejoras al interior de la planta. La última emanación se produjo la semana pasada, donde incluso los vecinos afectados debieron acudir a recintos de salud. Enap se comprometió con más de US$13 millones para mitigar los malos olores de refinería de Hualpén FOTO: MARIBEL FORNEROD/AGENCIAUNO
N
Neutro en carbono
Se refiere a empresas u organizaciones con cero emisiones de dióxido de carbono. El nivel cero se puede conseguir mediante la reducción progresiva de emisiones, el uso de energías renovables o a partir de una combinación de ambas opciones. En Chile hay varias instituciones que son neutras en carbono, como el festival Lollapalooza, DHL y CorpBanca.
O
Orgánico
Se refiere a los productos agrícolas elaborados sin el uso de fertilizantes, pesticidas u otros químicos artificiales. De acuerdo con cifras internacionales, en la última década el mercado global de alimentos orgánicos aumentó en un 170 por ciento. En Chile hay 131.973 hectáreas certificadas como orgánicas, de las cuales el seis por ciento corresponde a frutales como la uva vinífera, los arándanos y los manzanos.
P
Parques naturales
Áreas poco transformadas por la explotación u ocupación humana que debido a la belleza de sus paisajes, la representatividad de sus ecosistemas o la singularidad de su flora, de su fauna o de sus formaciones geomorfológicas, poseen valor ecológico, estético, educativo o científico. Chile tiene 36 parques nacionales y dos parques marinos.
R
Las tres R
Reducir. Reutilizar. Reciclar. Es una propuesta de consumo, popularizada por Greenpeace, que apunta a desarrollar hábitos como el consumo responsable y busca reducir el consumo de bienes o energía, reutilizar para extender la vida útil de productos como el papel y reciclar materiales como el plástico. En 2004, el primer ministro de Japón, Koizumi Junichiro, presentó una iniciativa en la cumbre del G8 para promover globalmente una sociedad orientada hacia las tres R.
S
Sostenible
Crecimiento regulado que a través de medidas políticas y sociales busca utilizar de manera eficiente los recursos. Este tipo de desarrollo satisface las necesidades actuales de todos los habitantes del planeta, sin comprometer los recursos del futuro. Un ejemplo de desarrollo sostenible son las energías renovables.
Sustentable
Desarrollo que puede mantenerse por sí mismo sin que se vean afectados los recursos del planeta. No precisa una intervención humana o exterior, ya que puede sostenerse de manera autónoma. Por ejemplo, la Viña San Pedro utiliza estanques con biodigestores con microorganismos que procesan palos, pellejos y pepas de uva y generan gas que les permite abastecer en promedio el 60 por ciento de la energía eléctrica y térmica que requieren.
T
BY5BGR Corn cobs drying - Hungary
Transgénico
Producto vegetal que ha sido manipulado genéticamente con el objeto de mejorar su rendimiento productivo y, por lo tanto, la rentabilidad de su explotación. Aún se desconocen los efectos que estas alteraciones genéticas podrían provocar en otras especies, entre ellas la humana. En Chile, las principales semillas transgénicas producidas son el maíz, la canola y la soja.
V
Verde
Término que se aplica ampliamente para describir algún sitio diseñado de una manera respetuosa con el ambiente o para tener un impacto mínimo en él. Por ejemplo, el edificio The Edge en Holanda cuenta con 28 mil sensores para detectar humedad, temperatura y otros factores que le permiten ajustar su iluminación y el aire acondicionado.
W
World Wide Fund for Nature (WWF)
Fondo Mundial para la Naturaleza. Organización creada en 1961 en Suiza para ayudar a conservar la naturaleza y los procesos ecológicos esenciales para la vida en el planeta.
Z
Zero Waste
Significa “basura cero” y es una tendencia mundial que comenzó en los 90 y que busca reducir al mínimo la producción de residuos. Un ejemplo es el restaurante Panatura Vegano –ubicado a pasos de Plaza Ñuñoa–, que se encarga de sus residuos orgánicos, no entregan plástico y reutilizan las aguas grises de los baños

viernes, 17 de noviembre de 2017

Genetic Diversity of Infectious Laryngotracheitis Virus during In Vivo Coinfection Parallels Viral Replication and Arises from Recombination Hot Spots within the Genome Carlos A. Loncoman,a Carol A. Hartley,a Mauricio J. C. Coppo,a Paola K. Vaz,a Andrés Diaz-Méndez,a Glenn F. Browning,a Maricarmen García,b Stephen Spatz,c Joanne M. Devlina 2017

Genetic Diversity of Infectious Laryngotracheitis Virus during In Vivo Coinfection Parallels Viral Replication and Arises from Recombination Hot Spots within the Genome Carlos
A. Loncoman,a Carol A. Hartley,a Mauricio J. C. Coppo,a Paola K. Vaz,a Andrés Diaz-Méndez,a Glenn F. Browning,a Maricarmen García,b Stephen Spatz,c Joanne M. Devlina
Asia-Pacific Centre for Animal Health, Melbourne Veterinary School, Faculty of Veterinary and Agricultural Sciences, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australiaa ; Poultry Diagnostic and Research Center, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, Georgia, USAb; Southeast Poultry Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Athens, Georgia, USAc

ABSTRACT Recombination is a feature of many alphaherpesviruses that infect people and animals. Infectious laryngotracheitis virus (ILTV; Gallid alphaherpesvirus 1) causes respiratory disease in chickens, resulting in significant production losses in poultry industries worldwide. Natural (field) ILTV recombination is widespread, particularly recombination between attenuated ILTV vaccine strains to create virulent viruses. These virulent recombinants have had a major impact on animal health. Recently, the development of a single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assay for ILTV has helped to understand ILTV recombination in laboratory settings. In this study, we applied this SNP genotyping assay to further examine ILTV recombination in the natural host. Following coinoculation of specific-pathogen-free chickens, we examined the resultant progeny for evidence of viral recombination and characterized the diversity of the recombinants over time. The results showed that ILTV replication and recombination are closely related and that the recombinant viral progeny are most diverse 4 days after coinoculation, which is the peak of viral replication. Further, the locations of recombination breakpoints in a selection of the recombinant progeny, and in field isolates of ILTV from different geographical regions, were examined following full-genome sequencing and used to identify recombination hot spots in the ILTV genome.

IMPORTANCE Alphaherpesviruses are common causes of disease in people and animals. Recombination enables genome diversification in many different species of alphaherpesviruses, which can lead to the evolution of higher levels of viral virulence. Using the alphaherpesvirus infectious laryngotracheitis virus (ILTV), we performed coinfections in the natural host (chickens) to demonstrate high levels of virus recombination. Higher levels of diversity in the recombinant progeny coincided with the highest levels of virus replication. In the recombinant progeny, and in field isolates, recombination occurred at greater frequency in recombination hot spot regions of the virus genome. Our results suggest that control measures that aim to limit viral replication could offer the potential to limit virus recombination and thus the evolution of virulence. The development and use of vaccines that are focused on limiting virus replication, rather than vaccines that are focused more on limiting clinical disease, may be indicated in order to better control disease.

KEYWORDS herpesvirus, recombination, replication, diversity, SNP genotyping assay, vaccine, infectious laryngotracheitis virus (ILTV), recombination hot spot, gallid herpesvirus 1, ILTV Received 12 July 2017 Accepted 12 September 2017 Accepted manuscript posted online 22 September 2017 Citation Loncoman, CA, Hartley CA, Coppo MJC, Vaz PK, Diaz-Méndez A, Browning GF, García M, Spatz S, Devlin JM. 2017. Genetic diversity of infectious laryngotracheitis virus during in vivo coinfection parallels viral replication and arises from recombination hot spots within the genome. Appl Environ Microbiol 83:e01532-17. https://doi.org/10 .1128/AEM.01532-17. Editor Harold L. Drake, University of Bayreuth Copyright © 2017 American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Address correspondence to Carlos A. Loncoman, cloncoman@student.unimelb.edu.au. MICROBIAL ECOLOGY crossm December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 Applied and Environmental Microbiology aem.asm.org 1 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/

Downloaded from I nfectious laryngotracheitis virus (ILTV; Gallid alphaherpesvirus 1) is an alphaherpesvirus that causes mild to severe respiratory disease in chickens. The virus causes major economic losses due to mortality and decreases in weight gain and egg production in poultry industries worldwide (1). Recombination between different strains of ILTV has been recognized as a problem for the poultry industry, particularly because natural recombination between attenuated vaccine strains of ILTV has been shown to generate virulent viruses (2). The importance of recombination as a mechanism of viral genome diversification and evolution in ILTV and other alphaherpesviruses is increasingly being recognized (3). Viruses can acquire genetic changes through several mechanisms, including point mutation and recombination, with the latter particularly important in many alphaherpesviruses (4–6). Viruses that belong to the order Herpesvirales have double-stranded linear DNA genomes and have complex viral DNA replication machinery, comprising a DNA polymerase with a highly efficient proofreading capacity, resulting in very low rates of spontaneous mutation (7–9). Therefore, rather than random changes or point mutations throughout the genome, recombination is considered to be a major evolutionary driving force enabling many alphaherpesviruses to persist, evolve and eventually become more virulent over time (2, 10, 11). Four types of recombination have been described, based on the structure of the crossover site: site-specific recombination, transposition recombination, nonhomologous or illegitimate recombination, and homologous recombination (12). Homologous and illegitimate recombination, specifically intraspecific recombination, are the most commonly described recombination mechanisms in alphaherpesviruses (12). Intraspecific recombination under in vitro conditions has been extensively described for several alphaherpesvirus species, including Human alphaherpesvirus 1, also known as herpes simplex virus 1 (HSV-1) (13), Bovine alphaherpesvirus 1, also known as bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) (14), Human alphaherpesvirus 3, also known as varicella-zoster virus (VZV) (15), Felid alphaherpesvirus 1, also known as felid herpesvirus 1 (FeHV-1) (16) and Suid alphaherpesvirus 1, also known as pseudorabies virus (PRV) (17). Full-genome sequencing and sequence analysis are the most suitable methods for detecting and describing alphaherpesvirus recombination events that occur under natural (field) conditions, but even nowadays these techniques have their limitations, including intensive labor and costs. In contrast, under experimental conditions, other techniques to detect recombination are still more efficient and cost-effective, as well as more suitable for testing large numbers of viruses (14, 18). We have recently described the development and validation of a TaqMan single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assay to study recombination under experimental conditions in specific-pathogen-free (SPF) chickens (18), the natural host of ILTV. Use of the natural host to study recombination may reveal aspects of herpesvirus biology that may not be apparent in studies that utilize laboratory animal models of infection (19). The aim of this study was to apply this ILTV SNP genotyping assay to examine in vivo recombination between two ILTV strains over time. This was performed in order to describe recombination patterns and to examine genetic diversity among the viral progeny during the course of an ILTV infection. Additionally, we aimed to identify any recombination hot spots in the ILTV genome by performing full-genome sequencing of selected recombinants and analyzing them along with other ILTV genomes that were already available from different geographical regions, including Asia, Australia, Europe, and the United States. RESULTS Bird survival rates and virus genome quantification. Groups of chickens were coinoculated with the V1-99 and CSW-1 strains of ILTV at two different doses or were inoculated with only either V1-99 or CSW-1. The survival rates in groups of birds that were inoculated only with low or high doses of V1-99 ILTV were around 70% and 45% throughout the experiment, respectively (Fig. 1). Groups that received only CSW-1 had 100% survival rates throughout the experiment (Fig. 1). In the coinoculated groups, the Loncoman et al. Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 2 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from FIG 2 Replication of ILTV in SPF chickens based on genome copy numbers in tracheal swabs measured using qPCR. Medians are indicated by lines for each group. Birds were inoculated with either CSW-1 or V1-99 or coinoculated (co-inoc) with 103 PFU (low dose) (A to D) or with 104 PFU (high dose) (E to H) of the V1-99 and (Continued on next page) Loncoman et al. Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 4 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from lated with the low dose of viruses, 14, 26, 15, and 9 genotype patterns were detected at 2, 4, 6, and 8 days postinoculation, respectively (Tables 2 and 3). Some of these genotype patterns were detected consistently over time in both low- and high-doseinoculated groups. In the singly inoculated groups, no recombination was detected within the 10 viruses that were isolated and purified from each infected chicken at day 4 from the groups inoculated with the higher viral dose of 1 104 PFU/ml (see Fig. S1 in the supplemental material). Viral-diversity analysis. The higher level of viral replication in the low-dosecoinoculated group at day 4 than day 2 (Fig. 2A and B) coincided with a higher level of viral diversity, as assessed using Renyi diversity profiles (Fig. 5A) and as indicated by significantly higher values for diversity as measured by richness (0), ShannonWeaver (1), 1/Simpson (2), 1/Berger Parker (infinite [Inf]), and Hill (0.25, 0.5, 4, 8, 16, 32, and 64) scales, as well as evenness values at these time points (see Table S1 in the supplemental material). The Renyi diversity profile was higher at day 6 than at day 8 (Fig. 5B); however, the diversity measurements were not significantly different between these days (see Table S2). In the high-dose-coinoculated group, the Renyi diversity profile was higher at day 4 than at day 2 (Fig. 5C), coinciding with the higher levels of viral replication at day 4 than day 2 in this group (Fig. 2E and F). Significant differences were detected only in the Shannon-Weaver (1), 1/Simpson (2), and Hill (4) values for these days (see Table S3). Full-genome sequencing and identification of recombination hot spots. Six progeny viruses were selected for full-genome sequencing and analysis (see Table S4) in order to identify all recombination events and compare these to those detected with the SNP genotyping assay and to examine the distribution of recombination breakpoints along the genome. These recombination patterns were also searched for among 35 other full ILTV genome sequences of isolates from Asia, Australia, Europe, and the United States in order to identify recombination hot spots in ILTV from distinct geographical regions. In addition to the distribution of recombination breakpoints detected by RDP4, reticulate network and phi test analyses were performed as previously described (20) (see Fig. S2). The six SNPs targeted by the TaqMan SNP genotyping assay were confirmed by full-genome analysis. Additional events were detected outside the genome regions targeted by the TaqMan assay. The full genomes of the two genotype pattern 9 viruses shared 99.9% pairwise sequence identity. Between these two genotype pattern 9 viruses, 11 SNPs were detected within genes UL[ 1], US5, US6, US7, US8, and US9, located between bp 110000 and bp 140000 in the aligned sequences. Two SNPs were identified in the protein IF and UL49 genes located between bp 8000 to bp 18000 in the aligned sequences, and two SNPs were identified in the UL43 and UL17 genes between bp 74000 and bp 86000. When CSW-1 was used as the reference strain, a total of 55 polymorphisms were found in the six viruses sequenced in this study (see Table S5 in the supplemental material). A high number of recombination breakpoints were identified in two locations extending from bp 20000 to bp 50000 and from bp 106000 to bp 137000 in the six genome sequences from viruses isolated in this study (Fig. 6B). When the full-genome sequences from other ILTV isolates from varied geographical regions were examined, the recombination hot spots detected in those genomes were consistent with those found in the six genomes sequenced from the in vivo study (Fig. 6C, D, and E). Recombination events within genes UL[ 1] and ICP4 were detected in ILTV sequences FIG 2 Legend (Continued) CSW-1 strains of ILTV. (A and B) Low-dose-coinoculated birds F, G, H, I, and J (in the circles) had higher numbers of viral genome copies at day 4 than at day 2 (P 0.05, Mann-Whitney test). These birds did not survive to day 6. (C and D) Low-dose-coinoculated birds K, L, and M (in the rectangles) did not have significantly different numbers of viral genome copies between day 6 and day 8 (P 0.05, Mann-Whitney test). (E and F) High-dosecoinoculated birds A, B, C, D, and E (in the triangles) had higher numbers of viral genome copies at day 4 than at day 2 (P 0.05, Mann-Whitney test). (G and H) High-dose-coinoculated birds did not survive to days 6 and 8. ILTV Recombination in the Natural Host Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 5 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from FIG 3 Recombination patterns, as determined using SNP genotyping, in progeny viruses isolated 2 and 4 days after coinoculation of SPF chickens with 104 PFU of each of CSW-1 and V1-99 ILTV. Each row corresponds to a virus isolate, with the CSW-1 SNPs indicated by gray boxes and the V1-99 SNPs by black boxes. Each distinct recombination pattern was given a unique genotype code (final column). Loncoman et al. Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 6 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from from Australia and the United States and in our in vivo recombinants (Table 4). Recombination events among the Asian ILTV strains were detected at sites similar to those detected in the Australian strains, with recombination breakpoints found in genes UL4, UL3.5, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, and UL34 (Table 4). Only one recombination breakpoint was detected and confirmed by several methods in the ILTV sequences from Europe (Italy) (Table 4). Hence, because of the low number of recombination events in the European group, no recombination hot spots were detected. DISCUSSION Our results show that higher levels of diversity in the recombinant progeny occurred at the same time as higher levels of virus replication (as measured by viral titers). A direct relationship between viral replication and recombination diversity would have important implications for disease control, as it suggests that measures taken to reduce viral replication, such as administration of vaccines to limit virus replication following challenge (21), may be able to reduce the diversity of recombinant viruses, thus potentially reducing the capacity of ILTV to evolve to higher levels of virulence. Vaccines are used FIG 4 Recombination patterns, as determined using SNP genotyping, in progeny viruses isolated 2, 4, 6, and 8 days after coinoculation of SPF chickens with 103 PFU of each of CSW-1 and V1-99. Each row corresponds to a virus isolate, with the CSW-1 SNPs indicated by gray boxes and the V1-99 SNPs by black boxes. Each distinct recombination pattern was given a unique genotype code (final column). ILTV Recombination in the Natural Host Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 7 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from regularly in poultry industries to control ILT. As previously described, most vaccines reduce, but do not prevent, ILTV replication (as measured by viral titers) after challenge, due to cell-mediated immune responses that develop in the host in response to vaccination (21). Many vaccine efficacy studies examine ILTV replication after challenge, but some focus only on clinical signs of disease and mortality (21, 22). Furthermore, studies to meet vaccine registration requirements remain focused mainly on mortality and clinical signs of disease (23). Expanding standard vaccine characterization studies to include examination of a vaccine’s capacity to reduce viral replication after subsequent challenge (as measured by viral titers), and potentially viral recombination, would help to further control disease caused by this virus. Similar approaches could be taken for other attenuated live vaccines that are used to control alphaherpesviruses, such as FeHV-1, BoHV-1, and PRV, in veterinary medicine (24, 25) and for varicella-zoster virus (VZV) vaccines in human medicine (26), as these viruses all have capacity for recombination (3). In this study, a high proportion (67%) of viruses detected following in vivo ILTV coinoculation were recombinants. This is consistent with findings from an HSV-1 study that found that 59% of progeny viruses from the cornea and 74% of progeny viruses from the trigeminal ganglia of mice coinoculated with two strains of HSV-1 were identified as recombinants using restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis (13). Additionally, in vitro studies have also shown abundant recombination following alphaherpesvirus coinoculation, although lower proportions of recombinants are typically detected in cell culture than in in vivo models. For example, approximately 26% of progeny viruses obtained after coinoculation of two HSV-1 strains into cultured cells were identified as recombinants using RFLP analysis (13), and 13% of the viral progeny obtained after coinoculation of two VZV strains into cell culture were identified TABLE 1 Genotypes of viruses detected in high-dose-coinoculated (104 PFU) chickens at 2 and 4 days after coinoculationa Day 2 Day 4 Genotype pattern code Chicken(s) from which virus was isolated No. (%) of isolates Genotype pattern code Chicken(s) from which virus was isolated No. (%) of isolates 4  aFor day 2, there were a total of 42 (46.2%) parental viruses and 49 (53.8%) recombinants, for a total of 91 (100%) viruses; for day 4, there were a total of 16 (20.8%) parental viruses and 61 (79.2%) recombinants, for a total of 77 (100%) viruses. Loncoman et al. Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 8 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from as recombinants by RFLP analysis (15). Similarly, 10% to 21% of the viral progeny obtained after coinoculation of an FeHV-1 wild-type strain and two vaccine strains were identified as recombinants by restriction endonuclease digestion of PCR products (16). More recently a TaqMan SNP genotyping assay was developed to better detect TABLE 2 Genotypes of viruses detected in low-dose-coinoculated (103 PFU) chickens at 2 and 4 days after coinoculationa Day 2 Day 4 Genotype pattern code Chicken(s) from which virus was isolated No. (%) of isolates Genotype pattern code Chicken(s) from which virus was isolated No. (%) of isolates 1  there were a total of 38 (53.5%) parental viruses and 33 (46.5%) recombinants, for a total of 71 (100%) viruses; for day 4, there were a total of 29 (35.4%) parental viruses and 53 (64.6%) recombinants, for a total of 82 (100%) viruses. TABLE 3 Genotypes of viruses detected in low-dose-coinoculated (103 PFU) chickens at 6 and 8 days after coinoculationa Day 6 Day 8 Genotype pattern code Chicken(s) from which virus was isolated No. (%) of isolates Genotype pattern code Chicken(s) from which virus was isolated  aFor day 6, there were a total of 15 (34.9%) parental viruses and 28 (65.1%) recombinants, for a total of 43 (100%) viruses; for day 4, there were a total of 31 (57.4%) parental viruses and 23 (42.6%) recombinants, for a total of 54 (100%) viruses. ILTV Recombination in the Natural Host Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 9 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from TABLE 4 Recombination breakpoint analysis of full ILTV genome sequences and field isolates from Asia, Australia, and the United States and in vivo recombinants Origin of isolates Breakpoint (in alignment), 99% CIa Gene(s) at the beginning of the breakpoint locationb Gene(s) at the end of the breakpoint locationb Possible viruses involved in recombination eventc Method(s) by which breakpoint was detected in RDP4 Beginning End Asia (China) 106423–109054 125644–129391  ILTV Recombination in the Natural Host Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 13 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/ Downloaded from TABLE 4 (Continued) Origin of isolates Breakpoint (in alignment), 99% CIa Gene(s) at the beginning of the breakpoint locationb Gene(s) at the end of the breakpoint locationb Possible viruses involved in recombination eventc Method(s) by which breakpoint was detected in RDP4 Beginning End In vivo recombinants 53623–68876 120517–121888 UL35, UL36, UL37, UL38, UL39 No gene between UL [ 1] and ICP4 R, sample 23; M, unknown; m, CSW-1 RDP, GENECONV, Bootscan, MaxChi, Chimaera, SiScan, 3SEQ 121902–124017 134435–137336 US10, SORF3 US6, US7, US8 R, sample 27; M, V1-99; m, unknown RDP, GENECONV, Bootscan, MaxChi, Chimaera, SiScan, 3SEQ 71911–78480 112397–120377 UL42, UL43, UL44, UL21, UL20 ICP4 R, sample 15; M, V1-99; m, CSW-1 RDP, GENECONV, Bootscan, MaxChi, Chimaera, SiScan, 3SEQ 121904–125713 129197–137424 US10, protein SORF3, US2, US3 US4, US5, US6, US7, US8 R, sample 15; M, V1-99; m, sample 23 GENECONV, Bootscan, 3SEQ 74976–97499 111841–114434 UL44, UL21, UL20, UL19, UL18, UL15, UL17, UL14, UL13, UL12, UL11, UL10, UL9 No gene Between UL [-1] and ICP4 R, sample 12; M, sample 1; m, V1-99 RDP, GENECONV, Bootscan, MaxChi, Chimaera, 3SEQ 2256–97499 106970–137424 Entire UL region Entire US region R, sample 12; M, unknown; m, V1-99 GENECONV, MaxChi, Chimaera 1–32193 105020–137424 UL56, protein IF, UL54, UL53, UL52, UL51, UL50, UL49.5, UL49, UL48, UL46, UL45, protein IA-IB-IC-ID-IE, UL22 Entire US region R, sample 12; M, unknown; m, V1-99 GENECONV, MaxChi, Chimaera, 3SEQ 1–1909 5870–17769 No gene UL56, protein IF, UL54, UL53, UL52, UL51, UL50 R, sample 23; M, sample 1; m, sample 12 SiScan 1–53621 107559–120122 UL56, protein IF, UL54, UL53, UL52, UL51, UL50, UL49.5, UL49, UL48, UL46, UL45, protein IA-IB-IC-ID-IE, UL22, UL24, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34 Entire US region R, V1-99; M, unknown; m, sample 8 GENECONV, MaxChi, SiScan, 3SEQ 1–137424 1–137424 Entire UL region Entire UL region R, sample 12; M, CSW-1; m, sample 27 GENECONV, Bootscan, MaxChi, 3SEQ 1–113123 1–113123 Entire UL region Entire UL region R, sample 27; M, V1-99; m, sample 23 RDP, GENECONV, MaxChi, Chimaera 1–17769 19248–137424 UL56, protein IF, UL54, UL53, UL52, UL51, UL50 UL48, UL46, UL45, protein IA-IB-IC-ID-IE, UL22, UL24, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34 R, CSW-1; M, sample 15; m, sample 27 MaxChi, Chimaera, 3SEQ 1–137424 1–137424 Entire UL and US regions Entire UL and US regions R, sample 8; M, sample 15; m, unknown GENECONV, MaxChi, 3SEQ 11775–17921 17923–137424 UL53, UL52, UL51, UL50, UL49.5 UL49, UL48, UL46, UL45, protein IA-IB-IC-ID-IE, UL22, UL24, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34 R, sample 27; M, sample 8; m, unknown MaxChi, 3SEQ 1–137424 1–137424 Entire UL and US regions Entire UL and US regions R, sample 15; M, sample 1; m, unknown 3SEQ aCI, confidence interval. bUL, unique long; US, unique short. cR, recombinant; M, major parent; m, minor parent. Loncoman et al. Applied and Environmental Microbiology December 2017 Volume 83 Issue 23 e01532-17 aem.asm.org 14 on November 16, 2017 by guest http://aem.asm.org/
Downloaded from SUPPLEMENTAL MATERIAL Supplemental material for this article may be found at https://doi.org/10.1128/AEM .01532-17. SUPPLEMENTAL FILE 1, PDF file, 2.5 MB. ACKNOWLEDGMENTS We gratefully acknowledge Mahathi Nadimpalli, Nino Ficorilli, and Mesula Korsa for their help with cell culture and Jose Quinteros, June Daly, Jenece Wheeler, and Cheryl Colson for their help with the in vivo studies. This work was supported by the Australian Research Council (FT140101287). Carlos A. Loncoman is supported by Becas Chile, CONICYT, Gobierno de Chile. The funders had no role in study design, data collection and interpretation, or the decision to submit the work for publication. REFERENCES 1. Garcia M, Spatz S, Guy JS. 2013. Laryngotracheitis, p 137–152. In Swayne D, Glisson J, McDougald L, Nolan L, Suarez D, Nair V (ed), Diseases of poultry, 13th ed. Wiley-Blackwell, Hoboken, NJ. 2. 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