Inmunología y vacunas frente al PRRSV y al PCV2

El virus del PRRS y el PCV2 son los dos patógenos que más pérdidas han causado a la industria porcina en los últimos 20 años. En este artículo se explican cuáles son los mecanismos de protección y las limitaciones que presentan las vacunas frente a estos dos virus.

Irene M. Rodríguez-Gómez¹ e Ivan Díaz²¹Licenciada en Veterinaria y estudiante de doctorado del Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas de la Universidad de Córdoba
²Doctor en Medicina y Sanidad Animal e Investigador del Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA)
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Una vacuna es aquel preparado antigénico capaz de otorgar protección frente a un patógeno concreto. Tras la vacunación, se establece una respuesta inmunitaria de memoria que supondrá la resolución rápida y eficaz de una posible infección (cuadro).
Sin ninguna duda, los dos patógenos que han causado las mayores pérdidas económicas en la producción porcina en los últimos 20 años son el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) y el circovirus porcino tipo 2 (PCV2). Ambos son capaces de infectar células centrales en el desarrollo de la respuesta inmunitaria y de modular ésta mediante diferentes mecanismos. Sin embargo, el éxito de las vacunas existentes en el mercado es considerablemente diferente; mientras que las vacunas frente al PCV2 tienen una eficacia muy elevada —podríamos incluso calificarla de extraordinaria—, las vacunas frente al PRRSV aún tienen un amplio margen de mejora.
Los mecanismos de protección que pueden inducir las vacunas, sea cual sea el patógeno, son los anticuerpos y las respuestas celulares. Mientras los anticuerpos tienen la capacidad de neutralizar al patógeno antes de que éste infecte a la célula diana, y por tanto otorgan inmunidad esterilizante, las respuestas celulares actúan una vez que la célula diana ha sido infectada y ha dado la señal de alarma. Obviamente, en función de la intensidad de ambas respuestas y del patógeno involucrado, ambos parámetros pueden participar en la protección. La inducción de una cantidad suficiente de anticuerpos neutralizantes bastaría para otorgar protección, pero una cantidad elevada aunque insuficiente de éstos, con una participación importante de la respuesta celular, puede limitar de forma rápida la infección y, finalmente, eliminarla. Como veremos a continuación, en algunos casos ninguna de estas condiciones es fácil de alcanzar.
Vacunas frente al PRRSV
La primera vacuna comercializada en el mundo frente al PRRSV fue una vacuna inactivada creada a partir de una cepa española (1993). En 1994 se puso a la venta la primera vacuna basada en un virus atenuado, en este caso a partir de una cepa americana. Actualmente, existen más de dos docenas de vacunas, aunque muchas de ellas sólo se distribuyen en su país de origen. Todas están basadas en virus atenuado o inactivado, con o sin adyuvante.
Únicamente existen dos excepciones, una vacuna de subunidades compuesta por un heterodímero de la glicoproteína 5 y de la proteína M, comercializada sólo en Estados Unidos, y un concentrado de inmunoglobulinas aviares contra cepas del genotipo americano, comercializada sólo en México.
Obstáculos e interrogantes en la respuesta inmunitaria frente al PRRSV

Interrogantes	Obstáculos
Mecanismos de protección Papel de la respuesta celular Papel de la respuesta humoral	Respuesta inmunitaria anómala Baja expresión de moléculas participantes en la presentacion del antígeno Inhibición de la producción de IFN-alfa Débil, errático y tardío desarrollo de la respuesta celular Producción baja y tardía de anticuerpos neutralizantes
Proteínas del virus involucradas en la protección Antígeno inductor de protección	Elevada variabilidad genética del virus Dos genotipos (Tipo I y Tipo II) Elevada variabilidad dentro de cada genotipo Variantes dentro de la misma explotación Generación de cuasiespecies en el mismo animal
Inmunidad protectora cruzada Nivel de protección heteróloga Dificultad para neutralizar ciertas cepas a pesar de la existencia de anticuerpos neutralizantes Nivel de respuesta celular necesario para proteger frente a una cepa heteróloga	Respuestas anamnésicas de bajo nivel Booster por revacunación homóloga limitado

Mecanismos de protección y limitaciones
La eficacia de las vacunas comercializadas actualmente frente al PRRSV no es tan exitosa como desearíamos. La idiosincrasia del PRRSV es la principal causa de este fenómeno. La figura muestra los obstáculos a los cuales las vacunas deben hacer frente y que dificultan la creación de inmunológicos más eficaces.
Como decíamos, las vacunas más utilizadas frente a este virus son las basadas en virus atenuado y en virus inactivado. El uso de un virus atenuado o inactivado en una vacuna implica la administración del virus completo; de las partes del mismo involucradas en la respuesta protectora, pero también de aquellas involucradas en la inmunomodulación de las respuestas. Desconocemos hasta qué punto este hecho puede interferir en la eficacia de las vacunas, pero es cierto que el desarrollo de la respuesta inmunitaria que se origina tras la vacunación es muy parecido al de la respuesta que se desarrolla tras una infección.
En general, se considera que las vacunas atenuadas inducen sobre todo, buenas respuestas celulares, aunque también provocan una buena respuesta humoral mientras que las vacunas inactivadas inducen principalmente respuestas humorales. Sin embargo, en el caso del PRRSV esta afirmación no se cumple siempre: las vacunas atenuadas inducen mejores respuestas celulares que las inactivadas, pero existen excepciones. Por otro lado, ya sea con vacunas atenuadas o con vacunas inactivadas es muy difícil inducir anticuerpos neutralizantes, cuanto menos con una sola dosis. Aparte de las respuestas inmunitarias que inducen, la principal diferencia entre ambas es, obviamente, la capacidad de replicarse. Si bien esta capacidad, propia de las vacunas atenuadas, favorecería una mejor respuesta inmunitaria, también puede convertirse en un arma de doble filo: los virus atenuados podrían ejercer una inmunomodulación negativa más marcada y además podrían transmitirse a animales no vacunados.
Los inconvenientes anteriormente descritos no significan que las vacunas no induzcan ningún tipo de protección ni que su uso deba desecharse, ya que múltiples trabajos tanto en condiciones experimentales como en el campo, así como su uso rutinario en granja, demuestran que las vacunas frente al PRRS funcionan, cuanto menos disminuyendo la gravedad del cuadro clínico y la presión infectiva. En condiciones experimentales, prácticamente ningún estudio ha podido detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en cantidades significativas tras la vacunación. En el caso de ser detectados, los niveles de anticuerpos producidos dependen en gran medida de dos factores: de la cepa del virus usada en la inmunización —no todas las cepas inducen con la misma intensidad la producción de anticuerpos neutralizantes— y la edad de los animales vacunados —cuanto mayor es el animal, mayor cantidad de anticuerpos neutralizantes se necesita. A pesar de la falta de una producción significativa de anticuerpos neutralizantes, en estos estudios las vacunas demostraron ser efectivas, de manera total o parcial. Como decíamos, una respuesta celular puede ser suficiente para limitar en extremo la infección, de manera que en algunos casos la infección puede establecerse pero en una intensidad tan baja que curse sin, o prácticamente sin, sintomatología ni viremia, o con una viremia de muy corta duración y con cantidades de virus en sangre muy bajas. Así, en el campo, el uso de vacunas puede no evitar en todos los casos la infección del animal vacunado, pero sí reduce notablemente la sintomatología y los niveles de infección, de tal manera que disminuye la circulación del virus en la granja.
En cualquier caso, y debido a las peculiaridades del virus, las vacunas trabajan en condiciones duras, por lo que una correcta pauta vacunal establecida a partir del estudio serológico de cada caso particular, la correcta aclimatación de las cerdas de reposición a las condiciones de cada granja, la implementación de medidas complementarias de bioseguridad, etc. facilitarán en gran medida su labor.
Con el objeto de mejorar las vacunas existentes, experimentalmente se han probado diferentes opciones: vacunas atenuadas adyuvantadas con citoquinas o vacunas de subunidades (utilizando las glicoproteínas 3, 4, 5, la proteína M o la proteína N) expresadas en múltiples y variados sistemas (baculovirus, planta de tabaco, virus de la gastroenteritis transmisible, etc.), sólo por nombrar algunos ejemplos. Todas estas vacunas han demostrado una eficacia menor, igual, o como mucho algo superior, de la que otorgan las vacunas comercializadas actualmente. Definitivamente, en relación a la respuesta inmunitaria frente a este virus existen todavía importantes preguntas sin responder, las cuales frenan el desarrollo de vacunas más eficaces.

Algunas preguntas sin respuesta sobre el PRRSV... ¿qué determina la protección?

¿Cuáles son los factores implicados en la inmunidad protectora (anticuerpos neutralizantes, respuesta celular) frente al PRRSV? ¿En qué grado participan exactamente? ¿Cómo podemos obtener una producción elevada de estos factores? ¿Qué partes del PRRSV están involucradas en la producción de dichos factores? ¿Un nivel suficientemente elevado de respuestas celulares o de anticuerpos neutralizantes, o incluso de la combinación de ambos, puede superar la elevada variabilidad genética del virus? ¿Existen partes del virus inductoras de respuesta protectora comunes en todas las cepas del PRRSV? y, por tanto, ¿existe la posibilidad de crear una vacuna universal?

Vacunas frente al PCV2
La primera vacuna registrada a nivel europeo frente a PCV2 fue una vacuna inactivada destinada a cerdas antes del parto, más tarde se autorizó su uso en lechones. El resto de vacunas comercializadas son vacunas recombinantes registradas para su aplicación en lechones a partir de las 2-3 semanas de vida, excepto una de ellas en la que la primera dosis puede aplicarse a los 3-5 días de edad con revacunación a las 2-3 semanas.
Las vacunas comercializadas más recientemente frente a este patógeno se basan en el uso de la proteína de la cápside (Cap), ya que es la proteína capaz de desencadenar una fuerte y duradera respuesta humoral: algunas están basadas en la expresión de la proteína Cap usando como vector un sistema de baculovirus y otras usan un virus quimera atenuado en el cual el gen Cap de PCV2 ha sido insertado en el esqueleto genómico del PCV1.
Mecanismos de protección
El uso rutinario de vacunas frente a PCV2 en el campo, así como los diversos estudios realizados, confirman que todas las vacunas comercializadas son eficaces. La vacunación supone una disminución de la replicación del virus en los tejidos, en algunos casos con eliminación completa del mismo, la no aparición de signos clínicos y el mantenimiento de la ganancia media diaria de los animales. Tras la implementación de un protocolo vacunal frente a PCV2, se ha observado, tanto en granjas con sintomatología clara como en granjas asintomáticas, la mejora de los rendimientos productivos. Este hecho sugiere que las infecciones subclínicas pueden tener un efecto negativo suficientemente importante, el cual puede ser revertido mediante el uso de vacunas.
A diferencia de lo que ocurre con el PRRSV, el desarrollo de una fuerte respuesta humoral, caracterizada por un desarrollo de anticuerpos neutralizantes anti-PCV2, está directamente correlacionado con la lucha efectiva frente al patógeno. Respecto a la respuesta celular, se ha descrito que en ocasiones este mecanismo también desempeña un rol importante en el control de la infección. Así, en el curso de una infección subclínica una respuesta celular suficientemente elevada se ha relacionado con una disminución en los niveles de replicación del virus.
Actualmente se reconocen tres genotipos distintos del PCV2: PCV2a, PCV2b y PCV2c. Desde 2003, se ha observado un cambio en las prevalencias de los distintos genotipos. Así, PCV2a está siendo sustituido por PCV2b, probablemente debido a una presión inmunogénica, ya que todas las vacunas desarrolladas frente a PCV2 están basadas en el genotipo PCV2a. De todas formas, hasta la fecha, las vacunas basadas en PCV2a están demostrando protección cruzada frente a PCV2b.
En definitiva, el camino que uno desearía recorrer cuando se diagnostica por primera vez una enfermedad (identificación del agente causal, conocimiento del proceso desde el punto de vista clínico, patológico e inmunológico y, por último, resolución del problema mediante la creación y aplicación de tratamientos o vacunas) parece que en el caso del PCV2 ha llegado con éxito a su fin.
Respecto al PRRSV, aún nos queda camino por recorrer, un camino lleno de obstáculos, en el que la comunidad científica y veterinaria ha invertido e invierte un esfuerzo realmente considerable y con el cual esperamos alcanzar el mismo éxito que el obtenido con PCV2.
Bibliografía disponible en www.albeitar.grupoasis.com/bibliografias/inmunologia152.doc

Potencia y eficacia de las vacunas frente a la rinotraqueítis infecciosa bovina

(Foto: Sxc.hu)

En general, las vacunas contra BoHV-1 disponibles en el mercado evitan la manifestación de síntomas clínicos graves y reducen la liberación del virus después de la infección, pero no evitan la infección.

Viviana Parreño [1], Virginia Barros [2], Alejandra Romera [1]
1. Instituto de Virología, CICV y A, INTA (Castelar, Argentina)
2. Servicio de control de vacunas virales no vesiculares, DILAB, SENASA (Argentina)


El herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) es el agente etiológico de la rinotraqueítis infecciosa bovina, enfermedad respiratoria, reproductiva y eventualmente neurológica del ganado bovino doméstico y salvaje, de distribución mundial.
La enfermedad provoca un amplio rango de manifestaciones clínicas que incluyen rinotraqueítis, vulvovaginitis/balanopostitis pustular infecciosa, conjuntivitis, aborto, enteritis y también encefalitis. Los casos de enfermedad respiratoria o genital provocados por BoHV-1, en ausencia de complicaciones bacterianas secundarias, tienen una duración promedio de 5-10 días. La infección por BoHV-1 comprende tres diferentes estadios: enfermedad aguda, latencia y reactivación.

La transmisión de la infección
En la infección respiratoria directa, el virus penetra en el animal por vía nasal, a través de aerosoles o por contacto de mucosas entre animales infectados, y se replica en el tracto respiratorio. Después se disemina y replica en la conjuntiva ocular y mediante su transporte por el axón de las neuronas alcanza el ganglio trigémino.
En una infección genital, el agente se replica en la mucosa genital y se establece de forma latente en los ganglios sacros. Una vez superada la fase aguda de la enfermedad, el ganado se recupera, aunque el virus se aloja en las neuronas y se mantiene latente de por vida: el animal no presenta síntomas y no puede diferenciarse de los animales  vacunados, ya que ambos presentan los mismos anticuerpos.
El estrés asociado a diferentes manejos, como el transporte o el parto, puede inducir la reactivación de la infección latente. Así, los animales seropositivos se convierten en una importante fuente de transmisión de la infección.

Signos clínicos de IBR (desde la izquierda): conjuntivitis, vulvovaginitis y rinitis.

La erradicación de la infección por BoHV-1
La infección por BoHV-1 induce una respuesta inmunitaria en 7–10 días. Los anticuerpos neutralizantes pueden persistir hasta cinco años después de la infección si son reestimulados (reactivación o vacunación) adecuadamente. Los anticuerpos evaluados por técnicas de ELISA que utilizan el virus completo, permanecen detectables toda la vida. Si bien la protección frente a la infección está dada principalmente por la inmunidad celular, niveles elevados de anticuerpos se asocian a mayores índices de protección al desafío experimental.
En varios países de Europa se están realizando campañas de erradicación con o sin vacunación (obligatorias o voluntarias) que han tenido éxito en Noruega, Finlandia, Suecia, Austria, Dinamarca, Suiza y algunas regiones de Italia y Alemania. En el resto del mundo (incluyendo toda América y países europeos como España) la infección es endémica. Las diferencias del estatus sanitario frente a IBR en los diferentes países de la Comunidad Europea han generado restricciones para la libre circulación del ganado y sus productos. Esta normativa impulsa a todos los países con producción pecuaria a optimizar sus planes de control y aumentar la calidad de sus herramientas sanitarias (métodos de diagnóstico, vacunas, métodos de control de potencia y eficacia de dichas vacunas).
En general, las vacunas contra BoHV-1 disponibles en el mercado evitan la manifestación de síntomas clínicos graves y reducen la liberación del virus después de la infección.
En la actualidad se dispone de varias vacunas con BoHV-1 atenuado e inactivado. Para los planes de erradicación se recomienda el uso de vacunas marcadoras o DIVA (que permiten la diferenciación entre animales infectados y vacunados) y se basan en mutantes delecionados (por ejemplo gE-) y su aplicación conlleva el uso de pruebas diagnósticas paralelas que permiten distinguir entre el ganado infectado y el ganado vacunado. Este tipo de vacunas se utiliza en Europa en los países que aplican programas de erradicación con campañas de vacunación. En algunos países, los animales infectados restantes se eliminan dando como resultado una región libre de BoHV-1. En países endémicos, como Argentina, Brasil y España se aplican programas voluntarios de vacunación intensiva que logran reducir la prevalencia de los animales infectados.
Los organismos de control internacional (APHIS, USA; EMEA-CVMP, UE; OIE; VICH) exigen para la aprobación de vacunas que contienen IBR ensayos de potencia y eficacia en la especie de aplicación, que implican la vacunación e infección de bovinos susceptibles y seronegativos. Una vez aprobado el producto, el control de calidad de cada serie debe realizarse por medio de una prueba de potencia que determine la inmunogenicidad del producto en bovinos o en otro modelo animal de laboratorio (prueba in vivo) que haya sido estadísticamente validado y posea un grado de concordancia aceptable respecto de la prueba de potencia en la especie destino y que funcione como una herramienta predictiva de la eficacia de la vacuna. Es por ello que en Argentina se decidió desarrollar y validar una prueba estandarizada en animales de laboratorio (cobayas) que permita evaluar la potencia de cada lote de vacuna, garantizando así la presencia en el mercado de productos eficaces. En relación al bienestar animal, la prueba en cobayas es sólo serológica y no implica maniobras cruentas para los animales, por lo que cumple con el principio de la 3 R (reducción, reemplazo y refinamiento).
Control de potencia en cobayas
El modelo desarrollado en Argentina se trata de un ensayo in vivo que utiliza 6 cobayas por vacuna y 3 testigos/placebos y sólo una toma de muestras a los 30 días posvacunación. Es importante destacar que las cobayas son una especie libre de BoHV-1 y, por lo tanto, naturalmente seronegativas para anticuerpos contra este agente viral. Además, con el volumen de muestra obtenida se puede evaluar la calidad de las vacunas polivalentes para todos los antígenos virales que la componen; las que, en algunos casos llegan a contener hasta cuatro valencias virales.
La validación del modelo indicó que la respuesta de anticuerpos inducida por las vacunas de BoHV-1 en bovinos y cobayas fue directamente proporcional a la concentración de antígeno vacunal y permite diferenciar las vacunas en tres categorías: no satisfactoria, satisfactoria y muy satisfactoria. Se evaluaron vacunas representativas de cada categoría en una prueba de desafío experimental con IBR en bovinos seronegativos, demostrándose diferente grado de protección para cada categoría.
El modelo de cobaya presentó una concordancia casi perfecta con el del bovino para clasificar las vacunas y logró predecir adecuadamente no sólo la calidad inmunogénica de las vacunas, sino también su grado de eficacia frente al desafío experimental en bovinos. Las vacunas clasificadas como muy satisfactorias o satisfactorias por el modelo cumplieron con los requisitos exigidos por el CFR americano y el manual de diagnóstico y vacunas de los animales terrestres de la OIE para su aprobación. La prueba fue evaluada por el SENASA-Argentina durante tres años (2008-2010) y actualmente ha sido adoptada como prueba oficial para el control de vacunas de IBR en Argentina.
La prueba propuesta no necesita infraestructura ni tecnología compleja, sólo un bioterio con cobayas y técnicas serológicas corrientes (ELISA, VN) de uso rutinario en los laboratorios de virología.
Bibliografía
1- OIE. Chapter 2.4.13. Infectious Bovine Rhinotracheitis/Infectious Pustular Vulvovaginitis. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, France; Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2010. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.04.13_IBR_IPV.pdf
2- CFR.113.216. Bovine Rinotracheitis Vaccine, killed virus, editor.: US Goverment printing office, 1985, : 670-1.
3- Pidone, C.L., Galosi, C.M., Etcheverrigaray, M.E. Herpesvirus bovinos 1 y 5. Articulo de revisión. Analecta veterinaria 1999; 19, ½:40-50.
4- Ackermann M, Engels M. Pro and contra IBR-eradication. Veterinary microbiology 2006 Mar 31;113(3-4):293-302.
5- Campos FS, Franco AC, Hubner SO, Oliveira MT, Silva AD, Esteves PA, et al. Highprevalence of co-infections with bovine herpesvirus 1 and 5 found in cattle insouthern Brazil. Vet Microbiol 2009;139(1–2):67–73.
6- Odeón ACS, E.J.A,  Paloma, E.J.,Leunda, M.R.,  Fernández Sainz, I.J.,, Pérez SE, Kaiser, G.G.,  Draghi, M.G.;  Cetrá, B.M. Cano, A. . Seroprevalencia de la Diarrea Viral Bovina, Herpesvirus Bovino y Virus Sincicial Respiratorio en Argentina. Revista de Medicina Veterinaria 2001;82(4):216-20.
7- Moore DP, Campero CM, Odeon AC, Bardon JC, Silva-Paulo P, Paolicchi FA, et al. Humoral immune response to infectious agents in aborted bovine fetuses in Argentina. Rev Argent Microbiol 2003 Jul-Sep;35(3):143-8.
8- Puntel MR, A., Sadir A, Borca, M., inventor P040102842.  Acta N° 02 01 04305, assignee. Método para obtener la cepa mutada recombinante del virus Herpes Bovino de tipo 1, plásmido vector y vacuna. Argentina. 2002 11-11-2002.
9- EMEA/P038/97. Position Paper on Batch Potency Testing Of Immunological Veterinary Medical Products. In: CVMP/IWP VMEU, editor.: The European Agency for the Evaluation of Medical Products, 1998.
10- Hendriksen C. Replacement, reduction and refinement alternatives to animal use in vaccine potency measurement. Expert Rev Vaccines 2009 Mar;Mar:313-22. Halder M, Hendriksen C, Cussler K, Balls M. ECVAM's contributions to the implementation of the Three Rs in the production and quality control of biologicals. Altern Lab Anim 2002 Jan-Feb;30(1):93-108.
11- Hendriksen CF. Validation of tests methods in the quality control of biologicals. Dev Biol Stand 1999;101:217-21.
12- Taffs RE. Potency tests of combination vaccines. Clin Infect Dis 2001 Dec 15;33 Suppl 4:S362-6.
13- Parreño, V; López; MV; Rodriguez, D; Vena, MM, Izuel, M; Filippi, J; Romera, A; Faverin, C; Bellinzoni, R, Fernandez, F and Marangunich, L. Development and Statistical Validation of a Guinea Pig model for Vaccine Potency testing against Infectious Bovine Rhinothracheitis Virus (IBR). Vaccine 28 (2010) 2539–2549.
14- Parreño, Viviana, Romera, S. Alejandra; Makek, Lucia; Rodriguez, Daniela ; Malacari, Dario;  Maidana Silvina; Compaired Diego; Combessies, Gustavo; Vena, Maria Marta ; Garaicoechea, Lorena; Wigdorovitz, Andrés; Marangunich, Laura and Fernandez, Fernando. Standardization and Statistical Validation under ISO/IEC 17025 standards of an indirect ELISA to detect antibodies against BoHV-1 in Bovine and Guinea Pig serum. J. Virol. Methods, 2010 Oct;169(1):143-53.
15- Kramps JA, Banks M, Beer M, Kerkhofs P, Perrin M, Wellenberg GJ, et al. Evaluation of tests for antibodies against bovine herpesvirus 1 performed in national reference laboratories in Europe. Veterinary microbiology 2004 Sep 8;102(3-4):169-81.
16- OIE. Principles of Validation of Diagnosis Assays For Infectious Diseases. In: anual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, France: OIE, 2008: 34-45.
17- Virginia Barrros, Viviana Parreno, Daniela Rodriguez, Valeria Gonzalez, Ricardo D'Aloia,  LauraMarangunich, Virgina Lopez, Fernando Fernandez, Eduardo Maradei. Implementation of the INTA Guinea pig model as the official test to evaluate the immunogenicity of BoHV-1 inactivated vaccines present in the Argentinean market. 31st Annual Meeting American Society for Virology, University of Wisconsin-Madison, July 21 - 25, 2012.
18- Prevalence of serum antibodies to bovine herpesvirus-1 in cattle in Galicia (NW Spain). C. Eiras, F. J. Dièguez, M. L. Sanjuán, E. Yus and I. Arnaiz. Available online at www.inia.es/sjar ISSN: 1695-971-X
19- Molecular and antigenic characterization of Brazilian bovineherpesvirus type 1 isolates recovered from the brain of cattle with neurological disease. M.S. Silva, M.C.S. Bruma, E.L.S. Loreto, R. Weiblen, E.F. Flores. Virus Research 129 (2007) 191–199.

Influenza Infections

J. M. Daly¹ and A. Cullinane²

¹School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham, Sutton Bonington, Leicestershire, UK. ²Irish Equine Centre, Johnstown, County Kildare, Ireland.

Classification of Equine Influenza Virus

Equine influenza viruses are classified as type A influenza viruses, which also include viruses infecting man, birds and swine. Type A influenza viruses are divided into subtypes according to the antigenic characteristics of the surface antigens, haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). With the exception of the recently discovered H17N10 bat influenza virus [1], all the subtypes (combinations of H1 to H16 and N1 to N9) have been isolated from aquatic birds, which act as a natural reservoir for influenza A viruses. Two subtypes have established in equids (H7N7 and H3N8, previously known as equi-1 and equi-2, respectively).

Epidemiology

Influenza virus was first isolated from horses in Czechoslovakia in 1956 [2]; this was the prototype strain for the H7N7 subtype of equine influenza virus A/equine/Prague/56 (H7N7). There has been no convincing evidence for circulation of H7N7 viruses in horses for several decades.
Virus of the H3N8 subtype was first isolated in Miami in 1963 [3]. Antigenic variants can give rise to large-scale disease epidemics in regions where the virus is endemic, such as Europe and North America. Only New Zealand and Iceland are known to have remained entirely free from equine influenza. Some of the most devastating epidemics of equine influenza have occurred when the virus has been introduced into areas previously free of the disease. Outbreaks in South Africa (1986 and again in 2003/4), India (1987), Hong Kong (1992), and Australia (2007) highlighted the ease with which equine influenza can be introduced into susceptible populations as a result of international movement of horses [4-9]. The outbreak in Australia in 2007 particularly emphasised the potential impact of introduction of equine influenza virus into an unvaccinated population, with around 76,000 horses affected and an estimated expenditure of 360 million Australian dollars to bring the outbreak under control [10].
A novel strain of equine influenza caused an epidemic in China in 1989 with an overall morbidity rate of 80% and a mortality rate of 20%. The prototype virus from this epidemic (A/equine/Jilin/89) was shown to be more closely related to influenza viruses infecting aquatic birds than to contemporary equine influenza viruses, demonstrating that the epidemic was the result of emergence of virus from the avian influenza reservoir [11]. A related avian-like virus, which had lost its ability to replicate in birds, affected a few hundred horses in 1990, but seems to have neither persisted in nor spread beyond China [12].
Influenza A viruses are unpredictable by their very nature and unlikely to ever be fully eradicated due to the reservoir of viruses circulating in wild aquatic birds. Recently, donkeys in Egypt joined the relatively long list of mammalian species to have been naturally infected with highly pathogenic avian influenza virus of the H5N1 subtype [13]. It was thought that there was no interchange of influenza virus infections between horses and other mammalian species. However, interspecies transmission of equine influenza virus to dogs has occurred apparently independently in the USA, UK and Australia [14-16]. Furthermore, the H3N8 virus has become endemic, with dog-to-dog transmission, in North America. During surveillance of pigs in China, two H3N8 isolates closely related to equine viruses circulating in the 1990s were isolated in 2005 and 2006 [17]. Although human volunteers have been experimentally infected with equine influenza virus [18], there is currently little evidence of zoonotic infection of people with equine influenza.

Clinical Signs and Pathology

Equine influenza is contracted by inhalation. The virus infects the ciliated epithelial cells of the upper and lower airways and can cause deciliation of large areas of the respiratory tract within 4 to 6 days (Fig. 1a, Fig. 1b, Fig. 1c). As a result, the mucociliary clearance mechanism is compromised and tracheal clearance rates may be reduced for up to 32 days following infection [19].

Figure 1a. Effects of equine influenza virus infection on ciliated respiratory epithelium; (a) healthy epithelium. To view click on figure

Figure 1b. Effects of equine influenza virus infection on ciliated respiratory epithelium; (b) 3 days post infection. To view click on figure

Figure 1c. Effects of equine influenza virus infection on ciliated respiratory epithelium; (c) 6 days post infection, large areas of deciliation observed. To view click on figure

Classic clinical signs of influenza infection in previously naïve animals are easily recognisable, although some strains of equine influenza are less virulent than others [20]. In addition, the amount of virus to which the horse is exposed influences the severity of the disease. Influenza is characterised by a short incubation period of one to 3 days and rapid spread among susceptible animals. The rapidity with which influenza spreads is a key observation for differentiating influenza from other infectious respiratory diseases. The first sign is an elevation of body temperature (up to 41°C), which is usually followed by a deep dry cough that releases large quantities of virus into the atmosphere. This is often accompanied by a serous nasal discharge (Fig. 2), which may become mucopurulent. Other clinical signs that may be observed include: depression, myalgia, inappetance, enlarged submandibular lymph nodes, and oedema of the legs and scrotum. Previously healthy adult horses usually recover from uncomplicated influenza within 10 days, although coughing may persist for longer. If secondary bacterial infection occurs it can prolong the recovery period. On rare occasions more severe signs are observed, sometimes with fatal outcome. Neurological signs were observed in two influenza-infected horses during the 2003 outbreak in the UK [21], and broncho-interstitial pneumonia was observed in young foals without maternal antibodies during the 2007 outbreak in Australia [22].

Figure 2. Serous nasal discharge as seen with infection with equine influenza. To view click on figure

The severity of the disease varies with the immune status of the horse; in animals partially immune as a result of vaccination or previous infection there may be little or no coughing or pyrexia [23,24]. Whereas spread of infection throughout a group of naïve animals is generally rapid, outbreaks have been described in which the infection circulated sub-clinically in vaccinated horses for 18 days before inducing recognisable clinical signs [4]. There have also been positive diagnoses of a few animals infected with equine influenza that have occurred without spread to other animals within Thoroughbred racehorse training yards [25]. In well-vaccinated Thoroughbreds, loss of performance may be the only indication that a horse is infected [26].

Diagnosis

Various agents may cause outbreaks of infectious respiratory disease in horses including: equine herpes, rhino, adeno, and arteritis viruses, Streptococcus equi, S. zooepidemicus, or S. pneumoniae. Therefore, a presumptive diagnosis of influenza based on clinical signs should be confirmed by laboratory testing. Traditionally, laboratory confirmation of a clinical diagnosis has been by isolation of virus from nasopharyngeal swabs or retrospective serology, both processes that can take several days if not weeks. Nowadays, a wide range of laboratory tests are available that allow more rapid diagnosis of influenza infection.
Nasopharyngeal swabs for virus isolation or detection should be taken as promptly as possible. Results of experimental challenge studies suggest that peak viral titres occur on the second or third day after infection, and duration of viral shedding is usually not more than 4 or 5 days in naïve animals [27]. Nasal swab samples are taken by passing a swab as far as possible into the horse’s nasopharynx via the ventral meatus to absorb respiratory secretions. Swabs should be transferred immediately to a container with virus transport medium, which contains antibiotics, and kept cool to maintain viability of the virus. Most equine diagnostic laboratories will supply appropriate swabs and transport medium (Fig. 3). Virus is unlikely to survive if dry swabs are taken and there is increased chance of contamination if bacterial transport medium is used. Most laboratories only attempt virus isolation from samples that have tested positive in a rapid diagnostic test. Virus isolation is essential to surveillance programmes and provides isolates to update vaccine strains when this becomes necessary to maintain vaccine effectiveness (Fig. 4). Where there are low levels of virus shedding, such as in vaccinated horses, virus isolation may prove difficult and some strains are more difficult to isolate than others.

Figure 3. Equipment required for nasopharyngeal swabbing of the horse; sterile swab consisting of gauze attached to a length of soft stainless steel wire, tube containing transport medium into which the gauze end of the swab is placed and the wire trimmed off, insulated container with refrigerant pack and form for submission to diagnostic laboratory. To view click on figure

Figure 4. Inoculation of embryonated hens’ eggs with equine influenza virus. To view click on figure

Virus isolation has been largely replaced by rapid diagnostic tests that detect the presence of viral antigens (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISAs) or viral nucleic acid (reverse-transcription and polymerase chain reaction, RT-PCR) in nasal swab extracts. RT-PCR is the test of choice in most laboratories as it is highly sensitive and can provide a result in a matter of hours [28-30]. An equine influenza-specific ELISA to detect viral nucleoprotein has been in use at the Animal Health Trust, Newmarket, UK since 1989 [31,32]. There are now commercial influenza detection kits available for the diagnosis of human influenza that cross-react with equine influenza. Although less sensitive than equine-specific assays, these kits are easy to use by staff with little laboratory training and provide a rapid result [33-36].
Influenza infection can also be diagnosed by comparison of the results of serological testing of an acute serum sample taken as soon as possible after the onset of clinical signs and a convalescent serum sample taken around 2 weeks later. There are two serological assays – the haemagglutination inhibition (HI) test (Fig. 5) and the single-radial haemolysis (SRH) test (Fig. 6). Both assays rely on measurement of antibodies to haemagglutinin, the surface glycoprotein responsible for viral attachment and entry into host cells and the primary target of virus neutralising antibodies. The SRH test is more complicated and time-consuming to perform than the HI test, but has the advantage of being easier to standardise between laboratories and is therefore particularly useful for vaccine efficacy and epidemiological studies. Serological detection of influenza virus infection is rarely useful in immediate clinical management. However, it is a useful surveillance tool and may be essential to establish a diagnosis where virus detection has not been possible (virus may only be shed for 1 or 2 days and at lower levels in partially immune animals). ELISA tests that detect antibodies against the viral nucleoprotein have recently become available. They are less sensitive than HI and SRH for the detection of influenza in populations where the virus is endemic, but were extremely useful in the control and eradication of equine influenza in Australia [37]. Most recently, a sensitive and quantitative assay to measure neutralising antibodies was developed using an equine influenza pseudotyped lentivirus [38].

Figure 5. Haemagglutination inhibition (HI) assay showing 6 serum samples with titres of 32 (S1, S2 and S3), 16 (S4) and <8 and="" back-titrated="" class="red" confirm="" correct="" dose="" haemagglutinating="" is="" s6="" span="" standard="" that="" the="" to="" units="" used.="" virus="">To view click on figure

Figure 6. Single radial haemolysis plate showing clear zones of haemolysis around wells for 9 out of 16 serum samples and a positive control sample in well 16. To view click on figure

Vaccination

Traditional equine influenza vaccines consist of representative virus strains either as inactivated whole virus or protein subunits and are dependent on induction of antibodies to the surface glycoproteins, in particular haemagglutinin. Levels of antibody required for protection of horses have been determined through vaccination and challenge studies and from field data [39,40]. The vaccine-induced antibody response to HA is remarkably short-lived in horses, therefore, adjuvants such as aluminium hydroxide, carbomer or saponins are normally included to enhance the height and duration of the immune response to whole virus or subunit [41,42].
Live-attenuated and canarypox-vectored vaccines are now also available against equine influenza in some countries. These vaccines are intended to mimic the immune response to natural infection more closely than the traditional vaccines. However, both second-generation vaccines such as immune-stimulating complex (ISCOM)-based and canarypox recombinant vaccines on the one hand, and a more traditional whole inactivated vaccine on the other, have been shown to elicit a cell-mediated immune response [43-46].
Vaccination against equine influenza is mandatory for racehorses and competition horses in several countries and it is important to comply with the relevant regulations. This does not, however, guarantee protection of individual horses, although vaccinated horses typically have milder disease than non-vaccinated horses, are less likely to develop secondary bacterial infections and can thus return to work sooner. A few horses respond poorly to vaccination and have persistently low antibody titres; such horses are often instrumental in starting an influenza outbreak within a premise [47]. Serological monitoring of antibody levels can be useful to determine whether additional booster vaccinations are required [48]. Equine influenza outbreaks are frequently associated with sales or race meets where horses from different regions congregate and mix. It may therefore be advantageous to time additional booster vaccinations to be given prior to such events.
It has been demonstrated that inclusion of an additional booster vaccination to close the window of susceptibility between the second and third vaccinations recommended by the vaccine manufacturers is of benefit to young horses [49]. Furthermore, it is advisable to vaccinate young horses, particularly racehorses and other competition horses, at 4- to 6-month intervals for several years after their primary course of vaccinations. An annual booster will usually suffice for older horses such as show jumpers and brood mares that have been vaccinated regularly since they were foals.
Brood mares should be vaccinated in the later stages of pregnancy, but not later than 2 weeks prior to foaling, to ensure a good supply of colostral antibodies for the foal. For most vaccines, vaccination in the presence of maternal antibodies is not recommended as they interfere with the response to vaccination and may even lead to the induction of serotolerance [49-51]. It is therefore advisable to monitor the antibody titres of foals and start the vaccination programme when maternal antibody titres have declined to negligible levels, usually at around 6 months of age (foals from non-immunised dams should be vaccinated earlier). It has been suggested that vaccination of foals with the canarypox-vectored recombinant vaccine effectively primes the immune system despite the presence of maternally-derived antibodies [52].
Some existing vaccines are available as combination vaccines also containing tetanus or herpes antigens. The immune response elicited by tetanus toxoid is much more durable than that induced by influenza antigen and it is inadvisable to administer tetanus toxoid more frequently than the vaccine manufacturers recommend. In an intensive influenza vaccination programme, vaccines containing influenza only should be routinely administered.

Vaccine Strain Selection

It has been demonstrated in vaccination and challenge studies and in the field that the ability of a vaccine to reduce virus shedding is directly correlated with the antigenic relatedness of the vaccine strain and the challenge virus [53,54]. A European rapid licensing system for influenza vaccines containing updated strains has been developed on the basis that accurate standardisation of in vitro vaccine potency tests allows a reduction in animal testing of the final product [55]. It is nonetheless a major undertaking to update vaccine strains. An Expert Surveillance Panel was instigated at a meeting of World Health Organisation and OIE (World Organization for Animal Health) experts in 1995 [56]. Human influenza vaccines are reviewed on an annual basis and in most years at least one of the 3 components is updated. The equine influenza Expert Surveillance Panel similarly reviews available data annually and reports whether changes to vaccination composition are required. However, antigenic drift occurs at a much lower rate in equine influenza viruses than in human influenza viruses [57], therefore equine vaccines do not need to be updated so frequently. The initial recommendation of the Expert Surveillance Panel was that vaccines should contain one H3N8 virus representative of the "American-like" lineage and a representative of the "European-like" lineage [56]. Prior to 1993, it was thought that equine influenza H3N8 viruses evolved in a single lineage [58]. However, in 1993 viruses were isolated that revealed divergent evolution on the American and European continents [57]; the American and European lineages (Fig. 7). In recent years, there has been little evidence of European lineage viruses in circulation whereas the American lineage has continued to evolve with the predominance of a "Florida sublineage", which has further diverged into two distinct "clades" [59,60]. The latest recommendations to have been published are that vaccines should contain both clade 1 and clade 2 viruses of the Florida sublineage but that it is not necessary to include either an H7N7 strain or a "Eurasian lineage" strain [61].

Figure 7. Phylogenetic tree of the haemagglutinin (HA1 portion) of H3N8 equine influenza viruses. Horizontal distance is proportional to the number of nucleotide differences to join nodes and viruses. Vertical lines are for spacing branches and labels. To view click on figure

Management of an Influenza Outbreak

Treatments for equine influenza are aimed at ameliorating clinical signs; antiviral agents have only been used experimentally [62-66]. Rest is essential to reduce the severity of clinical signs and the recovery period, and minimise chronic sequelae. Ill animals should be provided with plenty of fresh water. Electrolytes can be provided, in a second bucket of water [67]. A non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) can be used in cases with high fever to reduce pulmonary inflammation and in pregnant mares to reduce the risk of abortion. Clinical signs should be monitored daily and if secondary bacterial infection is suspected (indicated by coarse crackles sounds in the lung and prolonged or rising fever), antibiotic therapy should be initiated, and samples obtained for bacterial culture and antibiotic sensitivity testing.
Immediate and effective quarantine of infected individuals is the best way to minimise spread of influenza virus within premises. In order for quarantine measures to be effective, infected individuals must be rapidly identified and isolated. This can be achieved by regularly taking temperatures and / or samples for rapid diagnostic tests. Similarly, restricting movement from premises can limit spread of the virus further afield. In Australia during the 2007 outbreak of equine influenza outbreak, movement restrictions were put in place within and between four different zones according to the level of infection already observed within each zone [9]. Precautions should be taken against the risk of spread by personnel or shared equipment (including vehicles used for transportation); spread of virus by fomites or people was implicated in both outbreaks of equine influenza in South Africa [7,8].
Vaccination in the face of an outbreak has also proven to be effective [10,68,69]. However, if horses are vaccinated in the face of infection it can be difficult, using HI and SRH assays, to determine whether any increase in antibody levels is due to vaccination or infection. In Australia, the canarypox-vectored vaccine was used as part of the effort to contain the outbreak in 2007. This vaccine expresses only the HA protein of equine influenza virus, therefore using an ELISA to detect antibodies to nucleoprotein (present in infectious virus) enables differentiation of infected from vaccinated animals (the so-called DIVA strategy).

Conclusions

Although equine influenza is a self-limiting disease, it is highly contagious in susceptible populations. There have been considerable advances in development of sensitive and rapid diagnostic tests for equine influenza virus in recent years. Nonetheless, it continues to be imperative to obtain samples that allow characterisation and isolation of new strains of equine influenza virus as effective vaccination remains dependent on relevant strains being included in vaccines. Different vaccine technologies are available for equine influenza; to maximise their effectiveness, consideration must be given to the choice of product and vaccination regimen.

References

• 1. Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Nat Acad Sci USA 2012; 109:4269-4274.
• 2. Sovinová O, Tumová B, Pouska F, et al. Isolation of a virus causing respiratory diease in horses. Acta Virologica 1958; 2:51-61.

3. Waddell GH, Teigland MB, Sigel MM. A new influenza virus associated with equine respiratory disease. JAVMA 1963; 143:587-590.

4. Powell DG, Watkins KL, Li PH, et al. Outbreak of equine influenza among horses in Hong Kong during 1992. Vet Rec 1995; 136:531-536.  - PubMed - 

5. Gupta AK, Yadav MP, Uppal PK, et al. Characterisation of equine influenza isolates from the 1987 epizootic in India by nucleotide sequencing of the HA1 gene. Equine Vet J 1993; 25:99-102.  - PubMed - 

6. Kawaoka Y, Webster RG. Origin of the hemagglutinin on A/Equine/Johannesburg/86 (H3N8): the first known equine influenza outbreak in South Africa. Arch Virol 1989; 106:159-164. - PubMed - 

7. Guthrie AJ. Equine influenza in South Africa, 2003 outbreak. In: Proceedings of the 9th Int Congress World Equine Veterinary Assoc 2006. - Available from www.ivis.org-

8. Guthrie AJ, Stevens KB, Bosman PP. The circumstances surrounding the outbreak and spread of equine influenza in South Africa. Rev Sci Tech 1999; 18:179-185.  - PubMed - 

9. Callinan I. Equine influenza: the August 2007 outbreak in Australia. Report of the equine influenza inquiry. Available from Equine Influenza Inquiry, 2008.

10. Garner MG, Cowled B, East IJ, et al. Evaluating the effectiveness of early vaccination in the control and eradication of equine influenza--a modelling approach. Prev Vet Med 2011; 99:15-27.  - PubMed - 

11. Guo Y, Wang M, Kawaoka Y, et al. Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China. Virology 1992; 188:245-255.  - PubMed - 

12. Guo Y, Wang M, Zheng GS, et al. Seroepidemiological and molecular evidence for the presence of two H3N8 equine influenza viruses in China in 1993-94. J Gen Virol 1995; 76:2009-2014.  - PubMed - 

13. Abdel-Moneim AS, Abdel-Ghany AE, Shany SA. Isolation and characterization of highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 from donkeys. J Biomed Sci 2010; 17:25.  - PubMed - 

14. Crawford PC, Dubovi EJ, Castleman WL, et al. Transmission of Equine Influenza Virus to Dogs. Science 2005; 310:482-485.  - PubMed - 

15. Daly JM, Blunden AS, MacRae S, et al. Transmission of equine influenza virus to English foxhounds. Emerg Infect Dis 2008; 14:461-464.  - PubMed - 

16. Kirkland PD, Finlaison DS, Crispe E, et al. Influenza virus transmission from horses to dogs, Australia. Emerg Infect Dis 2010; 16:699-702.  - PubMed - 

17. Tu J, Zhou H, Jiang T, et al. Isolation and molecular characterization of equine H3N8 influenza viruses from pigs in China. Arch Virol 2009; 154:887-890.  - PubMed - 

18. Kasel JA, Alford RH, Knight V, et al. Experimental infection of human volunteers with equine influenza virus. Nature 1965; 206:41-43.

19. Willoughby R, Ecker G, McKee S, et al. The effects of equine rhinovirus, influenza virus and herpesvirus infection on tracheal clearance rate in horses. Can J Vet Res 1992; 56:115-121.  - PubMed - 

20. Wattrang E, Jessett DM, Yates P, et al. Experimental infection of ponies with equine influenza A2 (H3N8) virus strains of different pathogenicity elicits varying interferon and interleukin-6 responses. Viral Immunol. 2003; 16:57-67.  - PubMed - 

21. Daly JM, Whitwell KE, Miller J, et al. Investigation of equine influenza cases exhibiting neurological disease: co-incidence or association? J Comp Path 2006; 134:231-235.  - PubMed - 

22. Patterson-Kane JC, Carrick JB, Axon JE, et al. The pathology of bronchointerstitial pneumonia in young foals associated with the first outbreak of equine influenza in Australia. Equine Vet J 2008; 40:199-203.  - PubMed - 

23. Newton JR, Mumford JA. Equine influenza in vaccinated horses. Vet Rec 1995; 137:495-496.

24. Jaeschke G, Lange W. Equine influenza outbreaks with viral antigenic drift in Berlin 1988-1991. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 1993; 106:119-123.  - PubMed - 

25. Wood J, Smith KC, Daly J, et al. Viral infections of the equine respiratory tract. In: McGorum B, Robinson E, Schumacher J, et al., eds., Equine respiratory medicine and surgery: Saunders, Elsevier, 2006 p. 287-326.

26. Mumford JA, Rossdale PD. Virus and its relationship to the "poor performance" syndrome. Equine Vet J 1980; 12:3-9.  - PubMed - 

27. Mumford JA, Hannant D, Jessett DM. Experimental infection of ponies with equine influenza (H3N8) viruses by intranasal inoculation or exposure to aerosols. Equine Vet J 1990; 22: 93-98.  - PubMed - 

28. Quinlivan M, Cullinane A, Nelly M, et al. Comparison of sensitivities of virus isolation, antigen detection, and nucleic acid amplification for detection of equine influenza virus. J Clin Microbiol 2004; 42:759-763.  - PubMed - 

29. Quinlivan M, Dempsey E, Ryan F, et al. Real-time reverse transcription PCR for detection and quantitative analysis of equine influenza virus. J Clin Microbiol 2005; 43:5055-5057.  - PubMed - 

30. Foord AJ, Selleck P, Colling A, et al. Real-time RT-PCR for detection of equine influenza and evaluation using samples from horses infected with A/equine/Sydney/2007 (H3N8). Vet Microbiol 2009; 137:1-9.  - PubMed - 

31. Livesay GJ, O'Neill T, Hannant D, et al. The outbreak of equine influenza (H3N8) in the United Kingdom in 1989: diagnostic use of an antigen capture ELISA. Vet Rec 1993; 133:515-519.  - PubMed - 

32. Cook RF, Sinclair R, Mumford JA. Detection of influenza nucleoprotein antigen in nasal secretions from horses infected with A/equine influenza (H3N8) viruses. J Virol Methods 1988; 20:1-12.  - PubMed - 

33. McCabe VJ, Sindle T, Daly JM. Evaluation of the Binax NOW Flu A test kit for the rapid detection of equine influenza virus. Vet Rec 2006; 158:164-165.

34. Chambers TM, Shortridge KF, Li PH, et al. Rapid diagnosis of equine influenza by the Directigen FLU-A enzyme immunoassay. Vet Rec 1994; 135:275-279.  - PubMed - 

35. Quinlivan M, Cullinane A, Nelly M, et al. Comparison of sensitivities of virus isolation, antigen detection, and nucleic acid amplification for detection of equine influenza virus. J Clin Microbiol 2004; 42:759–763.  - PubMed - 

36. Yamanaka T, Tsujimura K, Kondo T, et al. Evaluation of antigen detection kits for diagnosis of equine influenza. J Vet Med Sci 2008; 70:189-192.  - PubMed - 

37. Read AJ, Arzey KE, Finlaison DS, et al. A prospective longitudinal study of naturally infected horses to evaluate the performance characteristics of rapid diagnostic tests for equine influenza virus. Vet Microbiol 2012; 156:246-255.

38. Scott S, Molesti E, Temperton N, et al. The use of equine influenza pseudotypes for serological screening J Mol Genet Med in press.

39. Mumford JA, Wood J. Establishing an acceptability threshold for equine influenza vaccines. Dev Biol Stand 1992; 79:137-146.  - PubMed - 

40. Newton JR, Townsend HG, Wood JL, et al. Immunity to equine influenza: relationship of vaccine-induced antibody in young Thoroughbred racehorses to protection against field infection with influenza A/equine-2 viruses (H3N8). Equine Vet J 2000; 32:65-74.  - PubMed - 

41. Mumford JA, Jessett D, Dunleavy U, et al. Antigenicity and immunogenicity of experimental equine influenza ISCOM vaccines. Vaccine 1994; 12:857-863.  - PubMed - 

42. Mumford JA, Wilson H, Hannant D, et al. Antigenicity and immunogenicity of equine influenza vaccines containing a Carbomer adjuvant. Epidemiol Infect 1994; 112:421-437.  - PubMed - 

43. Paillot R, Kydd JH, MacRae S, et al. New assays to measure equine influenza virus-specific Type 1 immunity in horses. Vaccine 2007; 25:7385-7398.  - PubMed - 

44. Paillot R, Grimmett H, Elton D, et al. Protection, systemic IFNgamma, and antibody responses induced by an ISCOM-based vaccine against a recent equine influenza virus in its natural host. Vet Res 2008; 39:21.  - PubMed - 

45. Paillot R, Prowse L. ISCOM-matrix-based equine influenza (EIV) vaccine stimulates cell-mediated immunity in the horse. Vet Immunol Immunopathol 2012; 145:516-521.  - PubMed - 

46. Paillot R, Prowse L, Montesso F, et al. Whole inactivated equine influenza vaccine: Efficacy against a representative clade 2 equine influenza virus, IFNgamma synthesis and duration of humoral immunity. Vet Microbiol 2013; 162:396-407.  - PubMed - 

47. Wood JLN. Equine influenza: history and epidemiology and a description of a recent outbreak. London School of Hygiene and Tropical Medicine. London: University of London, 1991.

48. Gildea S, Arkins S, Walsh C, et al. A comparison of antibody responses to commercial equine influenza vaccines following annual booster vaccination of National Hunt Horses - a randomised blind study. Vaccine 2011; 29:3917-3922.  - PubMed - 

49. Cullinane A, Weld J, Osborne M, et al. Field studies on equine influenza vaccination regimes in thoroughbred foals and yearlings. Vet J 2001; 161:174-185.  - PubMed - 

50. van Maanen C, Bruin G, de Boer-Luijtze E, et al. Interference of maternal antibodies with the immune response of foals after vaccination against equine influenza. Vet Q 1992; 14:13-17.  - PubMed - 

51. Van Oirschot JT, Bruin G, de Boer-Luytze E, et al. Maternal antibodies against equine influenza virus in foals and their interference with vaccination. Zentralbl Veterinarmed B 1991; 38:391-396.  - PubMed - 

52. Minke JM, Toulemonde CE, Dinic S, et al. Effective priming of foals born to immune dams against influenza by a canarypox-vectored recombinant influenza H3N8 vaccine. J Comp Pathol 2007; 137 Suppl 1:S76-80.  - PubMed - 

53. Daly JM, Yates PJ, Newton JR, et al. Evidence supporting the inclusion of strains from each of the two co-circulating lineages of H3N8 equine influenza virus in vaccines. Vaccine 2004; 22:4101–4109.  - PubMed - 

54. Newton JR, Verheyen K, Wood JL, et al. Equine influenza in the United Kingdom in 1998. Vet Rec 1999; 145:449-452.  - PubMed - 

55. Anon. Harmonisation of Requirements for Equine Influenza Vaccines: Specific Requirements for Substitution of a Strain. 1998. Available from: European Commission.

56. OIE. Conclusions and recommendations from the consultation meeting of OIE and WHO experts on equine influenza, Newmarket, United Kingdom, September 18-19, 1995. OIE Bulletin 1996; 108:482-484.

57. Daly JM, Lai AC, Binns MM, et al. Antigenic and genetic evolution of equine H3N8 influenza A viruses. J Gen Virol 1996; 77:661-671.  - PubMed - 

58. Kawaoka Y, Bean WJ, Webster RG. Evolution of the hemagglutinin of equine H3 influenza viruses. Virology 1989; 169:283-292.

59. Bryant NA, Rash AS, Russell CA, et al. Antigenic and genetic variations in European and North American equine influenza virus strains (H3N8) isolated from 2006 to 2007. Vet Microbiol 2009; 138:41-52.  - PubMed - 

60. Bryant NA, Rash AS, Woodward AL, et al. Isolation and characterisation of equine influenza viruses (H3N8) from Europe and North America from 2008 to 2009. Vet Microbiol 2011; 147:19-27.  - PubMed - 

61. Anon. OIE expert surveillance panel on equine influenza vaccine composition. OIE Bulletin 2012; 2:48-49.

62. Yamanaka T, Tsujimura K, Kondo T, et al. Efficacy of oseltamivir phosphate to horses inoculated with equine influenza A virus. J Vet Med Sci 2006; 68:923-928.  - PubMed - 

63. Yamanaka T, Yamada M, Tsujimura K, et al. Clinical pharmacokinetics of oseltamivir and its active metabolite oseltamivir carboxylate after oral administration in horses. J Vet Med Sci 2007; 69:293-296.  - PubMed - 

64. Rees WA, Harkins JD, Lu M, et al. Pharmacokinetics and therapeutic efficacy of rimantadine in horses experimentally infected with influenza virus A2. Am J Vet Res 1999; 60:888-894.  - PubMed - 

65. Rees WA, Harkins JD, Woods WE, et al. Amantadine and equine influenza: pharmacology, pharmacokinetics and neurological effects in the horse. Equine Vet J 1997; 29:104-110.  - PubMed - 

66. Yamanaka T, Bannai H, Nemoto M, et al. Efficacy of a single intravenous dose of the neuraminidase inhibitor peramivir in the treatment of equine influenza. Vet J 2012; 193:358-362.  - PubMed - 

67. Chambers TM, Holland RE, Lai ACK. Equine influenza - current veterinary perspectives, part 2. Eq Practice 1995; 17:26-30.

68. Barquero N, Daly JM, Newton JR. Risk factors for influenza infection in vaccinated racehorses: lessons from an outbreak in Newmarket, UK in 2003. Vaccine 2007; 25:7520-7529.  - PubMed - 

69. Gildea S, Arkins S, Cullinane A. Management and environmental factors involved in equine influenza outbreaks in Ireland 2007-2010. Equine Vet J 2011; 43:608-617.  - PubMed -