Principales Pautas de Refinamiento en Experimentación Animal. Gabriela Méndez 2010

Principales Pautas de Refinamiento en Experimentación Animal
Gabriela Méndez

4to Taller de Bioética: “Aspectos Bioéticos de la Experimentación Animal”Enero 2009 Organizado por Comité Asesor Bioética Fondecyt - Conicyt

El uso de animales en investigación biomédica y en pruebas de eficacia y seguridad biológica es una más de las técnicas disponibles que diariamente se emplean en muchos laboratorios. Su uso se remonta desde de la antigua Grecia, donde Aristóteles (384-322 a.C.) describe las bases de la experimentación animal en su libro “Historia Animalium”.

Si bien son innumerables los beneficios que se han obtenido gracias a la experimentación animal, entre los cuales se puede mencionar: Incremento de la esperanza de vida humana en 25 años (1900-1990); Diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades animales y humanas; Pruebas de seguridad o eficacia en productos farmacológicos de aplicación en el área médica y veterinaria; etc., no podemos desconocer que la experimentación con animales constituye hoy en día un problema ético.

Tras la promulgación de la Primera Ley sobre Crueldad Animal (Cruelty To Animals Act,1876) en Inglaterra, muchas normativas han tratado de regular y limitar el uso de animales en investigación, pruebas de seguridad o en educación, ya que existe evidencia científica que son seres “sintientes” (o que sienten dolor) y la convicción de que es moralmente inaceptable provocarles dolor sin una adecuada fundamentación.

Uno de los principios mundialmente aceptados e incorporados en muchas de las legislaciones existentes en la protección de los animales empleados en experimentación científica corresponde a las denominadas tres “Rs” de Russell & Burch (1959), que se refieren a la responsabilidad del investigador por preferir técnicas alternativas, que no impliquen el uso de animales en investigación (Reemplazar); en el caso de que lo anterior no fuera factible, emplear el mínimo número de animales sin afectar la validez de los resultados experimentales a través del empleo de buen diseño experimental (Reducir); y a la utilización de todos los métodos y tecnologías disponibles para minimizar la afección o sufrimiento que se le puedan ocasionar a los animales utilizados (Refinar).

Al momento de evaluar los aspectos éticos y bioéticos de un proyecto de investigación científica es importante revisar si los principios de: Reemplazar, Reducir y Refinar han sido aplicados, como también, si los posibles “beneficios” derivados de los procedimientos compensan el “daño o costo” provocado, es decir, si sopesan el sufrimiento o muerte causado en los animales. En este balance ético, además de los objetivos planteados, que pueden indicar directa o indirectamente los eventuales beneficios, debemos considerar la “calidad o validación experimental” que implica desde: el diseño experimental; la utilización de modelos estadísticos que minimicen el número de animales a manipular, pero que a la vez, validen significativamente los resultados que se obtengan; una correcta selección de la especie a emplear (estandarizada tanto genética como sanitariamente); disponer de adecuadas y controladas condiciones de confinamiento; la aplicación de técnicas de refinamiento y contar con personal capacitado en el área que incluyendo a los encargados de la limpieza y alimentación de los animales, técnicos que colaboren en los procedimientos experimentales, científicos o directores de la investigación propuesta y médicos veterinarios especializados en animales de laboratorio (Demers G et al. 2006, Guerrero J & Manteca X. 2000; Jarvis S. et al. 2005, Roesell H. 1996).

La cuantificación de los costos muchas veces también puede ser difícil ya que conlleva a valorar las diferentes especies, más allá de su valor intrínseco dentro de la naturaleza sino que también por la sensibilidad social, religiosa o cultural que exista por la especie en cuestión o por su cercanía genética con el hombre, bajo este concepto; ¿son los costos implícitos en un protocolo experimental que se desarrolle en primates más altos que uno que emplee roedores o insectos?; por el contrario, cuando se trate de especies consideradas como plagas o de abasto, destinadas al consumo diario por el publico en general, ¿debe ser su muerte desvalorada y por ende disminuir la valoración de los costos?.

Es importante destacar que para la mayoría de las leyes y normativas existentes sobre protección animal y específicamente referidas a su uso con fines experimentales,
están circunscritas a animales vertebrados, es decir, que tengan presencia de un sistema nervioso capaz de reaccionar a estímulos externos. Por ejemplo, de acuerdo al Real Decreto Español 223/1988 (http://161.116.168.77:8080/Prova/farmacia/medicaments/
fitxers/legislacio/real_decreto_223.pdf, 09/Febrero/2010.) se define como animal a “cualquier ser vivo vertebrado no humano, incluidas las formas larvarias autónomas capaces de reproducirse, con exclusión de formas fetales o embrionarias”, por lo que el empleo de organismo invertebrados quedan fuera del marco legal no así ético, ya que, si bien existen reportes y literatura sobre su capacidad de percibir y responder a noxas o estímulos adversos (Smith J., 1991), todavía no existe un consenso general, tanto a nivel científico como social, respecto si estas especies animales son capaces de sufrir y de que manera lo manifiestan.

El objetivo de este capítulo es entregar algunas técnicas de refinamiento que puedan
ser aplicadas en el empleo de las especies de animales más utilizadas en investigaciones
biomédicas. Cabe señalar que solamente corresponde a un resumen extraído de las principales pautas existentes al respecto, no corresponde a una revisión exhaustiva de todas las técnicas de refinamiento disponibles o susceptibles a ser aplicadas en animales de investigación, sino que corresponden a una serie de principios generales que pueden ser de ayuda para la formulación de los proyectos de investigación y promueven el bienestar animal por lo que se sugiere al investigador si desea profundizar en el tema referirse a las fuentes originarias.

Análisis Costo/Beneficio
La evaluación sistemática de los proyectos de investigación que involucren el empleo de animales como reactivos biológicos deberían considerar dentro de su análisis de costos/beneficios y fundamentación, lo siguiente:
1) Evaluación de Beneficios: Objetivos realistas y alcanzables acorde a la metodología a desarrollar cuya finalidad directa o indirecta esté basada en “el avance del conocimiento, la protección de la salud y/o el bienestar de los hombres y de los animales” (Principios Éticos Internacionales para la investigación biomédica con Animales - CIOMS (1949) http://www.cioms.ch/frame_1985_texts_of_guidelines.html, 09/Febrero/2010).
2) Disponibilidad de recursos: Dado que los animales pueden sufrir como consecuencia de los procedimientos experimentales es, el investigador el responsable de emplear las técnicas disponibles que minimicen el potencial dolor o malestar que padecen los animales durante el desarrollo experimental, como también de proveer adecuadas condiciones de manejo y confinamiento.
3) Evaluación de costos o daños implícitos: Aplicación de los principios implícitos en las tres “Rs” de Russell & Burch (1959):

3.1 Reemplazo
Utilización de técnicas alternativas que puedan aportar el mismo nivel de información que el obtenido en procedimientos con animales y que no impliquen el empleo de estos. Los tipos de reemplazo pueden ser diversos y pueden incluir:
Reemplazo Total: No se requiere el uso de animales, ejemplos de estos son:
Eficiente uso de la información existente: Base de datos disponibles, protocolos y estudios previos (evitar la duplicidad experimental). Independientemente de los resultados del estudio, el investigador tiene la obligación ética de comunicar los resultados obtenidos y la metodología utilizada sobre todo si esta implica sufrimiento animal y no conduce a resultados exitosos.
Modelos Matemáticos de Predicción: Como lo son Estudios de cinética ambiental, Fármaco-toxicocinética, PB-PK/PD (Physiologically Based Pharmacokinetic/Pharmacodynamic)
Modelos computacionales, audiovisuales o mecánicos
Empleo de organismos vegetales (plantas o algas) y unicelulares (bacterias, hongos, protozoos).
Técnicas Físico-químicas
Métodos In Vitro: Cultivos celulares de líneas inmortales/ transgénicas.
Estudios en Humanos (muestras o tejidos, estudios preclínicos, procedimientos no invasivos).
Reemplazo Relativo: Es necesario sacrificar un animal para la obtención de órganos, tejidos y células para estudios in Vitro.
Reemplazo Parcial: Implica el empleo de animales de baja escala filogenética, por ejemplo invertebrados, como también el empleo de ensayos pilotos o el uso de métodos
no-animales en una etapa previa al desarrollo experimental propiamente tal.

3.2 Reducción
La reducción se refiere a la exigencia científica, moral y legal (en algunos países) de utilizar pocos animales sin invalidar la significancia estadística de los resultados experimentales obtenidos a partir de ellos. El empleo de estudios pilotos pueden reducir dramáticamente el número de animales empleados en un ensayo experimental, como también el empleo de test estadísticos que evalúen varios factores simultáneamente, los cuales sirven para garantizar que el tamaño muestral sea el adecuado, grupos demasiado pequeños o grandes representan un mal uso de los animales de experimentación ya que generan sufrimiento innecesario.

El diseño racional y eficiente del modelo experimental a utilizar, que implica: la adecuada selección de la especie a emplear de acuerdo los objetivos planteados. La tendencia actual es al empleo de animales genéticamente modificados o a los cuales se les han incorporados genes foráneos que simulan procesos patológicos animales o humanos, como también al empleo de animales estandarizados tanto genética como microbiológicamente, ya que disminuyen la variabilidad de los resultados obtenidos y por ende garantizan reproducibilidad de los ensayos. La elección de una especie inapropiada puede invalidar los resultados obtenidos y por ende es ética y científicamente inaceptable.

El impacto de las condiciones de confinamiento en la variabilidad experimental y en el número de los animales de experimentación deben ser considerados, teniendo cuenta no solo las normas mínimas establecidas en la legislación sino que también las necesidades conductuales y sociales propias de la especie a estabular.

Estabulaciones o condiciones de confinamiento inadecuadas pueden causar alteraciones
fisiológicas y conductuales en los animales y su vez en la validez y aplicabilidad
de los resultados experimentales. Dentro de los factores que deben considerarse son: espacio mínimo disponible por animal en jaulas o corrales, tamaño y estructura de los grupos, control de parámetros ambientales (temperatura, humedad relativa, foto-período, recambios de aire/hrs., ruidos), el empleo de dietas balanceadas y certificadas apropiadas a la especie a confinar al igual que los lechos o material de cama. Para mayor información revisar publicaciones de Hume C, (1972); Lang CM et al (1977); Van Zutphen LFM et al. (1993); Zúñiga M et al (2001); Svendsen P y Hau J (1994).

3.3 Refinamiento
Procedimientos que permiten aliviar o minimizar el posible dolor o malestar y que garanticen el bienestar de los animales durante todo el protocolo experimental, por lo que el empleo de
técnicas no invasivas deberían ser de elección.
La determinación del grado de invasividad de los procedimientos que se realicen depende de varios factores: naturaleza, duración nivel de cambios que produzcan (como afectan al animal), frecuencia; los sistemas biológicos involucrados y sus consecuencias en términos de dolor y estrés en el animal (receptores nociceptivos involucrados); interferencia con necesidades básicas o particulares del animal o de la especies y sus repercusiones posteriores; etc. (Baumans V. et al. (1994), Morton DB & Townsend (1995), Sanford J et al. (1986), Zimmermann M (1983). Si bien es cierto una forma fácil de determinar la severidad de un procedimiento sería aplicar el sentido común y basarnos en el principio de analogía, donde aquellos procedimientos que causen dolor o sufrimiento un ser humano serian también susceptibles de causarlo en un animal, sin embargo, dada la diversidad las especies empleadas en investigación científica y de criterios que pueden ser aplicados es, que diferentes niveles de valoración sobre la afección o severidad que producen ciertos procedimientos experimentales han sido publicados, la mayoría tendientes a categorizar en baja, media o alta el nivel de severidad implícito en el protocolo experimental ya sea antes, durante o después de su aplicación (ver tablas Nº 1, 2 y 3).

Tabla 1. Parámetros utilizados para valorar la severidad de un procedimiento experimental
(Wallace et al., 1990) La severidad total es la suma de las puntuaciones. Si la puntuación es inferior a 8, el procedimiento se considera de severidad baja; entre 8 y 20, el procedimiento es de severidad intermedia; y si es superior a 20, el procedimiento es de severidad alta.
Parameters used to value the severity of an experimental procedure (Wallace et al., 1990). The total severity is the sum of all scores. If the score is below 8, the procedure is considered of low severity; if it between 8 and 20, the procedure is of intermediate severity; and if it is above 20, the procedure is of high severity.
Parámetro Rango de Puntuación
Antes del procedimiento
Animal consciente / inconsciente 1 / 0
Anestesia 0 - 4
Preparación (ej: ayuno prequirúrgico) 0 - 2
Inmovilización 0 - 4
Duración 0 - 2
Sensibilidad del tejido 0 - 2
Riesgo para el órgano 0 - 2
Riesgo de mortalidad 0 - 4
Dolor 0 - 5
Estrés 0 - 5
Restricción de conducta 0 - 5
Después del procedimiento
Dolor 0 - 5
Estrés 0 - 5
Restricción de Conducta 0 - 5

De acuerdo a Wallace et al (1990) The assessment and control of the severity of scientific procedures on laboratory animals; Lab Anim 24(2): 97-130; doi:10.1258/002367790780890185 [PDF] (http://la.rsmjournals.com/cgi/reprint/24/2/97, 09/Febrero/2010) .

Tabla Nº2 Signos Clínicos según procedimiento, intensidad y duración del dolor, según Basic Surgery Guidelines for Animal Research.
Institutional Animal Care and Use Committee (http://ovprc.howard.edu/offices/huiacuc.html, 09/Febrero/2010.)
Procedimiento
Signos
Intensidad
Duración
Cabeza, oído, dientes,
nariz, faringe y laringe
Agitación; rehúsa el movimiento o lo hace en forma errática;
posición anómala
de cabeza o cuello, auto-mutilación;
dificultad para prender, masticar o deglutir el alimento
Moderada a Alta
Intermitente
Oftálmico
Revolcarse, rehúsa el movimiento, se protege, rascado, auto-mutilación.
Alta
Intermitente a
continuo
Ortopédico
Postura anormal o cojera, rehúsa el movimiento, se protege,
lamido, auto-mutilación.
Moderada
Intermitente
Abdominal
Anorexia, vómitos, postura anormal, se protege.
Leve a Moderada
Intermitente
Cardiovascular
Rehúsa el movimiento.
Leve a Moderada
Continuo
Torácico
Rehúsa el movimiento, ansiedad, cambios en la frcía. respiratoria.
Leve a Moderada
Continuo
Peri-rectal
Auto-mutilación, intenta huir morderse o lamerse.
Moderada a Alta
Intermitente a continuo

Tabla Nº3 Sensibilidad al dolor de los diferentes tejidos
Ojos, oídos, dientes
+++
Nervios
+++
Testículos
+++
Médula espinal
++ a +++
Piel
++ a +++
Membrana serosas
++ a +++
Periosteo
++ a +++
Vasos Sanguíneos
++ a +++
Vísceras
+ a +++
Músculos
+ a ++
Articulaciones y huesos
+ a ++
Tejido cerebral
-
Sensibilidad Baja (+), Media (++); Alta (+++).; de acuerdo a The assessment and control
of the severity of scientific procedures on laboratory animals; Lab Anim 24(2): 97-130; doi:10.1258/002367790780890185 [PDF] ( http://la.rsmjournals.com/cgi/reprint/24/2/97, 09/Febrero/2010) . Disponible en la página web del Comité de experimentación
Animal de la Universidad de Zaragoza, España.
(http://cea.unizar.es/Disenos_experimentales/Anestesia%20y%20analgesia/Evaluacion_
dolor/Sensibilidad_al_dolor.pdf , 09/Febrero/2010).

En cuanto a la duración de los procedimientos experimentales que ocasionen discomfort
en el animal, tales como: infestaciones experimentales, restricciones hídricas
o nutricionales (en cantidad y calidad), deprivación social y/o ambiental y exposición
a estímulos adversos (miedo, estrés inducido, etc.), el tiempo de exposición a estos procedimientos y la gravedad debieran minimizarse.

Lo mismo se aplica a la frecuencia y a las técnicas que se apliquen a la toma de muestras fisiológicas (tabla Nº4). Debieran preferirse aquellas que sean menos invasivas
(orina, heces, saliva, pelo, etc.) y cuando se requieran muestreos seriados, que impliquen algún nivel de invasividad, el investigador deberá considerar los volúmenes totales a extraer, uso de técnicas telemétricas, implantación de catéteres permanentes (con anestésicos y analgésicos apropiados), a fin de resguardar el bienestar animal. Igualmente, según la especie seleccionada y en la medida que sea posible, los animales deben ser entrenados con anticipación para reducir el miedo asociado con los procedimientos (Guerrero J. & Manteca X. 2000).

Tabla Nº 4 Nivel de Severidad de los procedimientos experimentales según escala Holandesa
Disponible en la página web del Comité de experimentación Animal de la Universidad
de Zaragoza, España.
(http://cea.unizar.es/Disenos_experimentales/Anestesia%20y%20analgesia/Evaluacion_
dolor/ESCALA_HOLANDESA_Severidad.pdf, 09/Febrero/2010).
Severidad baja
Severidad media
Severidad alta
Obtención de muestras de sangre.
Obtención repetida de
muestras de sangre
Obtención de líquido ascítico
Exploración rectal.
Test de pirógenos
Privación prolongada de agua, alimento o sueño.
Frotis vaginal.
Recuperación de una
intervención quirúrgica
Inducción de tumores.
Radiografías.
Inmunización con adyuvante incompleto.
Aplicación de estímulos
dolorosos.
Administración oral de sustancias
inocuas.
Inmovilización.
Pruebas de LD50.
Inmunización sin adyuvante.
Implantación de cánulas o catéteres.
Inmunización con adyuvante completo.
Experimentos terminales bajo anestesia.
Algunas infecciones experimentales.

Es de crucial importancia que las personas que vayan a participar en el estudio estén capacitadas y calificadas en el cuidado de los animales de experimentación, indicadores de dolor y malestar de la especie seleccionada, procedimientos experimentales a desarrollar, administración y aplicación de medidas paliativas y leyes existentes. Si bien esta responsabilidad recae principalmente en los técnicos y científicos o directores del proyecto de investigación y de la supervisión del medico veterinario a cargo, de acuerdo a las directrices establecidas por algunos países Europeos y Norte Americanos todo el personal que participe en un proyecto experimental debe contar con las licencias respectivas para la actividad que va a desarrollar y orientadas a las necesidades propias de las especies a utilizar en cuanto a cuidados básicos, condiciones de confinamiento, características de de dolor, etc.).


La Federación europea de Asociaciones en Ciencias de animales de Laboratorio (FELASA) distingue 4 categorías al respecto de acuerdo a las responsabilidades y actividades que les corresponde desarrollar:
Categoría A: personas al cuidado de los animales.
Categoría B: personal técnico que realizan experiencias con animales.
Categoría C: personas responsables de dirigir experiencias con animales (Requerimiento
mínimo es ser graduado en alguna disciplina biomédica o universitario o maestría con no menos de 80 hrs de curso en la ciencia de animales de laboratorio).
Categoría D: Personas especialistas en la ciencia de los animales de laboratorio. Si bien el nivel mínimo para aspirar a esta categoría es poseer el titulo de Biólogo, o graduado en alguna de las Ciencias Biomédicas, o en el área de la medicina veterinaria
siendo en este último en el que recae la mayor responsabilidad ya que es el eje esencial del programa de cuidado y uso de los animales que incluye la aplicación de programas de medicina preventiva; vigilancia, diagnóstico, tratamiento y control de enfermedades, incluyendo el control de zoonosis; manejo de enfermedades asociadas al protocolo de investigación, discapacidades y otras secuelas; aplicación de adecuadas técnicas de anestesia y analgesia; supervisión en cirugías y cuidado postquirúrgico; evaluación del bienestar animal y aplicación de técnicas de eutanasia cuando sea necesario. Mayor información al respecto puede ser extraída de la Guía para el cuidado u uso de los Animales de Laboratorio (1996) del National Research Council (http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=10929) o directamente de la p{agina web de la Felasa (http://www.felasa.eu, 09/Febrero/2010) donde aparecen detalladas las recomendaciones para cada categoría Wilson MS et al (1995); Nevalainent T et al. (1999) y Nevalainent T et al. (2000).

Protocolos de supervisión
Se puede definir como el monitoreo sistemático de los indicadores de dolor o malestar
producido por el procedimiento experimental y/o condiciones ambientales, a través del uso de indicadores fisiológicos, bioquímicos y conductuales, cuya tabulación y sumatoria en forma conjunta señalan el estado de bienestar animal (ejemplo en tabla Nº 7). Deben ser aplicados en todos los procedimientos experimentales, especialmente, aquellos considerados de severidad media o alta y donde los animales sean mantenidos en forma conscientes y por cierto periodo de tiempo. Los hallazgos encontrados en cada animal deberán ser anotados en un ficha supervisión, la cual podría incluir dentro sus parámetros: Postura del animal, aspecto del pelo o plumas; presencia de secreciones o laceraciones, Conducta del animal incluyendo vocalizaciones, conductas anormales o estereotipas, incluyendo su respuesta a la manipulación o a estímulos externos, Consumo de alimento y agua, Características de sus deposiciones (heces, orina),

Ganancia o pérdida de peso (Morton & Griffith, 1985; CCAC, 1993).
Independiente de los parámetros a considerar estos deben estar adaptados a la especie
a utilizar y en concordancia al protocolo experimental, por ejemplo después de un procedimiento quirúrgico es importante incluir aspectos de la zona de abordaje (por ejemplo: integridad del material de sutura, presencia de secreciones, edematización, etc.). Se debe evitar el empleo de parámetros demasiados amplios, cuya puntuación quede a criterio del observador, por ejemplo, “aspecto del animal”: normal o medianamente desmejorado ¿Cómo se determinara que características o condición marcará la diferencia?, siendo esta discrepancia la clave para instaurar medidas paliativas tempranamente o determinar si el criterio de punto final se ha alcanzado.

La frecuencia de observación dependerá de las circunstancias, por lo general los animales
mantenidos en confinamiento deberían supervisarse diariamente. La periodicidad
deberá incrementarse cuando se detecten detrimentos en la salud y bienestar de los animales, luego de un procedimiento experimental invasivo.

Dado que el bienestar animal será valorado a través de la puntuación que le demos a determinados indicadores de bienestar animal (tabla Nº 5), es importante tener un cabal conocimiento de las características conductuales normales y signos de dolor o diestres de la especie con que van a trabajar, ya que existen algunas, como los conejos, que por ejemplo, no exteriorizan los signos de malestar o sufrimiento pese a estarlos padeciendo (Tabla Nº 6). Se recomienda consultar National Researchs Counsil (1992), CCAC (1993), ODEC (2000). y Wallace J et al. (1990), para más información al respecto. Deben quedar pre establecidas las medidas de contención a aplicar, criterios de punto final o Human End Point (HEPs) y el método de eutanasia a aplicar, que no causen interferencia con el procedimiento experimental.

Tabla Nº5 Indicadores conductuales, fisiológicos y bioquímicos de Bienestar Animal
Conductuales
Fisiológicos
Bioquímicos
Grooming (acicalamiento).
Temperatura.
Corticosteroides.
Apetito (anorexia, polidipsia, pica).
Pulso.
Catecolaminas.
Actividad (parálisis, agitado, aletargado, convulsiones).
Frecuencia Respiratoria y Cardiaca.
Tiroxina.
Agresión (huida, inmovilidad).
Perdida de peso.
Prolactina, LH
Expresión Facial y corporal (enseñar dientes, posición orejas).
Conteo de células sanguíneas.
b-Endorfinas.
Vocalización (gruñidos, alaridos,
jadeo).
Estructura de células sanguíneas.
ACTH.
Apariencia (secreciones oral/nasal, heridas, edemas, pelaje)
Grado de hidratación (hundimiento ocular).
Glucagón.
Postura (inusual, encorvado, extendido).
Presión sanguínea.
Insulina.
Respuesta al manejo.
Micción y defecación (heces irregulares, frecuencia).
Angiotensina.

Tabla Nº6 Indicadores de dolor por especie
Especies
Comportamiento General
Apariencia
Fisiológicos
Ratas
Reduce actividad; reduce apetito; reduce ingesta de agua; guarda las extremidades;
auto-mutilación; incrementa la agresividad y vocalizaciones; aversión a la manipulación, se aisla del grupo
Falta de acicalamiento;
pilo erección; abdomen hundido, postura encorvada, secreción porfirínicas a nivel ocular y nasal; parpados parcialmente cerrados; pupilas dilatadas; animal de cubito lateral
Sueño interrumpido; hipotermia; respiración superficial y rápida, puede emitir algún sonido durante la expiración
Ratones
Similar a la rata; incrementa el movimiento de las vibrisas
Similar a la rata; secreción porfirínicas ocular no tan evidente
Similar a la rata
Cobayos
Chillidos, evade el contacto con estampida; o se mantiene quieto
Similar a la rata
Similar a la rata
Conejos
Ansiedad; se esconde o evade el contacto; chichilos o gritos; o agresividad; rasguños/
mordidas; reduce apetito; canibalismo de crías; inmovilidad tónica
Puede no mostrar grandes cambios
Salivación; respiración superficial y rápida
Perros
Muerde, rasguña, gruñe o aúlla o llora; quieto, posición a la defensiva, sumiso; o mas agresivo a la manipulación
Quieto, se mueve sigilosamente; look “intimidante”; con la entre medio de las piernas
Tremores; aumento de frecuencia cardiaca y respiratoria; se orina
Gatos
Quieto; maúlla o gruñe; eriza los pelos; se lame excesivamente; guarda las extremidades;
se mueve sigilosamente; reduce apetito; respuesta de escape a la manipulación
Expresión facial de aprensión; falta de acicalamiento, aplana las orejas;
Aumento de frecuencia cardiaca y respiratoria.

Tabla Nº 7 Protocolo de Supervisión adaptado para ratones en ensayo de infección bacteriana
Variables a considerar
Observaciones
Puntuación
Periodicidad
DATOS FISIOLOGICOS:
Pérdida de peso corporal
Normal (no hay pérdida de peso corporal)
Pérdida de peso inferior al 10%,
Pérdida de peso entre 10-20%. Posible disminución en la ingesta de alimento
Pérdida de peso superior al 20%. El animal no consume agua ni alimento
0
1
2
3
Diario
ASPECTO
Postura
Normal (erguido, se cuelga en su jaula, pelaje lustroso)
Evita moverse, pelaje hirsuto,
puede que haya secreción porfírica en nariz y ojos (roja).
Encorvado, inmóvil al fondo de la jaula, abúlico, pelaje hirsuto,
secreción porfírica de nariz y ojos (roja)
Postrado, decúbito lateral, deshidratación
evidente, ojos hundidos
0
1
2
3
Diario
COMPORTAMIENTO
ESPONTANEO
Actitud frente a estímulo
Normal: Atento al medio, interactúa con sus pares, se acicala
Pequeños cambios: reduce el acicalamiento y el desplazamiento, movimientos respiratorios rápidos, tiende a quedarse en el fondo de la jaula
Desplazamiento tambaleante, inactivo
o retraído al fondo de la jaula, respiración abdominal
Animal inmóvil, postrado de cubito lateral, abre la boca al respirar
0
1
2
3
Diario
Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 77
Puntuación Total de 0 a 9
Nota:
Cuando el animal obtiene una puntuación de 3 en más de un parámetro, todos los “3” pasan a “4”. Medidas correctoras sugeridas de acuerdo a la puntuación obtenida para cada animal son las siguientes:
Puntuación
De 0 a 3 Normal
De 4 a 6 Supervisar cuidadosamente (¿analgésicos?)
De 7 a 9 Sufrimiento intenso. Analgésicos (¿eutanasia?)
De 10 a 12 Eutanasia (¿Suprimir el experimento?)
Las mediciones serán realizadas por personal capacitado y que conoce el comportamiento habitual de los animales.
CONSTANTES
VITALES
Normal
Pequeños Cambios
Incremento en la temperatura corporal en 1-2º C , incremento en un 30% en la frecuencia cardiaca o respiratoria
Incremento en la temperatura corporal en >1-2º C , incremento
en un 50% en la frecuencia cardiaca o respiratoria (310-840 lpm – 60-220 rpm)
0
1
2
3
Diario

Criterios de punto final: Aplicación de eutanasia anticipada.
Los criterios de punto final permiten al investigador decidir si un animal deber ser sacrificado o retirado del estudio antes de terminar la investigación. Deben ser determinados antes que comience el protocolo experimental, ser concordante con los objetivos planteados y son un requisito indispensable en aquellos procedimientos susceptibles de causar dolor o sufrimiento intensos y en los que no pueda utilizarse analgesia u otras medidas paliativas.
La muerte o estadios moribundos no debieran ser considerados como punto final de un estudio. Se puede aplicar el principio de analogía en su determinación, sobre todo cuando existe evidencia que determinados procedimientos causan dolor y sufrimiento en el hombre.
Como se señaló anteriormente, estudios pilotos deben fomentarse como medio para determinar la morbilidad, presentación y/o evolución de los efectos y frecuencia de observaciones que serán requeridas para determinar primeramente el criterio de punto final a utilizar.

Criterios de punto final:
Puntuación entre 8-12 debieran ser indicadores de que el animal presenta un deterioro
significativo o sufrimiento intenso, por lo cual la aplicación de algún método de eutanasia deberá ser considerado. En la eventualidad de que esto ocurriese, éste se realizará mediante sobredosis anestésica o dislocación cervical (para este ejemplo).
Dada la especie seleccionada, el empleo de constantes vitales como indicadores de dolor o malestar fueron obviados del modelo original diseñado por Morton & Griffiths
(1985), ya que si bien pueden verse afectadas tras el procedimiento experimental su determinación requiere de la implementación de técnicas computarizadas o las telemétricas, por ejemplo la frecuencia cardiaca y respiratoria de una ratón fluctúa entre 310-840 latidos por minuto y 163 (60-220) respiraciones por minuto, respectivamente, por lo que si este rango incrementara en un 50% difícilmente podrá ser contabilizado a través del oído u ojo humano.

Todo el personal involucrado en la realización de los procedimientos deben estar capacitados e informados acerca del criterio establecido y ejecutarlo responsablemente.
La(s) persona(s) que serán las encargadas de monitorearlo y determinarlo deben quedar designadas previo al desarrollo experimental.
El lector más interesado encontrará información en Canadian Council of Animal Care (1998), Morton & Griffiths (1985), Morton D.B (2000), Olfert ED (1995), Tomasovic S.P et al (1998), Toth L.A (2000) y Wallace J (2000) cuyos web site de donde pueden ser extraídos estos archivos se detallan en la bibliografía.

Analgesia y Anestesia.
Anestesia:
Se define como anestesia la perdida total de las sensaciones corporales de una parte orgánica o en su totalidad, inducida normalmente por un fármaco que deprime la actividad del tejido nervioso, ya sea localmente (periférico) o total (central). Podemos distinguir:
Anestesia General: Incluye 4 componentes básicos: Inconciencia (Hipnosis o sueño),
Analgesia, Bloqueo de la actividad refleja y Relajación muscular (inmovilidad). Dado que las drogas no cumplen con estos criterios a cabalidad se opta por el empleo de una anestesia poli modal que en combinación y sinergia de diferentes fármacos se logra una anestesia con menor dosis y menos efectos adversos.
Anestesia Regional: Limitada a un área anatómica, generalmente una extremidad o parte de ella.
Anestesia Local: Limitada a una zona reducida.
Objetivos de la Anestesia
- Facilitar la manipulación del animal o la realización de procedimientos invasivos.
- Proporcionar un trato humanitario a los animales, reduciendo al mínimo el sufrimiento
asociado a la manipulación y evitando situaciones estresantes y dolorosas.
- Reducir al mínimo las consecuencias negativas de la cirugía o procedimientos invasivos sobre la fisiología del animal.
- Permitir la realización de investigaciones que no podrían llevarse a cabo con el animal consciente.
Secuencia de las fases de una anestesia
Valoración Pre-anestésica
• Especie: Animales estrésales cuyo tono simpático incrementado pueden limitar la eficacia de algunos tranquilizantes.
• Estado del animal (edad, estado sanitario, alteraciones fisiológicas: enfermedades respiratorias crónicas, falla hepática o renal).
• Objetivo de la investigación y Tipo de procedimiento.
• Duración del procedimiento: Cuando un procedimiento quirúrgico tenga una duración
mayor a 30 minutos se debe proporcionar al animal sueros glucosados (10-20 ml/kg) para evitar la hipoglucemia y deshidratación, preferentemente administrados
vía endovenosa (ev) o alternativamente intra peritoneal (ip) o subcutánea (sc)
•Experiencia del investigador y equipo disponible: Emplear métodos menos estresantes,
disminuir el manejo y trabajar en ambientes tranquilos.
• Ayuno: Normalmente innecesario en roedores y conejos, ya que no vomitan (si fuese necesario no más de 1-4 hrs. en cobayos y conejos respectivamente). Por su metabolismo elevado desarrollan rápidamente hipoglucemia, la cual se debe evitar, ya que influye en la recuperación anestésica y en la sobrevida del animal.
Procedimientos perioperatoria:
• Terapia de soporte.
• suplementación de fluidos.
• Protección ocular: cuando se emplea ketamina los animales mantienen los párpados
abiertos, por lo que se puede producir abrasión y resequedad corneal, se recomienda
el empleo de lágrimas artificiales.
• Prevenir hipotermia:- Los roedores anestesiados pueden bajar su temperatura corporal 10 -15ºC en 20 minutos por lo que se les debe proporcionar calor externo mediante ventiladores de aire caliente, lámparas, botellas de agua, mantas plásticas, etc.
• Asepsia e la zona de abordaje:- Rasurar el área imprescindible compatible con la técnica quirúrgica a fin de evitar pérdidas de calor. Por lo mismo emplear desinfectante
templado y evitar soluciones con base alcohólica.
• Evitar sobredosificar:- Pesar con precisión utilizando instrumentos calibrados.
El empleo de estos procedimientos sumados al uso de inhibidores de la secreción salival
(anticolinérgicos bloqueadores de la estimulación parasimpática), sedantes y/o
Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 81
tranquilizantes permiten un mejor manejo animal al reducir la ansiedad y el miedo que les pueda ocasionar el procedimiento experimental, como también, reducen los efectos adversos ocasionados por algunos anestésicos, disminuyen las dosis a utilizar y por ende los riesgos que conllevan su uso. Su empleo debe ser sopesado dependiendo de la especie seleccionada.
A continuación se anexan las Tablas Nº 8, 9 10 y 11 donde se entrega un listado de drogas comúnmente utilizadas en procedimientos anestésicos que incluye: anticolinérgicos
(reducen la secreción salival), tranquilizantes y anestésicos de aplicación local, regional o general y combinaciones de éstos, con sus respectivas dosis terapéuticas,
duración de fase anestésica y efectos a nivel sistémico que causan en las especies más utilizadas en investigación científica. La información sobre las drogas seleccionadas, sus respectivas dosis terapéuticas en las diferentes especies, efectos que producen a nivel fisiológico y las consideraciones que se deben preveer en su uso han sido extraídas principalmente de las publicaciones realizadas por Flecknell, P.A. (1994 y 1996), Flecknell, P.A.et al (2000), Svendsen P. and HAU J. (1994), ZUÑIGA JM, e.t al. (2001) y de la guía para el Cuidado y uso de Animales de Experimentación del Consejo Canadiense en cuidado animal (CCAC,1993). Igualmente se recomienda consultar las pautas y procedimientos estandarizados de algunas universidades extranjeras que han sido aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado Animal y que se pueden visitar desde su pagina web (http://www.iacuc.org, 09/Febrero/2010).

Ratón
Rata
Hámster
Cobayos
Conejos
Anticolinérgicos
Atropina
0.02-0.05 mg/kg sc, im, ev.
0.05 mg/kg; sc, im, ip.
0.05-0.5 mg/kg; sc, im, ip.
0.02-0.05 mg/kg; sc.
0.05-0.5 mg/kg; sc. 0.04-2.0 mg/kg IM, SQ (inactivada por atropinasa
en el 60% de los animales)
Glicopirrolato
0.01-0.02 mg/kg; sc.
0.5 mg/kg; im.
0.01-0.02 mg/kg; sc.
0.01 mg/kg; im.sc
Tranquilizantes
Acepromacina
1-2.5 mg/kg; sc, ip.
1-2.5 mg/kg; im.
5-10 mg/kg; sc, im, ip.
0.75-10 mg/kg; im.
Diazepam
5 mg/kg; ip
2-4 mg/kg; ip, ev, im.
2.5-5 mg/kg; im, ip.
5-10 mg/kg; im.
Xylacina
3-9 mg/kg; ev, im.
Anestésicos Inyectables
Ketamina
50-100 mg/kg; ip, ev. (sedación).
50 mg/kg; im (sedación)
50-100 mg/kg IM
40-100 mg/kg IP (efecto
sedante)
200 mg/kg IP (anestesia)
40-50 mg/kg; im
40-200 mg/kg IM
44 mg/kg; im. 15-20 mg/kg;ev.
20-60 mg/kg; im
Ketamina + Xylacina
80-100 mg/kg + 16-20 mg/kg; ip.
40-90 mg/kg 5-15 mg/kg, ip.
75-90 mg/kg (anestésico) + 5-8 mg/kg; im.
80-100 mg/kg + 7-10 mg/kg, ip
44 mg/kg + 5.0 mg/kg; im.
50 mg/kg + 5 mg/kg ip.
35 mg/kg + 5 mg/kg; im.
22-50 mg/kg + 2.5-10 mg/kg; im.
Ketamina + Xylacina + Acepromacina
100 mg/kg + 20 mg/kg + 3 mg/kg; ip.
22-44 mg/kg + 2.5 mg/kg + 0.75 mg/kg; im.
35-40 mg/kg + 3-5 mg/kg; im.+ 0.75-1 mg/kg; im.
Tabla Nº 8: Drogas (mg/kg) empleadas en anestesia de roedores y lagomorfos
Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 83
Ketamina + Diacepan
45-75 mg/kg + 5-10 mg/kg; ip
30 mg/kg + 5 mg/kg; im. (sedation, leve analgesia).
60-80 mg/kg + 5-10 mg/kg im.
Barbitúricos
Pentobarbital
30-40 mg/kg;
ip.(sedación).
50-90 mg/kg; ip. (estrecho margen de seguridad)
30-40 mg/kg: ev. (a efecto)
40-60 mg/kg; ip.
80 mg/kg; ip.
70-90 mg/kg; ip.
40 mg/kg; ip.
15-40 mg/kg; ip.
25-45 mg/kg; ev. (en solución diluida).
20-60 mg/kg ev; (solución al 2-3% )
Tiopental
30-40 mg/kg; ev.
20-30 mg/kg; ev.
20-40 mg/kg; ev
40 mg/kg;ip
20 mg/kg; ev.
30 mg/kg; ev.
15-30 mg/kg; ev. (Solución al 1%).
50 mg/kg; ev. (Solución
al 2.5%).
Otros
Tribromoethanol (Avertina)
125-250 mg/kg; ip
300 mg/kg; ip
Propofol
12-26 mg/kg; ev.
7.5-10 mg/kg; ev. (inducción), 44-55 mg/kg/hrs. (infusión continua)
10 mg/kg; ev.
1.5 mg/kg efecto sedante; 0.2-0.6 mg/kg/min para infusión continua.
84 CONICYT 2009
Hidrato Cloral
60-90 mg/kg; ip.
300-450 mg/kg; ip solución
al 5%
Alfa-Cloralosa
114 mg/kg; ip.
130 mg/kg; ip.
9-10 mg/100g; ip.
70 mg/kg; ip.
80-100 mg/kg; ip.
Uretano
1-2 g/kg; ip.
1000-1500 mg/kg; ip.
1-2 g/kg; ip.
150 mg/100g; ip.
0.5 g/kg; ip.
1-2 g/kg; ip.
Anestésico
Inhalable
Isoflurano
(recomendado)
Inducción: 4-5 %.
Mantención: 1.5-3%.
Inducción: 4-5%.
Mantención: 1-2%.
1-4% a efecto
Inducción: 5 %.
Mantención: 1-2%
Inducción: 3.5 -5 %.
Mantención: 2-3.5%.
Halotano
Inducción: 4-5%.
Mantención: 1-3%.
Inducción: 4-5%.
Mantención: 1-3%.
1-3% a efecto
Inducción: 5 %.
Mantención: 1-2%
Inducción: 3 -5 %.
Mantención: 0.5-3 %.
Anestésicos Local
Lidocaína
(infusión local o aplicación tópica)
17.5 mg/kg; sc.
Adm. seriadas pueden inducir
convulsiones
: dosis >110 mg/kg.
Diluida a 0.5%, no exceder
los 7 mg/kg dosis total.
Bupivicaina
(infusión local o aplicación tópica)
38 mg/kg; sc.
Adm. seriadas pueden inducir
convulsiones:
dosis >55 mg/kg.
Diluida a 0.25%, no exceder los 8 mg/kg dosis total.
Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 85
Tabla Nº 9: Características de las principales drogas anestésicas y analgésicas empleadas
Agente
Categoría
Cardiovascular
Pulmonar
Consideraciones
Contraindicaciones
Acrepromacina
Fenotiazina, agente neuroléptico,
tranquilizante
Hipotensión, arritmia cardiaca,
shock.
Mínima
Disminuye el umbral de convulsiones,
Promueve la hipovolemia
Enf. Hepática, deshidratación, hipovolemia, enf. Cardiaca, shock, cuadros convulsivos,
edad del animal (viejos, crías).
Alfa-cloralosa
Procedimientos sin sobrevida
Sulfato
atropina
Agente anticolinérgico,
antimuscarínico
Taquicardia (alta dosis)
Bradicardia (dosis
inicial baja)
Hipertensión
Hipotensión
Arritmias
Mínima
Dosis baja:- Inhibe la salivación y las secreciones
bronquiales
Dosis Moderadas: Dilatación pupilar y aumenta
frcia. Cardiaca
Dosis alta:- Decrece motilidad tracto urinario
y gastrointestinal
(secreción)
Esta desaconsejado
en conejos debido
a la enzima atropinasa.
Buprenorfina
Opiáceo agonista
parcial, Analgésico
Mínima
Depresión respiratoria
Afecta Sist. De termorregulación
Pacientes debilitados
severamente
Diazepam
Benzodiazepina
tranquilizante
Mínima
Mínima
Hipotensión
Pacientes debilitados
severamente.
Fentanilo
Opiáceo agonista
Analgésico
Mínima
Depresión respiratoria
Afecta Sist. De termorregulación
Pacientes debilitados
severamente.

Flunixin
AINE
Mínima
Mínima
Usar con precaución en pacientes con preexistencia
de úlceras gástricas, enf. Renal, hepática o hematológica.
No usar en gatos.
Glicopirrolato
Agente anticolinérgico, antimuscarínico
Taquicardia (alta dosis)
Bradicardia (dosis
inicial baja)
Hipertensión
Hipotensión
Arritmias.
Mínima
Dosis baja:- Inhibe la salivación y las secreciones bronquiales.
Dosis Moderadas: Dilatación pupilar y aumenta
frcia. cardiaca
Dosis alta:- Decrece motilidad tracto urinario y gastrointestinal
(secreción).
Duración de acción más prolongada que la atropina.
Hidrato de Cloral
Concentración sobre el 5% causa peritonitis; Dosis anestésica muy cerca de la dosis letal. Solo para uso en procedimientos sin sobrevida

Isoflurano
Agente inhalable
para anestesia general
Mínima
Mínima
Hipotensión y disminución del rengo respiratorio (a dosis dependiente)
Cuando es empleado en combinación con succinilcolina aumenta la incidencia de hipertermia maligna.
Ketamina
Agente anestésico
general de tipo disociativa.
Incrementa frecuencia cardíaca y presión sanguínea. En algunos casos depresión miocárdica
directa
Puede causar apnea cuando es dada vía endovenosa.
Salivación profusa, rigidez muscular, analgesia visceral pobre, puede producir alusiones vividas o cuadros convulsivos a altas dosis.
Nunca debe ser usada sola, salvo en gatos y primates no humanos. No emplear en animal con historial de convulsiones.
Ketoprofeno
AINE
Mínima.
Mínima.
Puede ocasionar daño y ulceración de la mucosa gástrica.
Puede elevar falsamente los niveles de glucosa, bilirrubina o disminuir los de fierro sérico.
Pentobarbital (nembutal)
Anestésico general con buen efecto hipnótico. Mala analgesia.
Depresor cardiovascular.
Depresor respiratorio.
Depresor cardio-respiratorio y proporciona escasa analgesia.
Propofol
Anestésico, induce corto efecto hipnótico.
Depresión miocárdica, hipotensión.
Apnea
A dosis repetidas en gatos produce formación de cuerpos de heinz. Su adm. rápida vía e incrementa incidencia de apneas.
No tiene

Tiopental
Anestésico general con buen efecto hipnótico. Mala analgesia
Depresor cardiovascular
Depresor respiratorio
Depresor cardio-respiratorio y proporciona escasa analgesia e hipotermia. A dosis repetida se acumula en tejidos grasos.
Tilet Tribromoethanol (Avertin)
NO redosificar Debe ser preparada asépticamente, adecuadamente almacenada, fallas en ambos procedimientos puede producir peritonitis, hepatotoxicidad e ileus en los animales.

Uretano
Carcinogénico y mutagénico; Solo para uso en procedimientos sin sobrevida

HCl Xylacina
Alfa 2-adrenérgico agonista; sedativo, acción analgésica moderada
Bradicardia elevada, hipotensión, disminución del gasto cardiaco.
Depresión respiratoria
Afecta la Sist. de termorregulación, hiperglicemia.
Neutraliza su efecto con Yombina
Edad del animal (viejos, crías), enf. Cardiacos, usar en bajas dosis en rumiantes.
No usar en combinación con halotano.
HCl Yombina
Alfa 2-adrenérgico
antagonista.
Mínima
Incrementa la frecuencia respiratoria
Neutraliza efecto de Xylacina

Tabla Nº 10
Tiempo de inducción y mantenimiento de la droga anestésica
Duración
Vía
Fármacos
Observaciones
Utra corta
5-10 minutos
Solo ev
Propofol, etomidato, tiopental sódico
No son buenos analgésicos
El tiopental se acumula en el cuerpo
Corta
20-30 minutos
ev, im, sc, ip
Ketamina o tiletamina, opiáceo + tranquilizante
Analgesia adecuada
Asociados a tranquilizantes
Media
1 hora
ev, ip
Pentobarbital
Anestesia superficial y estable
No son buenos analgésicos
Larga
5-10 horas
ev, ip
Hidrato de cloral, uretano
Anestesia superficial y estable
No son buenos analgésicos
El uretano es carcinogénico
Variable
Minutos-Horas
Inhalatoria
Halotano, isoflurano
Analgesia adecuada
en cualquier situación
Potente depresor cardiorrespiratorio
Extraído de ZUÑIGA JM, e.t al. (2001) Ciencia y tecnología en protección y experimentación
animal, Madrid-España, Editorial Mc Graw-Hill Interamericana Modificada
y extraída de ZUÑIGA JM, e.t al. (2001) Ciencia y tecnología en protección y experimentación animal, Madrid-España, Editorial Mc Graw-Hill Interamericana.
(*) Normalmente es administrado a través de un algodón empapado en la solución anestésica por que tanto el animal como el operador se ven expuestos directamente a los gases del anestésico. Debido al riesgo de explosión de sus vapores, no se recomienda
su uso, ya que existen otras alternativas (Flecknell, P.A.,1996, CCAC,1993).

Tabla Nº 11: Administración de anestésicos inhalatorios
Éter (*)
Halotano
Isoflurano
Características
No necesita vaporizador
En desuso
Necesita vaporizador calibrado
Muy difundido
Necesita vaporizador calibrado
Ventajas
Barato, no necesita equipo sofisticado
Manejo Sencillo
Seguro
Barato
Seguro
¿Sin efectos toxicos?
Metabolismo mínimo
0.17%
Inconvenientes
No es seguro en animales con afecciones respiratorias
Produce alteración en valores hematológicos (hematocrito), incremento en catecolaminas circulantes y glucosa plasmática
Irritante de las vías respiratorias y producir mucosidad excesiva, obstrucción y edema.
inflamable
Metabolismo elevado:-20%
Hepatotoxicidad
Hipertermia maligna
¿Abortos?
¿Hipertermia maligna?
Caro
Interferencia minima a nivel experimental

El procedimiento de anestesia no termina cuando el cirujano ha colocado la última sutura o cuando se corta el suministro del agente anestésico, si no que se da por concluido una vez que el animal ha recuperado completamente la conciencia y se evalúa su estado fisiológico. Una vez finalizada la técnica quirúrgica, es de vital importancia que el animal permanezca en un estado de sopor (sueño, letargo) por algunas horas con el fin de que la recuperación anestésica sea gradual y libre de excitación, por lo cual se debería tener en consideración:
• Área de recuperación: tranquila, calida y visible
• Evitar la hipotermia e Hipoglucemia (mantas, calefacción)
• Proporcionar fluido
• Reversión de anestesia por antagonistas
• Una vez recuperado el animal proporcionar agua y alimento
• Evaluar función gastrointestinal
• Uso de analgésicos postoperatorios: Siempre deben ser proporcionados antes de que el animal se recupere de la anestesia.
• Control y desinfección de la herida quirúrgica: empleo de desinfectantes y antibióticos.

Algunas consideraciones anestésicas en peces y anfibios
Los anestésicos generalmente utilizados son el metanosulfonato de tricaína (MS-222) y los anestésicos por inhalación (existen otras alternativas). Las dosis varían ampliamente entre especies poiquilotermas y tanto su absorción como excreción dependerán directamente de la temperatura ambiental y por ende corporal del animal.
En los peces se recomienda implementar la suspensión del alimento 24-48 horas previas a la cirugía con el fin de prevenir posibles vómitos. Generalmente anestesiados por inmersión o mediante un sistema de recirculación que pasa una solución anestésica a través de las agallas. Los anfibios pueden anestesiarse eficientemente con anestésicos locales, por inmersión en una solución anestésica o por agentes inhalables. Cabe señalar que la hipotermia inducida por frío (hielo) no debe ser considerada como un agente anestésico, ya que su efecto analgésico es difícil de determinar, puede producir daños secundarios en los tejidos expuestos directamente al hielo y existen mejores alternativas disponibles (ver Tabla Nº 12)

Se debe tener presente en los anfibios:
La piel de los anfibios actúa como una membrana semipermeable que permite la respiración y la absorción de ciertas sustancias a través de ella.
• La función pulmonar cesará durante la anestesia por lo que no se puede emplear un monitor. La respiración cutánea es suficiente para prevenir la hipoxia durante la anestesia.
• Mediante observación directa (línea media ventral caudal a los hombros).
• Los anfibios pasan por una fase de excitación durante la inducción anestésica, por lo que preveer inducirlos, en un recipiente que les impida saltar o caerse, a fin de evitar lesiones.
• No elevar la temperatura del anfibio encima de la temperatura ambiente, ya que esto aumentará la tasa metabólica y la respiración cutánea puede no ser suficiente para mantener la cantidad adecuada de oxígeno.
• No aplicar alcohol directamente en la piel, ya que disuelve las secreciones que normalmente ayudan a prevenir enfermedades.
• La piel se debe mantener húmeda todo el tiempo.
* Sumergir el animal en la solución anestésica. Una vez que el animal ha alcanzado el nivel adecuado de anestesia para el procedimiento previsto, retirar el animal desde
el baño de anestesia y enjuagar con agua fresca. Se disponen de 30-90 minutos antes que el animal se recupere de la anestesia (movilidad y retorno del reflejo de enderezamiento).
** El isoflurano se puede utilizar en una cámara de inducción, mezclados en una sustancia viscosa utilizando jalea KY y agua, o bien se embebe en una almohadilla absorbente y se aplican directamente sobre la piel del animal hasta conseguir la profundidad
anestésica deseada, luego se enjuaga la piel con agua fresca. Se disponen de 30-90 minutos antes que el animal se recupere de la anestesia inducida.

Tabla Nº 12: Anestesia en anfibios.
Anestésicos
Dosis
Comentarios
MS 222 (sulfonato metano de tricaina*)
300-500mg/L (renacuajos y tritones) 1-2g/L (ranas y salamandras) 2-3g/L (ranas y sapos)
Amplio margen de seguridad
(solución tampón con bicarbonato de sodio para mantener el pH neutro) Ver más abajo
Isoflurano**
Varias
**

Recomendaciones generales en la anestesia de animales de laboratorio
• No debe extrapolarse directamente una técnica anestésica de una especie a otra, ni del hombre a los animales.
• Debe adecuarse la profundidad anestésica a las necesidades de la intervención quirúrgica.
• La anestesia inhalatoria es en la mayoría de los casos, la técnica más útil en animales
de experimentación.
• La analgesia siempre debe considerarse intra y postoperatoriamente, en caso de que esto no sea factible debe ser justificado sobre todo cuando se ha realizado un procedimiento invasivo en los animales.
• La utilización de relajantes musculares sin asociación a un agente anestésico debe justificarse sólidamente o no deben emplearse con un procedimiento doloroso en animales conscientes
• Dado que hay drogas analgésicas y anestésicas de uso restringido o controladas bajo el criterio legal y/o venta mediante receta retenida se sugiere manejar y almacenar
con precaución. Los usuarios de estas drogas deberán obtener prescripciones a través de un médico veterinario o médico humano según sea el caso.
• Si no se tiene dominio de la técnica anestésica a utilizar se recomienda pedir asesoramiento
de un veterinario calificado.

ANALGESIA
Tabla Nº 13: Dosis de analgésicos (mg/kg) en roedores
Y lagomorfos
Ratón
Rata
Hámster
Cobayos
Conejos
Analgésicos
Buprenorfina
0.05-0.1 mg/kg; sc c/6-12 hrs.
0.01-0.05 mg/kg; sc c/6-12 hrs.
0.05-0.1 mg/kg; sc, im; c/8-12 hrs.
0.5-0.8 mg/kg; sc, c/8-12 hrs.
0.05 mg/kg; sc, im; c/6-12 hrs.
0.01-0.05 mg/kg; sc, ev; c/6-12 hrs.
Butorfanol
1-5 mg/kg; sc, c/4 hrs.
1.0-2.0 mg/kg; sc, c/4 hrs.
1-5 mg/kg; sc, im; c/2-4 hrs.
2 mg/kg; sc, im; c/2-4 hrs.
0.1-0.5 mg/kg; sc; c/4 hrs.
0.5-1.0 mg/kg; sc, im; c/2-3 hrs.
Morfina
2-5 mg/kg, sc c/2-4 hrs.
5-10 mg/kg, sc c/2-4 hrs.
2-5 mg/kg, sc c/2-4 hrs.
2-5 mg/kg, sc im; c/2-4 hrs. (resistente)
5-12 mg/kg; sc, im.
2-5 mg/kg; sc, im; c/2-4 hrs.
Carprofeno
2.5-5 mg/kg; sc; c/24 hrs.
5 mg/kg; sc; c/24 hrs.
5 mg/kg; sc; c/24 hrs.
4 mg/kg; sc; c/24 hrs.
1.5 mg/kg; im; c/24 hrs.
Ketoprofeno
5 mg/kg; sc; c/12-24 hrs.
5 mg/kg; sc; c/12-24 hrs.
3 mg/kg; im; c/12-24 hrs.
Flunixin
2.5 mg/kg; sc; c/12-24 hrs.
2.5 mg/kg; sc, im; c/12-24 hrs.
2.5 mg/kg; im; c/12-24 hrs.
Codeina
60-90 mg/kg; sc; c/4 hrs.
25-40 mg/kg; im; c/4 hrs.

Tabla Nº 14: Analgésicos (mg/kg) a emplear según el nivel de severidad del procedimeinto.
Dolor Mínimo
Dolor Moderado
Dolor Severo
Anestesia Local
Lidocaína/Bupivacaina
Lidocaína/Bupivacaina
(Junto a analgésicos sistémicos)
Lidocaína/Bupivacaina
(Junto a analgésicos sistémicos)
Butorfanol
5 mg/kg; sc, c/4 hrs
Buprenorfina
0.05-0.1 mg/kg; sc c/6-12 hrs.
Buprenorfina
0.05-0.1 mg/kg; sc c/6-12 hrs.
Carprofeno
2.5-5 mg/kg; sc; c/24 hrs.
Carprofeno
5 mg/kg; sc; c/24 hrs.
Carprofeno
5 mg/kg; sc; c/24 hrs.
Buprenorfina
0.05-0.1 mg/kg; sc c/6-12 hrs.
Morfina
5-10 mg/kg, sc c/2-4 hrs.
(*) Para dolores severos se puede combinar la acción de analgésicos no esteroidales (AINE) y opioides al mismo tiempo.

Eutanasia
La eutanasia (del Griego Eu: bueno, thanatos: muerte = buena muerte) es un método humanitario de sacrificio que debe producir el menor sufrimiento posible (dolor, angustia y miedo), por lo cual debe producir una rápida pérdida de conciencia seguido
por el cese de la función cardiaca, respiratoria y finalmente cerebral.
Los animales se sacrifican en los laboratorios o establecimientos de cría por varios motivos:
• Al finalizar un experimento o cuando se pudiera continuar por sus efectos adversos;
• Para obtener sangre y otros tejidos con un fin científico;
• Cuando los niveles de dolor, angustia y sufrimiento es probable que sobrepasen el nivel previsto;
• Cuando el campo de estudio sea la salud o el bienestar de los animales;
• Cuando ya no sean aptos para la cría;
• Animales no utilizados, o aquellos con sus características no adecuadas, por ejemplo,
el tipo de animal o el sexo y que por ello no son necesarios.

Objetivos de la eutanasia
Los criterios primordiales para la eutanasia en términos de bienestar animal, son que el método sea:
• Indoloro,
• Consiga una rápida inconsciencia y muerte,
• Requiera una mínima inmovilización ,
• Evite la excitación,
• Sea apropiado para la edad, especie y salud del animal,
• Debe de minimizar el miedo y el estrés en el animal,
• Ser fiable,
• Reproducible,
• Irreversible,
• Sencillo de administrar (en dosis pequeñas si es posible)
• Seguro para el operador,
• Y en la medida de lo posible, debe minimizar el impacto emocional para el operador.

Existen dos pautas ampliamente difundidas donde aparecen señalados los diferentes
métodos existentes para las especies vertebradas, agrupándolos en permitidos,
condicionados o permitidos sólo con animales inconscientes y prohibidos o inaceptables. Estas corresponden a: la versión actualizada 2007 del AVMA Guidelines
on Euthanasia (http://www.avma.org/issues/animal_welfare/euthanasia.pdf, 09/Febrero/2010) y las recomendaciones para eutanasia en animales de experimentación
Parte 1 y 2 entregados por la Comisión Europea (http://www.lal.org.uk/index.php?option=com_content&view=article&id=56&Itemid=60, 09/Febrero/2010) las cuales se encuentran disponibles vía web site y pueden ser consultadas por el investigador
que desee profundizar en el tema.

Aspectos a considerar en la selección del método
La vida de cualquier animal debe ser tratada con respeto, se debe, siempre se debe poner énfasis en que el método de eutanasia seleccionado cause el menor dolor y malestar posible.
-Especie: Las especies vertebradas poiquilotermas son más resistentes a la apnea, por ende demoran más en conseguir la inconciencia, se debe preferir en el caso de anfibios y reptiles métodos no gaseosos. En el caso de ejemplares o especies altamente estresables (aunque no lo demuestren) optar por la sedación previa con el fin de reducir la posible ansiedad y angustia durante la inmovilización.
-Edad del animal: Los embriones en su último tercio de desarrollo y los animales muy jóvenes tienen bien desarrollados los componentes del sistema del dolor, tanto a nivel periférico como a nivel cortical y subcortical; por ende las respuestas funcionales
al dolor y al estrés, deben ser consideradas
-Lugar físico: El procediendo debe ser realizado en un lugar aislado de preferencia sin la presencia de otros animales, con el fin de evitar ansiedad, miedo por vocalizaciones,
la liberación de ciertos olores o feromonas etc.
-Personal Capacitado: Tanto en la manipulación de los animales, método de eutanasia
a aplicar, reconocimiento de los signos de muerte (cese del latido cardiaco y la respiración, ausencia de reflejos, descenso de la temperatura corporal por debajo de 25°C).
Mecanismo de acción de los agentes eutanásicos
(1) hipoxia, directa o indirecta;
(2) depresión directa de las neuronas esenciales para las funciones vitales;
(3) interrupción física de la actividad del cerebro y destrucción de neuronas esenciales
para la vida.
A continuación se entregan tablas de la Nº 15 a la 20 donde aparecen aquellos procedimientos de uso frecuente y que son aplicables de acuerdo a la realidad institucional
y nacional, por lo que se le sugiere informarse, si desea implementar algún otro método.

Tabla Nº 15: Métodos físicos y químicos aceptables para Inducir eutanasia
ACEPTABLES
Métodos físicos
Ventajas
Desventajas
Concusión (aturdimiento por golpe o stunning)
Procedimiento rápido, seguro cuando es bien aplicado.
Se puede emplear en varias especies: en animales pequeños y de granja.
Requieren experiencia del operador; equipamiento e inmovilización del animal (estrés).
Estéticamente desagradable para el operador
Dislocación cervical
Procedimiento rápido, seguro aplicable varias especies: en animales pequeños
y de granja peces, aves de corral, ratones, cobayas y ratas jóvenes, conejos (< 1kg.) neonatos y gatos y perros recién nacidos Requieren experiencia del operador; e inmovilización del animal (estrés) Cuando sea posible, los animales deberían estar sedados o anestesiados antes de la dislocación. Estéticamente desagradable para el operador. Decapitación Procedimiento rápido, seguro aplicable varias especies: peces, anfibios, aves, roedores y conejos pequeños Requieren experiencia del operador; e inmovilización del animal (estrés) y equipamiento (guillotina) Cuestionable e inaceptable su uso en vertebrados poiquilotermos y en aves (demora en caer en inconciencia) Estéticamente desagradable para el operador. Métodos químicos Dióxido de carbono Rápida inconciencia, analgesia y depresión del sistema nervioso. Aplicables en animales <7kg. No es inflamable ni explosivo (seguro para el operador). A concentraciones inadecuadas produce disnea, ansiedad y estrés No recomendable su uso en animales vertebrados poiquilotermos, neonatos, peces, conejos y en otras especies mayores Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 99 Monóxido de carbono Gas inerte sin olor, aplicable en animales pequeños No recomendable su uso en reptiles Extremadamente nocivo y peligroso para el operador Se requiere cámara con recolección de gases y censores. Halotano Rápida pérdida de la conciencia, analgesia y depresión del sistema nervioso. Aplicables en animales pequeños Teratogénico en algunas especies. Hepatotóxidad en el operador por exposiciones repetidas Se requiere cámara con recolección de gases Isofluorano Idem. Halotano No afecta el metabolismo hepático Olor picante. No recomendable en reptiles Se requiere cámara con recolección de gases Benzocaina (etil aminobenzoato) Rápida degradación medioambientalmente seguro e igual para el personal. Aplicable en peces y anfibios Efectividad legada a PH del agua Tricaína metano sulfonato (MS-222 tamponado) Soluble tanto en agua salada como dulce. Aplicable en peces y anfibios. En forma inyectable en serpientes y caimanes Necesita ser neutralizado para reducir la irritación y el daño tisular, Efectividad varía según especie, tamaño, Tº y dureza del agua. Inestable a la luz solar. Barbitúricos: Pentobarbital Tiopental Aplicable en varias especies (pequeñas y mayores) por diferentes vías ev,ip,ic. Requiere inmovilización y dominio de técnica en adm. de sustancias. Solución irritantes T-61 (Solución para eutanasia) Efectivo en varias especies. De aplicación endovenosa lenta. Ídem a anterior. Puede producir vocalización y act. muscular en perros
Tabla nº 16: Métodos eutanásicos físicos y químicos aceptables solo con animales inconscientes ACEPTABLES CON ANIMALES INCONCIENTES Métodos Cuestionamiento Inserción de aguja Su incorrecta aplicación puede dejar el animal consiente padeciendo dolor y angustia Congelación rápida Estructuras profundas que rodean el cerebro se demoran en congelar por baja conductividad térmica de los tejidos. Exanguinación hipovolemia extrema, disnea y dolor producido al incidir vasos sanguíneos profundos. NO es recomendado en aves y en vertebrados poiquilotermos Nitrógeno/argón Demora en producir inconciencia, a 39% de concentración hasta los 3 minutos en ratas Hidrato de cloral carece de efectos analgésicos, tarda mucho en hacer efecto, produce movimientos en el animal estéticamente cuestionables, se necesitan grandes volúmenes y causa irritación en el peritoneo Cloruro potásico cardiotóxico, produce jadeo, vocalizaciones, espasmos musculares y episodios convulsivos, lo cual es estéticamente inaceptable Embolia gaseosa Produce convulsiones, opistotonos y vocalizaciones Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 101 Existen métodos inaceptables (no permitidos) debido a que tardan en producir inconciencia o durante proceso que los animales pierden la conciencia pueden padecer, angustia, ansiedad, estrés, dolor intenso, convulsiones, vocalizaciones hasta lentamente conseguir la muerte. Igualmente pueden ser inseguros para el operador (explosivos o tóxicos) o bien interferir seriamente en la obtención de muestras o los programas de cría en roedores, debido a concentraciones trazas, tales como:-Descompresión/vacío, Hipotermia, Hipertermia, Ahogamiento/extracción del agua, Rotura de cuello, Estrangulamiento, Protóxido de nitrógeno, Éter (éter dietílico), Cloroformo, Metoxiflurano, Tricloroetileno, Gas Cianhídrico, 2-fenoxietanol, Uretano agentes bloqueadores neuromusculares, Ketamina, Sedantes, Sulfato magnésico, alfaxolona, alfadolona , propofol, analgésicos narcóticos (morfina, la etorfina) 102 CONICYT 2009 Tabla Nº 17: Métodos eutanásicos físicos y químicos según admisibilidad Métodos físicos Métodos Químicos Aceptables en el animal consciente Concusión (stunning) Dislocación Cervical Decapitación Maceración Irradiación por microondas Agentes Inhalatorios:- Dióxido de carbono, monóxido de carbono, anestésicos inhalatorios. Agentes para animales acuáticos (diluidos en agua):- Bezocaína, tricaína metano sulfonato (MS-222), etomidato o metomidato, quinaldina. Agentes Inyectables:- Barbitúricos, T-61. Aceptables en el animal inconsciente Inserción de aguja Congelación rápida Exanguinación Nitrógeno/argón Etanol Hidrato de Cloral Cloruro de Potásico Embolia Gaseosa Inaceptables Descompresión al vacío Hipotermia Hipertermia Ahogamiento/extracción del agua Rotura de cuello Estrangulación Protóxido de nitrógeno, ciclopropano, éter dietílico, cloroformo, metoxiflurano, tricloroetileno, gas cianhídrico, 2-fenoxietanol, uretano, bloqueantes musculares, ketamina, sedantes, sulfato magnésico Extraído de ZUÑIGA JM, e.t al. (2001) Ciencia y tecnología en protección y experimentación animal, Madrid-España, Editorial Mc Graw-Hill Interamericana. Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 103 Tabla Nº 18: Métodos eutanásicos físicos recomendados por especie Métodos Físicos Rata Ratón Hámster Conejo Cobayo Perro Gato Peces Anfibios Concusión (stunning) b b b b b C/R C/R C/R b Dislocación cervical C/R b b C/R C/R C/R C/R C/R C/R Decapitación b b b C/R C/R C/R Irradiación por microondas b b b C/R b b Inserción de aguja b b Congelación rápida C/R C/R C/R C/R C/R Exanguinación b b b b b b b • Métodos aceptables solamente con el animal inconsciente b= Recomendado para la especie C/R= Existen restricciones para su uso o aplicación 104 CONICYT 2009 Tabla Nº 19: Métodos eutanásicos químicos recomendados por especie Métodos Químicos Rata Ratón Hámster Conejo Cobayo Perro Gato Peces/Anfibios Agentes Inhalatorios:- Dioxido de carbono, monóxido de carbono, anestésicos inhalatorios b b b C/R C/R C/R C/R Agentes para animales acuáticos (diluidos en agua):- Bezocaína, tricaína metano sulfonato (MS-222), etomidato o metomidato, quinaldina. b Agentes Inyectables:- Barbitúricos, T-61. b b b b b b b C/R Embolia gaseosa b b b Nitrógeno/argón b Etanol b b b Cloruro de Potásico b b b b • Métodos aceptables solamente con el animal inconsciente b= Recomendado para la especie C/R= Existen restricciones para su uso o aplicación Capítulo 6 Principales pautas de refinamiento en experimentación animal 105 Conclusiones Desafortunadamente aún no existen métodos alternativos validados que no impliquen el uso de animales que reemplacen en un cien por ciento su empleo en investigaciones biomédicas, pruebas de seguridad biológica o testeo por lo que, mientras continúen empleándose modelos animales su uso seguirá siendo tema de debate moral y en muchos países de obligatoriedad legal, donde el dolor, afección o daño que se les pueda ocasionar, deben ser evitados o minimizados. El empleo de medidas de refinamiento tanto en las condiciones de confinamiento como en los procedimientos experimentales que se realicen en los animales son cruciales para conseguir esta meta y garantizan el bienestar de los animales. Sin embargo, dada la naturaleza globalizada de la ciencia y la existencia de diferentes sistemas legales y culturales acerca de protección de los animales empleados en experimentación existen divergencias entre los estándares que aplica cada país, por lo que la publicación de normas o pautas facilitan el trabajo experimental de los investigadores y avalan la calidad de la ciencia que están desarrollando.

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