miércoles, 23 de agosto de 2017

EL VIRUS DE LA HEPATITIS E EN EL CERDO Y SU TRANSMISIÓN AL HOMBRE

El virus de la hepatitis E en el cerdo y su transmisión al hombre. Nilsa de Deus, Joaquim Segalés. 2013



El virus de la hepatitis E en el cerdo y su transmisión al hombre
La hepatitis E es una enfermedad humana importante en países en vías de desarrollo de Asia y África. En la epidemiología de la infección cada vez cobra más importancia el ganado porcino, ya que se han detectado cepas víricas porcinas genéticamente muy similares a las del hombre.
Nilsa de Deus1 y Joaquim Segalés2,3 
1Centro de Investigação em Saúde da Manhiça (CISM), Manhiça, Mozambique. 
2Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Barcelona, España 
3Departament de Sanitat i Anatomia Animals, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Barcelona, España. 
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El virus de la hepatitis E (VHE) es un virus RNA sin envoltura de aproximadamente 27-30 nm de diámetro cuyo genoma tiene 7,2 kb de tamaño (Reyes et al., 1993). El VHE es agente causal de la hepatitis E (HE), una enfermedad humana importante en países en vías de desarrollo de Asia y África. En estos países, el VHE causa importantes brotes de hepatitis asociados a condiciones sanitarias deficientes (Panda et al., 2007) y puede causar hasta el 25% de mortalidad en mujeres embarazadas (Emerson y Purcell, 2003; Purcell y Emerson, 2000). Contrariamente a lo que se observa en los países en vías de desarrollo, la epidemiología de la enfermedad es diferente en países industrializados, donde la HE se asocia habitualmente a pacientes que han viajado a zonas endémicas (Balayan, 1993; Cacopardo et al., 1997; Coursaget et al., 1993). Actualmente los casos autóctonos de hepatitis E están aumentando en los países industrializados mucho más que los casos “importados” (Nicand et al., 2009).


La importancia del cerdo en la epidemiología de la infección por el VHE en el hombre va ganando terreno en la medida en que se detectan cepas víricas porcinas genéticamente muy similares a las del hombre (Meng et al., 1997). Por otro lado, la mayor prevalencia de anticuerpos frente al virus en veterinarios y personal trabajador del sector porcino (Meng et al., 2002) también significó un mayor interés en el estudio de esta infección en el cerdo. Además, en países como Japón, donde existe la costumbre de comer carne poco cocinada o cruda, se ha constatado una asociación entre casos de HE y el consumo de derivados de cerdo y jabalí poco o mal cocinados (Matsuda et al., 2003; Tamada et al., 2004; Tei et al., 2003). Por todo ello, el conocimiento de la infección natural por VHE en el cerdo es de vital importancia en los países industrializados donde la frecuencia de casos de hepatitis E autóctonos ligados a consumo de carne ha aumentado recientemente. 

Epidemiología de la infección en el cerdo

El VHE es endémico en cerdos tanto de países en vías de desarrollo como de países industrializados (Lu et al., 2006; Okamoto, 2007). La seroprevalencia frente al VHE en el cerdo varía según países, granjas y edades, y puede llegar a ser muy elevada (>90%) en áreas geográficas donde la enfermedad no es endémica en la especie humana (Choi y Chae, 2003; Cooper et al., 2005; Hsieh et al., 1999). En España, de 41 granjas analizadas, 40 (97,5%) presentaban animales positivos a IgG anti-VHE (Seminati et al., 2008). Además, estudios serológicos retrospectivos realizados también en España indican que el VHE se encuentra en la cabaña porcina de forma ubicua desde 1985 (Casas et al., 2009b), mucho antes de la primera descripción molecular de este virus (Meng et al., 1997). Concretamente, de las 208 granjas analizadas retrospectivamente, 204 (98%) fueron positivas a IgG anti-VHE. 

El VHE se puede detectar en animales de 1 a 22 semanas de edad (de Deus et al., 2008), con mayor prevalencia entre los 3 y los 4 meses de vida (Choi et al., 2003; Huang et al., 2002). La mayor prevalencia de infección observada en estas edades está relacionada con la disminución de los anticuerpos maternales y con el incremento de la probabilidad de que los animales se infecten debido a la contaminación fecal del ambiente, del alimento y del agua (Williams et al., 2001). 

En una granja convencional, la dinámica de infección por el VHE es muy similar a otros agentes víricos (de Deus et al., 2008). Una elevada proporción de animales adultos son seropositivos y los lechones lactantes presentan anticuerpos IgG e IgA anti-VHE adquiridos de forma pasiva. Estos anticuerpos tienen una duración variable dependiendo de la cantidad de anticuerpos maternales transferidos (Meng et al., 1997). Lechones nacidos de madres con títulos de anticuerpos muy elevados pueden ser seropositivos hasta las 9 semanas de edad (de Deus et al., 2008; Meng et al., 1997). Una vez que los animales pierden los anticuerpos maternales, se infectan y la seroconversión se da entre las 12 y 14 de edad, aproximadamente. La seroconversión se caracteriza por la aparición primero de IgA e IgM anti-VHE alrededor de las 12 semanas de edad y una semana después por la aparición de IgG anti-HEV anti-VHE. Las IgM se pueden detectar durante un periodo entre 5-7 semanas, mientras que las IgG duran hasta la edad del sacrificio (de Deus et al., 2008; Meng et al., 1997). La detección de IgM habitualmente está relacionada con la presencia de virus en sangre (viremia), lo que significa que este tipo de anticuerpo es indicativo de la fase aguda de la infección. 

Entre las 12 y 15 semanas de edad, se observa el pico de infección, momento en que el VHE puede ser detectado, además de en sangre, en bilis, nódulo linfático mesentérico, hígado y heces en más del 50% de los animales infectados. En paralelo se pueden observar lesiones hepáticas que varían de intensidad leve a moderada; en ningún caso se observan lesiones macroscópicas significativas y que sean causa de sintomatología clínica (de Deus et al., 2008).

Transmisión zoonótica del VHE
La evidencia de la transmisión zoonótica del VHE se observó en individuos que habían ingerido hígado crudo o poco cocinado de cerdo y desarrollaron hepatitis (fatal en algún caso). Las cepas descritas en estos pacientes presentaron una identidad nucleotídica del 98,5-100% con las cepas detectadas en hígados de cerdos vendidos en carnicería (Yazaki et al., 2003). Por otro lado, también se han descrito casos de hepatitis en pacientes que habían consumido carne de cerdo y jabalí crudas o poco cocidas (Masuda et al., 2005; Yazaki et al., 2003). Los hechos descritos y la relativamente alta seroprevalencia frente al VHE observada en personas aparentemente sanas en países industrializados sugiere que el VHE podría ser realmente una zoonosis, y no solamente restringida a colectivos profesionales concretos, como se había sugerido previamente (Drobeniuc et al., 2001; Meng et al., 2002). Un factor aparentemente tranquilizante es el hecho de que la seroprevalencia en el cerdo es extremadamente elevada, mientras que la ocurrencia de HE en humanos en países desarrollados continúa siendo muy baja.

Patogénesis y signos clínicos

Estudios epidemiológicos iniciales indicaban que los cerdos de 2 a 4 meses de edad eran los que básicamente se infectaban por el VHE. No obstante, trabajos recientes han detectado el virus en lechones de un mes de edad (de Deus et al., 2007; Fernandez-Barredo et al., 2006), lo que inicia el debate sobre la transmisión del virus en edades muy tempranas. Una posible explicación es que las cerdas podrían ser una causa significativa de infección para los lechones, sea por transmisión vertical u horizontal (de Deus et al., 2008). Sin embargo, hasta el momento no se han publicado evidencias inequívocas de la transmisión del virus de la cerda a sus lechones. 

La transmisión horizontal del virus se ha demostrado, pero queda la duda sobre la eficacia de la transmisión. Todo indica que, a nivel de campo, la transmisión horizontal es efectiva, pero experimentalmente sólo se ha conseguido esta eficacia por vía endovenosa y cuando el cerdo consigue excretar grandes cantidades de virus (Bouwknegt et al., 2008). En cambio, cuando los animales son desafiados por vía oronasal, la infección de cerdos por contacto sucede de forma esporádica (Casas et al., 2009a). Por otro lado, hasta el momento no se ha evidenciado la existencia de transmisión vertical del VHE con la infección experimental de cerdas gestantes, las cuales si fueron capaces de infectarse y seroconvertir (Kasorndorkbua et al., 2003). En este mismo experimento tampoco se observó mortalidad en las hembras gestantes, tal como se ha descrito en la especie humana.


De forma natural, se asume que el cerdo se infecta por la vía orofecal. De hecho se ha demostrado experimentalmente esta ruta de infección usando cerdos libres de patógenos específicos (SPF). Una vez que los animales se infectan por la vía oral, el virus se replica en el tracto digestivo y llega al hígado presuntamente a través de la vena porta, donde se replica en los hepatocitos y se excreta en bilis y heces (Choi y Chae, 2003). No obstante, estudios experimentales han demostrado que el VHE en el cerdo se replica en otros órganos aparte del hígado (Williams et al., 2001), incluyendo intestino delgado, colon y nódulos linfáticos. El virus también puede detectarse en epitelio de conductos biliares así como en el intestino delgado y grueso, nódulos linfáticos, tonsila, bazo y riñones de animales infectados de forma natural (Choi y Chae, 2003). 

Al contrario de lo que puede ocurrir en el hombre, la infección por el VHE en el cerdo cursa sin signos clínicos aparentes (Halbur et al., 2001). Al infectar cerdos con cepas tanto humanas como porcinas del VHE se ha observado que pueden inducir una hepatitis subclínica en el cerdo (Halbur et al., 2001). Las lesiones macroscópicas que se describen incluyen un ligero incremento de tamaño de los nódulos linfáticos mesentéricos. Histológicamente se observa hepatitis multifocal linfoplasmocitica, de leve a moderada (Martin et al., 2007; Meng et al., 1997). Las lesiones hepáticas están relacionadas con el pico de detección del virus en bilis y en nódulo linfático mesentérico (de Deus et al., 2007) y con altos valores de densidad óptica de IgG e IgM anti-VHE (de Deus et al., 2008). 

Bibliografía disponible en www.albeitar.grupoasis.com/bibliografias/virushepatitisE137.doc

viernes, 18 de agosto de 2017

FALLOS VACUNAS DEPENDIENTES DEL ANIMAL: MITOS Y REALIDADES Fernando Fariñas G 2015

Fallos vacunales dependientes del animal: mitos y realidades

Inmunología y enfermedades infecciosas


Fallos vacunales dependientes del animal: mitos y realidades
Son muchos los factores que pueden afectar a la inmunidad de las mascotas, y todas las vacunas dependen de su sistema inmunitario para conseguir las respuestas protectoras adecuadas y deseadas. Por lo tanto, es posible que la inmensa mayoría de los fallos vacunales sean en realidad fallos de inmunización achacables al vacunado.
Dr. Fernando Fariñas GuerreroInstituto de Inmunología Clínica y Enfermedades Infecciosas
f.fariñas@inmucei.com 
farinas.inmunopatologia@gmail.com

La vacunación forma parte importante de los programas de salud que se aplican a nuestras mascotas. Normalmente, los veterinarios siguen las recomendaciones de administración que indica el laboratorio fabricante, directrices que a menudo incluyen revacunaciones anuales. Sin embargo, hace ya unos años se están abordando cuestiones e incluso dudas acerca de la duración de la inmunidad conferida por algunas vacunas y la necesidad o no de estas revacunaciones anuales, sobre todo en perros adultos. Por otra parte, otros especialistas creen que los datos actuales no demuestran adecuadamente los periodos de inmunidad previstos por los laboratorios fabricantes. De esta forma, los veterinarios clínicos se encuentran en una posición difícil a la hora de informar a los propietarios de sus pacientes.
Además, la vacunación no es siempre un procedimiento inocuo y su uso debe acompañarse de manera invariable de una evaluación de los riesgos, lo que se denomina “virulencia residual o efectos secundarios de las vacunas”.
Es evidente que la capacidad de inmunización de una vacuna en cada animal va a depender de múltiples factores propios de este último entre los que cabe destacar la edad, el sexo, la raza, la existencia o no de enfermedades de base (neoplasias, alergias, endocrinopatías, etc.), la administración de fármacos inmunosupresores (corticoides, ciclosporina, azatioprina, etc.) y la existencia de estados de malnutrición y estrés entre otros. Así, existen trabajos que refieren, en relación a la vacunación frente a la rabia, que las razas pequeñas presentan unos niveles de seroconversión (tanto en el título como en la duración de estos altos títulos) mayores y mejores que las razas grandes, dándose en estas últimas un mayor número de “fallos vacunales”. Igualmente, se ha comprobado que los animales menores de un año vacunados de rabia presentan un nivel de respuesta muy inferior a los adultos, lo que plantea la necesidad de aplicaciones booster en los primeros y posibilidad de revacunaciones más tardías en los últimos.
Por otro lado y como ya se ha comentado anteriormente, otro factor a tener en cuenta es que la población de perros y gatos en situación de “inmunocompromiso” en los países desarrollados, con acceso a servicios veterinarios, es bastante elevada. Muchos son los animales en tratamiento inmunosupresor por múltiples patologías (alergias, enfermedades autoinmunes, etc.), a los que hay que sumar un largo etcétera de animales sometidos a grandes cirugías, que padecen enfermedades crónicas, o infecciones inmunodisregulatorias (infección por LeishmaniaEhrlichia, FIV, FeLV, etc.). Esto hace que la probabilidad de fallos vacunales en la primovacunación se encuentre incrementada y/o que la duración de la inmunidad conferida sea de corta duración.

Características de una vacuna ideal
La vacuna ideal debería cumplir una serie de requisitos entre los que se encuentran:
  • Inducir respuestas adecuadas.
  • Que ofrezca seguridad de forma que la inmunidad que genere no sea a costa de enfermar o lesionar al animal.
  • Que sea estable. El gran problema de las vacunas es la necesidad de mantener ciertas condiciones para que sea eficaz. Esto es más cierto en el caso de las vacunas vivas, en las que la interrupción de la cadena de frío puede literalmente “matar” al microorganismo que incorpora. Una vez administrada no es capaz de multiplicarse en el animal y por lo tanto no genera una respuesta inmunitaria adecuada.
  • Que su coste sea bajo. En ocasiones las mejoras en la fabricación de vacunas pasan por su enriquecimiento con adyuvantes que son clave para generar una respuesta inmunitaria potente (leucotoxinas, proteínas de membrana, ISCOMS, SAF-1, citoquinas, etc.). Con esto se logra una mejor protección, pero los costes se ven incrementados considerablemente.

Todo esto hace que, en ocasiones, estemos jugando a ciegas ya que probablemente habrá animales que lleguen y superen con creces la expectativa de la vacuna, y habrá otros muchos que no lleguen a producir un nivel suficiente de inmunidad frente a la misma.

Inmunidad y vacunación
La respuesta inmunitaria frente a una infección natural o a una vacuna ha sido evaluada generalmente midiendo títulos de anticuerpos en suero y correlacionando estos con distintos grados de protección o susceptibilidad. Esto es esencialmente cierto en el moquillo, parvovirosis, adenovirosis y borreliosis, donde altos niveles de anticuerpos se correlacionan muy bien con la protección frente al desafío. Sin embargo, una protección adecuada frente a cualquier agente infeccioso, puede requerir una fuerte inmunidad celular, una potente inmunidad humoral o una combinación de ambas. Así, las infecciones por Bordetella bronchiseptica, coronavirus o parainfluenza pueden causar un gran daño en las superficies mucosas y se requerirá una inmunidad mucosal eficaz para inducir un alto nivel de protección. Para estas enfermedades, por ejemplo, la concentración de anticuerpos séricos no se correlaciona con la protección. En general, la evaluación de la inmunidad celular en las distintas enfermedades caninas y felinas y sus vacunas, ha sido siempre la gran olvidada. En la literatura científica actual, pocos trabajos “rematan” sus resultados con medidas de esta inmunidad celular, a pesar de que hace años se han venido publicando casos de animales protegidos frente a una enfermedad que son seronegativos para la misma. Es seguro que en muchísimas de estas patologías, sino en todas, la inmunidad celular tiene un papel preponderante en el desarrollo de un grado significativo de protección. Así, habrá animales que presenten un título bajo de anticuerpos y, sin embargo, estén plenamente protegidos frente a la enfermedad gracias a la presencia de una inmunidad celular no medida en los test diagnósticos.
Por lo tanto, la vacuna ideal no va a ser la que induzca la formación de gran cantidad de anticuerpos, sino la que sea capaz de imitar al sistema inmunitario cuando este consigue resolver una infección. Incluso empleando la vacuna más ideal del mercado, hay que tener en cuenta que el éxito de esta en la prevención de una infección determinada no va a depender exclusivamente de su capacidad para inducir la formación de anticuerpos. Es más, en algunos casos los anticuerpos generados pueden resultar inútiles porque no son capaces de neutralizar el patógeno o incluso estos anticuerpos pueden favorecer la persistencia de la infección (anticuerpos facilitadores de la infección) o generar respuestas inmunopatológicas indeseables, dando lugar al desarrollo de fenómenos alérgicos y/o autoinmunes.


Fallos de inmunización

Incluso cuando se ha llevado a cabo la vacunación correcta del animal, la probabilidad de establecer una protección eficaz nunca es del 100 %. Esta proporción va a depender de muchos factores, alguno de los cuales implican al animal en sí y otros están asociados a la vacuna, bien sea a su composición (antígenos que incorpora, adyuvantes, etc.) o al mal uso de la misma (no respetar las instrucciones de administración o conservación impuestas por el fabricante, etc.). Todos estos factores que conllevan un mal resultado en la vacunación y que a veces implican que sea peor el remedio que la enfermedad, son los denominados fallos vacunales o fallos de inmunización activa. De hecho, para que una vacuna alcance su máxima eficacia hay que tener en cuenta varios factores dependientes del animal que recibe dicha vacuna.
Genética
Hoy sabemos que existen animales y razas que son genéticamente más resistentes que otros a distintas enfermedades. Incluso, podemos afirmar que dentro de una misma raza, existirán animales con un “bagaje genético” de mayor resistencia a enfermedades y a esto pueden deberse las diferencias observadas en cuanto a protección vacunal de unos y otros. Es bien conocida la susceptibilidad de razas como los Rottweiler, Doberman, Labrador y Pastor Alemán, entre otros, al padecimiento de cuadros graves de parvovirosis o a la tendencia a mostrar respuestas vacunales más pobres frente a este virus. Igualmente conocida es la susceptibilidad del Husky, Alaskan Malamute y otras razas nórdicas, al padecimiento y pobre respuestas vacunales al virus del moquillo.
Ni que decir tiene que una deficiencia genética en cualquiera de los componentes inmunológicos puede dar lugar al desarrollo de un “fallo vacunal” además de provocar, en ocasiones, un grave estado de “indefensión” frente a todo tipo de infecciones, tumores y al desarrollo concomitante de enfermedades autoinmunes por la existencia de mecanismos inmunológicos disregulados.
Dentro de estas, la deficiencia de una o más clases de inmunoglobulinas, es la inmunodeficiencia primaria más común en perros y gatos. Los signos clínicos de este desarreglo pueden no manifestarse hasta que se han agotado los anticuerpos maternos (12-15 semanas de edad). Los cachorros que no reciben un buen calostro, se hacen susceptibles a más temprana edad, con el desarrollo de infecciones respiratorias y gastrointestinales frecuentes.
Deficiencia de IgA
Probablemente la más frecuente de estas sea la deficiencia de IgA; esta se diagnostica cuando el título de dicha inmunoglobulina se sitúa por debajo de los 40-160 mg/dl. Un alto porcentaje de los animales con este déficit no va a mostrar signos de enfermedad infecciosa y en algunos se van a dar cuadros complicados de infecciones respiratorias, digestivas y tendencia a neoplasias linfoides. Recientemente también se sabe que muchas de estas inmunodeficiencias no sólo pueden predisponer al padecimiento de infecciones, sino también al desarrollo de cuadros alérgicos y/o autoinmunes. En el Pastor Alemán por ejemplo, se ha descrito una deficiencia de IgA que aparece con la presencia de enfermedades mucosas diversas que incluyen, colitis linfoplasmocitarias, fístulas perianales, pioderma profunda y aspergilosis diseminada principalmente por Aspergillus terreus. En el Beagle y Cocker Spaniel, se han observado casos de deficiencias selectivas de IgA asociadas a hipersensibilidad y patología autoinmunitaria, principalmente tiroiditis, orquitis, adrenalitis con hipoadrenocorticismo y lupus eritematoso sistémico. En otra raza, el Sharpei, se describen con frecuencia deficiencias selectivas de una o dos inmunoglobulinas (déficit de IgA o de IgA e IgG combinados), en muchos casos también asociados con dermatitis atópica y enfermedades autoinmunes.
Inmunodeficiencia Severa Combinada
Otro tipo de inmunodeficiencia primaria afortunadamente menos frecuente pero más grave es la Inmunodeficiencia Severa Combinada (IDSC), causada por un fallo tanto en la respuesta celular mediada por linfocitos T como en la producción de anticuerpos o inmunidad humoral mediada por linfocitos B. Se ha descrito en perros, y los cachorros recién nacidos suelen presentar cuadros graves de pioderma, otitis, gastroenteritis e infecciones respiratorias de etiología bacteriana que no responden o responden mal al tratamiento antimicrobiano. La mayoría de estos cachorros muere sobre los cuatro meses de edad por infecciones bacterianas diseminadas, por moquillo provocado por virus campo o por la cepa vacunal administrada en las vacunaciones. Desde un punto de vista laboratorial se aprecia bajo número o incluso ausencia de linfocitos T y B, y títulos bajos o ausentes de IgG, M y A. En la necropsia es patente la hipoplasia o aplasia de tejido linfoide, especialmente timo y linfonodos.
Edad
Desde el punto de vista inmunológico sabemos que los animales presentan unas capacidades defensivas que varían a lo largo de su desarrollo. Así, los animales recién nacidos y jóvenes al presentar un sistema inmunitario inmaduro, están predispuestos a que estos fallos vacunales sean más frecuentes. Esto mismo ocurre en los animales viejos, ya que el sistema defensivo de estos ha entrado en una fase conocida como inmunosenescencia o envejecimiento inmunológico, lo cual evidentemente le hace un fiel candidato a la no-respuesta o baja respuesta vacunal.
En los animales recién nacidos, la inmunidad depende directamente de aquella que le proporciona la madre vía calostral. Este sistema de donación de anticuerpos y células inmunológicas se da durante un periodo muy corto de tiempo, de tal forma que transcurrido este, la translocación de anticuerpos finaliza. Sabemos que un porcentaje significativo de los animales recién nacidos no recibe niveles adecuados de anticuerpos, lo que da lugar a una alta frecuencia de morbi-mortalidad neonatal. La razón de los fallos en esta translocación se deben principalmente a:
  • Condiciones no naturales del parto y lactación.
  • Nacimiento de animales débiles o deformes.
  • Retraso en el inicio de la lactancia.
  • Muerte de la madre.
  • Escasa producción de calostro.
  • Baja concentración de anticuerpos en calostro.
  • Escaso instinto maternal.
  • Camadas numerosas.
  • Amedrentamiento de animales débiles por parte de los fuertes.
Queda claro que el sistema inmunitario del cachorro recién nacido no responde de la misma forma que el de un perro adulto, ya que aquel muestra un perfil de respuesta prácticamente de tipo Th2 (inmunidad humoral), con pobres o deficientes respuestas de tipo Th1 (inmunidad celular). El desafío inmunológico al que sometemos al neonato a través de la vacunación debe claramente producir un impacto en el desarrollo del sistema inmunitario del cachorro. Algunos estudios han evaluado el efecto de la vacunación en el sistema inmunitario de los cachorros y han demostrado alteraciones inmunológicas evidentes. Por ejemplo, un estudio demostró la existencia de linfopenia siete días después del desafío vacunal. A pesar de estas observaciones, no hay duda de que en términos de riesgo/beneficio, la vacunación neonatal es crucial en la protección de los individuos y de la población frente a las enfermedades infecciosas.
Aunque no existe consenso sobre esta cuestión, normalmente se ha recomendado vacunar a los animales entre las 8-9 semanas de edad, y que la primovacunación no acabe antes de las 12-16 semanas de vida. Algunas primovacunaciones comienzan tan pronto como a las seis semanas de edad, con revacunaciones a veces muy frecuentes, otras finalizan demasiado pronto (a las 10-11 semanas), incrementado esto el riesgo de fallo vacunal. Hoy se acepta por los especialistas en el tema, que la frecuencia de revacunación es demasiado elevada y los esfuerzos se dirigen a acortar el número de vacunaciones y mejorar la inmunidad del animal.
Interferencia vacunal por anticuerpos maternos
Cuando en un animal se encuentran presentes anticuerpos maternales transferidos vía calostro, las propiedades antigénicas de la vacuna pueden verse neutralizadas y no se desarrolla una respuesta adecuada frente a ella.
Como en cualquier otra especie doméstica, se asume que el cachorro recién nacido tiene todos los componentes anatómicos de un sistema inmunológico inmaduro funcionalmente, y que se encuentra todavía bajo la influencia regulatoria del sistema inmunológico materno.
El mejor aspecto documentado del desarrollo del sistema inmunológico canino se refiere al requerimiento esencial de transferencia pasiva de inmunidad vía calostro. La especie canina tiene una placentación endoteliocorial zonaria, donde se establece una barrera relativamente impenetrable que dificulta la transferencia de anticuerpos desde la madre al feto.
Se acepta generalmente que, a través de esta barrera, pueden pasar pequeñas cantidades de anticuerpos tipo IgG llegando a alcanzar un 5-10 % de los niveles normales del perro adulto.
En las primeras 24 horas tras el nacimiento, el cachorro debe ingerir calostro rico en inmunoglobulinas. Esto le va a proveer de una inmunidad humoral y celular pasiva. Una vez ingerido el calostro, se van a absorber los anticuerpos, principalmente IgG, IgM e IgA, aunque en este último caso no se sabe muy bien si la IgA calostral es absorbida y re-excretada o si no se absorbe y simplemente se mantiene en la luz intestinal. Existe una variación considerable entre camadas en la eficiencia de la absorción de inmunoglobulina calostral, dependiendo de factores como el tamaño y fortaleza de los recién nacidos o de las capacidades maternas de la perra entre otros.
Se ha demostrado que el calostro canino es rico tanto en IgG como en IgA. Los cachorros recién nacidos tienen concentraciones séricas de IgG de 1,2 mg/ml la cual se incrementa a 23 mg/ml 12 horas después de la ingestión de calostro, teniendo concentraciones séricas menores de IgA e IgM (0,45 mg/ml y 0,2 mg/ml respectivamente).
La ingestión de estas inmunoglobulinas maternas es un arma de doble filo porque por una parte es un proceso vital para el recién nacido, ya que algún fallo en este mecanismo le hace susceptible a infecciones neonatales a menudo mortales y, por otro lado, la presencia de altas concentraciones de inmunoglobulinas maternas inhibe el desarrollo de la respuesta inmunitaria propia del animal. Esta inmunidad no se empieza a establecer hasta que la concentración de anticuerpos maternos ha descendido lo suficiente (la vida media de un anticuerpo materno IgG es de aproximadamente ocho días). Además, se ha sugerido que la tasa de crecimiento del recién nacido contribuye a la velocidad de degradación de los anticuerpos maternos, y son las razas de crecimiento más rápido las que más rápidamente eliminan estas inmunoglobulinas. Algunos estudios han puesto en evidencia que, en ausencia de transferencia de inmunoglobulinas maternas, los cachorros son capaces de responder a antígenos (por ejemplo vacuna de parvovirus) tan pronto como a las dos semanas de edad. Incluso algunos estudios han indicado que cachorros de un día de edad que no han recibido anticuerpos maternos, cuando son vacunados con vacuna viva frente a parvovirus o moquillo, desarrollan una respuesta serológica a los 21-91 días posvacunación, similar en magnitud a la respuesta de un cachorro más mayor.
El tiempo en el que un cachorro llega a hacerse inmunocompetente (generalmente se acepta que es entre las 6 y 12 semanas), depende de la concentración de anticuerpos maternos ingeridos, lo cual significa que no se puede establecer una medida o valor medio que asegure predecir cuándo un cachorro en particular se hace inmunocompetente.
Esto es muy importante a la hora de establecer un programa vacunal. Está claro que no todas las vacunas existentes funcionan por igual ni son capaces de superar esa interferencia materna. Actualmente existen en el mercado nuevas vacunas que tienen la capacidad de estimular la inmunidad del recién nacido incluso en presencia de anticuerpos maternos, superando el umbral de interferencia establecido por estas.
Nutrición
Existe una íntima relación entre la capacidad inmunológica de un animal y su estado nutricional, de tal forma que una nutrición tanto deficiente como excesiva pueden dar lugar a un proceso de inmunodeficiencia nutricional y un consecuente estado de no-respuesta a la vacuna. Por ejemplo, se sabe que deficiencias de cinc en hembras preñadas conlleva que la descendencia padezca una depresión intensa de la actividad inmunitaria.
Enfermedades concurrentes
Ciertas enfermedades, si están presentes en el momento de la vacunación, pueden predisponer a un estado de hiporrespuesta vacunal. Esto es particularmente cierto para diversas patologías:
  • Enfermedades parasitarias (leishmaniosis, helmintosis, etc.).
  • Enfermedades alérgicas.
  • Inmunodeficiencias secundarias o adquiridas. Mucho más frecuentes que las primarias vistas anteriormente. Estas inmunodeficiencias pueden estar asociadas a infecciones (por ejemplo FIV, FeLV, parvovirus, moquillo) o ser consecuencia de procesos neoplásicos, nefropatías, metabolopatías, desarreglos nutricionales, farmacoterapia, cirugía o estrés psicológico. El cuadro clínico que se desarrolla es similar al de las primarias pero, a diferencia de estas, puede ser superada si la causa subyacente se corrige.
Cada una de estas patologías se caracteriza por el establecimiento en el animal de un estado inmunológico de hiporrespuesta por alteración de la función inmunitaria de células y órganos linfoides, incluso cuando no se observen síntomas clínicos.
Estrés
Como ya se ha comentado, el estrés puede ser inducido en el animal de múltiples formas como son nutrición pobre, transporte, maltrato, etc., de modo que este puede llegar a sobreactivar el llamado eje hipotalámico-hipofisario-adrenal con la consiguiente producción de altos niveles de adrenalina y cortisol endógenos, hormonas con un conocido efecto inmunosupresor. Desde este punto de vista, es evidente que animales estresados pueden responder mal a las vacunas.
La utilización de fármacos, como corticoides y ciertos antibióticos (principalmente sulfamidas), puede predisponer a estados de inmunodeficiencia, una de cuyas consecuencias sería un incremento en la probabilidad de que se den estos fallos vacunales.
Como hemos visto a lo largo de este artículo, son muchos los factores que pueden llegar a afectar la inmunidad de nuestras mascotas, y a pesar de la gran cantidad de vacunas de alta calidad existentes en el mercado, todas ellas dependen de este sistema inmunitario para llegar a conseguir las respuestas protectoras adecuadas y deseadas. Por lo tanto, a la hora de evaluar cualquier fallo en la vacunación de nuestros pacientes creo conveniente y necesario establecer un protocolo de búsqueda de posibles fallos dependientes del estatus inmunitario del animal vacunado. Si seguimos estas recomendaciones, observaremos que en un gran número de casos no se han dado realmente fallos vacunales achacables a la vacuna, sino más bien fallos de inmunización achacables al vacunado.

Reacciones vacunales
Las ventajas de la vacunación están ampliamente documentadas al contrario que el riesgo de efectos adversos que, en muchos casos, son hipotéticos y se sustentan en estudios no contrastados. En muy raras ocasiones se ha podido determinar la verdadera prevalencia de efectos adversos asociados a la vacunación. En un estudio revolucionario realizado por Moore y colaboradores donde se determinó la prevalencia de efectos adversos sucedidos a los tres días tras la vacunación, del 1.226.159 de perros vacunados, se registraron 4.678 reacciones vacunales (38,2/10.000 perros). De estas, el 72,8 % tuvieron lugar el mismo día de administración de la vacuna y se correspondían el 31,7 % a reacciones alérgicas y el 65,8 %
a la toxicidad “normal” de las vacunas.
Igualmente, se determinó que el riesgo de efectos adversos era significativamente mayor en las razas pequeñas que en las grandes, en perros castrados y para los que recibieron múltiples dosis de vacunas. Cada dosis adicional de vacuna incrementó el riesgo de reacción adversa en un 27 % en perros de menos de 10 kg y en un 12 % en perros de más de 12kg. Las razas de mayor riesgo para el desarrollo de estas reacciones fueron Dachshund, Carlino, Boston Terrier, Pinscher miniatura y Chihuahua.
En gatos, en un estudio similar llevado a cabo en 496.189 animales, se describieron un total de 2.560 reacciones vacunales (51,6/10.000 gatos), y el riesgo se incrementaba en gatos mayores de 1 año y en castrados.
Dentro de las reacciones adversas a las vacunas, se describen clásicamente cuatro:
  • Reacciones de toxicidad “normal”.
  • Reacciones de inmunosupresión transitoria.
  • Reacciones de hipersensibilidad inmunitaria.
  • Producción de sarcomas de inoculación en gatos.
Toxicidad “normal”
Las vacunas pueden generar normalmente reacciones de tipo inflamatorio pasajeras y es bien sabido que se requiere un cierto grado de inflamación para inducir respuestas inmunitarias protectoras y eficaces. Las reacciones más frecuentes son las tumefacciones o inflamación en el punto de inoculación, que suelen aparecer al día siguiente de la vacunación y pueden durar hasta una semana. Otras reacciones tóxicas “normales” son la instauración de cuadros de fiebre, letargia y anorexia que responden a la activación de los mecanismos de inmunidad innata, con liberación de citoquinas (TNF-alfa, interleuquinas, etc.). Aunque estas reacciones son esperables tras una vacunación, es deseable minimizarlas tanto para el paciente como para el propietario. Una medida de prevención prevacunación es el empleo de un antiinflamatorio no esteroideo (AINE; acetaminofeno o aspirina), aunque algunos trabajos muestran que la inhibición de la vía ciclooxigenasa-2 por parte del AINE puede atenuar o disminuir la respuesta de anticuerpos.
Inmunosupresión transitoria
Sorprendentemente, existen evidencias de que ciertas vacunas pueden producir cuadros de inmunosupresión transitoria, y en algunos animales, esta puede generar problemas como la emergencia de una infección subclínica en el animal vacunado. Este tipo de reacción adversa se describe principalmente con la vacuna de parvovirosis y con la de moquillo, y también se ha descrito para otras vacunas, aunque menos frecuentemente.


Hipersensibilidad inmunológica
Las vacunas pueden causar reacciones de hipersensibilidad de tipo I, II, III y IV que, aunque alguna de ellas infrecuentes, pueden ser realmente importantes. En este breve informe, nos ceñiremos exclusivamente a las reacciones de tipo I.
Hipersensiblidad de tipo I o alérgica
Se han propuesto varias proteínas diferentes como causa de reacciones alérgicas en las vacunas de perros y gatos, aunque en casi todos estos estudios no se han medido concentraciones de IgE antígeno-específicas.
La mayoría de las vacunas son capaces de suscitar este tipo de reacciones y son las vacunas bacterianas (especialmente la de Leptospira) las que mayor riesgo presentan. Todos los estudios realizados a este nivel señalan a los excipientes vacunales (suero fetal bovino, conservantes, antibióticos, caseína, colágeno tipo I, fibronectina, tiroglobulina, laminina y miosina porcina), como los alérgenos involucrados con más frecuencia en estas reacciones tanto en perros como en gatos.
Como bien sabemos, las reacciones alérgicas mediadas por IgE requieren una primera fase de sensibilización clínicamente inaparente y una segunda fase efectora con provocación de cuadros que pueden ir desde reacciones urticariales a angioedemas (edema facial, periorbitario, laríngeo, de vías respiratorias altas, etc.), o reacciones realmente graves como la anafilaxia. Esta última se manifiesta en el perro de forma distinta a otras especies, ya que en este, el principal órgano afectado no es el pulmón sino el hígado, en especial las venas hepáticas. Así, los perros que sufren anafilaxia muestran un cuadro de excitación inicial con vómitos, diarrea y micción, seguida de depresión respiratoria, debilidad muscular, convulsiones, estado comatoso y muerte en aproximadamente una hora. Todos estos signos provienen de la oclusión de la vena hepática por contracción del músculo liso y el edema hepático. En los gatos, por el contrario, el principal órgano afectado es el pulmón con desarrollo de cuadros disneicos graves, hipersalivación, vómitos, incoordinación, colapso y muerte.
Todas estas reacciones (urticaria, angioedema y anafilaxia) pueden darse en el cachorro en primera vacunación o en revacunaciones (primera inoculación o posteriores). Las reacciones en primera vacunación se deben primordialmente al paso de IgE y de “factores alergénicos” ingeridos con el calostro, que favorecen el desarrollo de respuestas Th2 en los cachorros, o bien y más raramente a reacciones de tipo anafilactoide. El término “anafilactoide” suele emplearse para describir una respuesta que clínicamente es idéntica a la anafilaxia pero que no se debe a la presencia de anticuerposIgE, sino más bien a la liberación de histamina por parte de los mastocitos de forma inespecífica, no mediada por estos anticuerpos. En el perro estas reacciones se describen raramente con el empleo de vacunas bacterianas, principalmente vacunas de Leptospira y Bordetella. Las reacciones que ocurren en segundas o posteriores inoculaciones, se deben fundamental y directamente al cachorro, ya que este queda sensibilizado en la primera vacunación y desarrolla la fase efectora en las posteriores.
Por razones todavía no aclaradas, no todos los pacientes con hipersensibilidad alérgica demostrada en una vacunación, muestran reacciones en las siguientes vacunaciones.
Tanto en uno como en otro caso, es posible realizar un test de intradermorreacción en animales con un historial previo de reacción alérgica. Este test se puede realizar de forma simple o compleja (ver cuadro).

Test de intradermorreacción
  • Forma simple. Se rasuran dos áreas de la piel bien separadas y se inocula intradérmicamente en una de las zonas 0,1 ml (100 µl) de la vacuna. En la otra zona rasurada, se inocula 0,1 ml de suero fisiológico como control negativo.
  • Forma compleja. Se rasuran tres zonas del animal. Dos de ellas siguen las mismas indicaciones que las descritas para la forma simple y en la tercera zona rasurada se inocula 0,1 ml de histamina como control positivo.
En ambos casos, la producción de un nódulo, reacción urticarial, hiperemia extrema y/o prurito en la zona de inoculación de la vacuna, predice una alta probabilidad de reacción alérgica en segunda o posteriores vacunaciones.
Si no se desea realizar este test, los pacientes de alto riesgo pueden ser premedicados, 15 o 20 minutos antes de la vacunación, con un antihistamínico H1 (como por ejemplo la difenhidramina), administrándola vía subcutánea o intramuscular.

Actuación y tratamiento frente a una reacción de hipersensibilidad alérgica
El tratamiento de estas reacciones alérgicas debería estar adaptado al tipo y gravedad de los signos clínicos. Evidentemente, ante una anafilaxia, el tratamiento debe incluir la administración de epinefrina, glucocorticoides, antihistamínicos H1 y expansores de plasma (cristaloides fluidos intravenosos) para combatir el shock hipotensivo.
Sin embargo, reacciones más leves o moderadas como son las reacciones urticariales y el prurito en el punto de inoculación o la formación de un angioedema facial o periorbital, requieren otro tipo de estrategias terapéuticas. Este tipo de reacciones se cuentan entre las más frecuentes y se trata de lesiones que generalmente son transitorias y se resuelven por sí solas en el término de 24-72 horas. Estos casos no necesitan tratamiento corticoideo y se puede actuar sobre el mismo con un AINE combinado o no con un antihistamínico H1. El único peligro del angioedema es que afecte al tejido laríngeo o a las vías respiratorias altas; en este caso sí que está indicada la administración de un corticoide.
Los corticoides tienen un amplio espectro de acciones sobre el sistema inmunitario entre las que se cuentan:
Defectos fagocitarios: neutrofilia, disminución de la quimiotaxis, marginación reducida, disminución de la fagocitosis, descenso de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, capacidad microbicida intracelular disminuida y disminución o inhibición del procesamiento antigénico.
Defectos linfocitarios: descenso de la proliferación linfocitaria, disminución de las reacciones de linfocitos T, disminución de la producción de citoquinas (principalmente de la IL-2), disminución leve o mínima de los linfocitos B y disminución leve de inmunoglobulinas. Disminución o bloqueo de la respuesta de inmunidad celular Th1.
Queda claro que la administración de un corticoide debido a una reacción vacunal puede ser un arma de doble filo, ya que por un lado tratamos la reacción patológica alérgica reduciendo o anulando sus efectos a nivel clínico, pero por otro lado inhibimos los principales procesos que tienen que ver con la instauración de una respuesta inmunitaria adecuada a la vacuna. Se ha demostrado que, incluso con cortos periodos de corticoterapia o con una sola administración del fármaco para el tratamiento de una reacción vacunal, se puede dar lugar a respuestas subóptimas o nulas frente a vacunas absolutamente dependientes de respuesta Th1 (inmunidad celular), en las que se ven afectadas especialmente las respuestas de tipo celular. Tanto la prednisona/prednisolona como la metilprednisolona (corticoides más usados en perros y gatos), aunque difieren en su potencia, son fármacos de duración intermedia, con rangos de actuación que van desde las 12 a las 36 h. Es por ello que la aplicación de corticoterapia frente a una reacción vacunal se debería limitar a aquellas que representen un riesgo para la vida del paciente e intentar en todo momento tratamientos alternativos (antihistamínicos, AINE, etc.), para reacciones leves o moderadas no graves.

Bibliografía
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miércoles, 26 de julio de 2017

Epidemiological investigations of the introduction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Chile, 2013-2015 Víctor Neira, Barbara Brito , Juan Mena, Marie Culhane, Maria Ignacia Apel, Vanessa Max, Patricio Perez, Valentina Moreno, Christian Mathieu, Magdalena Johow, Catalina Badia, Montserrat Torremorell, Rafael Medina, Rene Ortega Published: July 25, 2017https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181569 2017


Epidemiological investigations of the introduction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Chile, 2013-2015

Introduction


Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most important viral diseases affecting domestic pigs. Clinical presentation of PRRS includes abortion, premature farrowing, stillbirths, and increased pre-weaning mortality. In growing pigs, it causes respiratory disease with decreased weight gain and increased mortality [1]. PRRS is caused by two different viral species; PRRS virus (PRRSV) 1 and PRRSV 2, which were previously referred to as the European and the American PRRSV genotypes respectively. PRRS viruses are enveloped, single-stranded, positive-sense, RNA viruses, members of the family Arteriviridaeand the genus Porartervirus [2].

There is broad genetic diversity within PRRSVs, which have been further grouped into 9 lineages (PRRSV 2) and 4 subtypes (PRRSV 1) based upon ORF5 phylogenetic relationships [3,4]. PRRSV 2 lineages have ~10% nucleotide differences in ORF5. Most identified and sequenced viruses of PRRSV 2 (>85%) belong to lineages 1, 5, 8 and 9 [3].

PRRSVs are endemic in many pork-producing countries worldwide and it is considered one of the most economically costly diseases for the swine industry [5]. Globally, few European countries are free of the disease, of these Sweden and Switzerland have experienced outbreaks (in 2007 and 2012 respectively) that were rapidly contained and eradication of the virus was achieved shortly after its introduction [68]. In South America, several countries (Argentina, Brazil, Ecuador, Paraguay, and Uruguay) have never reported PRRS disease to the World Organization for Animal Health, whereas in Colombia, Peru, Bolivia and Venezuela the virus is present [6]. Control and elimination of PRRSV is complex due to the mechanisms used by the virus to interfere with the host’s innate immune system, the ability to cause persistent infection, the spread through multiple transmission routes. Additional challenges for implementing disease control are the complex dynamics of pig movements between farms and the high biosecurity standards that must be met to avoid introduction of the virus into susceptible production systems [9].

Chile is one of the few countries that had eradicated PRRSV from its national swine population after endemic circulation. In Chile, PRRSV was first detected in 1999. Subsequently, between 2003 and 2007 a national control and eradication campaign, engaging the government and the pork industry was implemented. The eradication strategy that was implemented depended on the farm system. In farrow-to-finish farms, the eradication program consisted in total depopulation followed by repopulation with PRRSV-negative sows. In multi-site pig production systems, herd closure procedure was applied in sow farms, whereas partial or total depopulation was applied in grower or finishing farms. PRRSV was successfully eliminated from infected herds in 2009 when the last exposed animals were culled. The success of the program was attributed to the standardization and close supervision of the control protocol implementation, the limited amount of animal movement between infected herds, and the collaboration between the government and the pork industry [10]. In 2012, after 7 years of consistent surveillance activities indicating the absence of the virus, Chile declared a PRRSV-free status, which was recognized by the World Organization for Animal Health [11].

In October 2013, clinical signs compatible with PRRS were reported on a commercial swine farm located in an area of high pig density. The official Virology Laboratory at the Agriculture and Livestock Laboratories and Quarantine Stations of the Agricultural and Livestock Service (SAG), confirmed PRRSV positive samples collected from the suspected farm. Subsequent dissemination of PRRSV was reported from 45 commercial swine farms that belonged to 12 production systems (i.e. companies) and 17 backyard farms. SAG launched an official control and eradication program in May of 2014, supported by the pork producers.

In this study, we described the PRRS epidemic that affected Chile since the first positive reported farm in October 2013 until April 2015 and analyzed the evolution of PRRSV to understand its origins and spread using official outbreak data and Bayesian phylogenetic analysis. The progress of the outbreak and challenges faced while controlling the disease are discussed.

Materials and methods


Study area and outbreak description


Commercial and backyard swine in Chile.


The commercial Chilean pig industry is highly integrated with approximately 190,000 sows owned by 43 pig companies that operate a total of 212 swine farms. Commercial swine farms raise pigs in confinement, containing animals in varying production stages depending on the type of farm; one-site production (farrow to finish) and multi-site production (sow farms, nursery, growing and finishing or wean to finish farm). SAG defined ‘commercial pig farms’ as those that have established biosecurity protocols and that maintain organized production records, whereas ‘non-commercial or backyard pig farms’ were defined as those without established biosecurity protocols and lacking systematically recorded production data. The definition of backyard or non-commercial pig farms was complicated by the diverse number of farms under different management practices and a varying number of animals present in the farm or household.

Outbreak detection.


In October 2013, a commercial sow farm (breeding herd), with 2,900 sows located in Región Metropolitana (an administrative region with high pig population density), reported sudden severe clinical disease compatible with PRRS infection. As compared to the previous month, the number of live-born pigs per sow dropped from 12.5 to 7.43, and there was an increase in stillborn pigs (from 3% to 8%), mummified fetuses (from 2.2% to 33.5%) and pre-weaning mortality (from 9.2% to 67.8%; field observations). Infection was confirmed by PRRSV ELISA and rtRT-PCR two weeks after the first reported clinical case. The first reported case resulted in one isolated immediate spillover to a neighboring backyard farm through an undetermined route.

The response of animal health authorities and the swine industry and follow-up sampling


All animals in the first detected farm (sows and suckling pigs) were culled within a month of the initial diagnosis. Sows were sent to slaughterhouses for human consumption and piglets were euthanized. However, despite this first elimination attempt, PRRSV was detected in additional farms reporting clinical disease including its nursery.

In May 2014, an official PRRS control and eradication program was launched by the SAG, which was supported by the Chilean swine industry represented by the Association of Pork Producers (ASPROCER). This program involved epidemiological investigations and active PRRSV sampling throughout the country in both, commercial and backyard pig farms to identify, reduce, contain and eliminate PRRSV from infected systems and prevent its spread to uninfected susceptible farms. Vaccination was not considered for elimination purposes and was prohibited by SAG.

Serum samples and oral fluids were collected from all commercial farms. Because of the dynamic existence of backyard farms, and the lack of official records and registries of these animals, the animal health authorities aimed at collecting serum samples from backyard farms in all administrative regions, focusing in areas surrounding commercial farms. Infected farms (cases) were defined as farms where the official SAG veterinary diagnostic laboratory confirmed the disease in at least one animal.

Samples were submitted to the SAG Virology Laboratory. Samples were centrifuged at 1,800 rpm for 5 min, and two 1 ml aliquots were made from each sample. One of the tubes was kept at the reception unit and stored at -20°C, and the other one was sent to the SAG Virology Unit, where it was stored at 4°C until further processing.

Sample processing by real-time RT-PCR


The viral RNA was extracted using the commercial kit MagMax™ 96 Viral RNA Isolation Kit (Thermofisher, Foster City, California, USA), following the manufacturer’s instructions. The RNA was then tested by real-time RT-PCR (rtRT-PCR) using PrioCHECK® PRRSV rtRT-PCR kit (Prionics AG, Zürich, Switzerland), which can distinguish between PRRSV 1 and PRRSV 2.

PRRS elimination from infected farms


Commercial farms identified as PRRS positive underwent a ‘herd closure’ procedure to allow the viral infection to ‘die out’ in the absence of new susceptible animals [12]. If the herd closure program was successful, the farm produced PRRSV-negative weaned pigs (by rtRT-PCR detection), but could still be positive for PRRS antibodies when assessed by serologic tests [12]. At this point (absence of viral circulation), the farms were considered ‘stable’ [13]. The stabilization of sow farms was confirmed by a 12-week follow-up protocol consisting of collecting 30 serum samples from 21 days-old pigs every two weeks (6 sampling visits total) that yielded rtRT-PCR negative results [13]. The infected grower or finishing farms were progressively depopulated, by sending animals to a slaughterhouse as they reached market weight, and not allowing the entrance of new animals into the farm until depopulation was completed.

All animals from positive backyard farms were eliminated (immediately sent to a slaughterhouse).

Viral sequencing


PRRSV selected positive samples from different farms and with high RNA concentration (low rtRT-PCR cycle threshold value) were further processed for virus isolation and ORF5 sequencing. ORF5 codes for a structural membrane protein, it has a high genetic substitution rate and it is commonly is used to perform epidemiological investigations [14]. Virus isolation was attempted in MARC-145 (ATCC No. CRL-12231) cells monolayers as previously described [15]. For RNA nucleotide sequencing, the ORF5 was amplified using a mix of primers as previously described by Chang et al., 2002 [16]. Three ORF5 viral sequences from samples collected in Chile prior to the 2013 epidemic and stored at the SAG laboratories were also included in this study.

One hundred and forty-three samples from commercial farms independently collected by ASPROCER between October 2013 and April 2015 were sent to the University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory for viral detection and ORF5 sequencing.

One sample collected from the first reported PRRSV positive commercial farm was additionally processed to obtain the ORF7 (coding for a conserved nucleocapsid protein) nucleotide sequence [17].

Phylogenetic analysis


ORF5 sequences from viruses collected in Chile during the outbreak and three additional sequences obtained from viruses isolated in the early 2000s in Chile were analyzed. In addition, we retrieved 61 reference PRRSV type 2 genetically diverse viral sequences from different geographic locations (North America, Asia and Europe) from GenBank to compare and reconstruct the phylogeny of the Chilean sequenced viruses. All sequences were aligned using MUSCLE [18]. The phylogeny was reconstructed using Bayesian evolutionary analysis sampling tree methods implemented in BEAST v.1.8.2 [19] software. The codon partition and substitution model were selected using Partitionfinder [20]. The analysis was run using the uncorrelated relaxed exponential clock and the coalescent Bayesian skyline population tree prior. To obtain a better resolution and parameter estimation from the phylogeny of the Chilean outbreak viruses, the analysis was repeated only with those viruses more closely related to the Chilean sequences using the same methods as described above. Convergence and mixing of the chains were assessed using Tracer [21]. The analysis was run for 5x108 iterations, or until all parameters had reached an effective sample size >200 of all parameters. The final maximum clade credibility (MCC) tree was annotated and the trees sampled before convergence were burned. Time to the most recent common ancestor (tMRCA) and 95% high posterior density (HPD) estimates were obtained from the annotated tree. Bayesian phylogenetic analyses were run using computational resources available in CIPRES [22] Genetic distances of nucleotide sequences were computed using the Kimura-2 parameters substitution using MEGA v5.2.2 [23].

The ORF7 sequence obtained from an isolate from the index farm was queried using blast tools (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) to obtain the closest sequences available in public databases. The closest ORF7 viral sequences and additional reference sequences from all PRRS type 2 North American strains available were retrieved from GenBank to reconstruct the phylogeny and determine the viruses that were more closely related to the ones that caused the 2013–2014 Chilean outbreaks. ORF7 segments were aligned using MUSCLE, and a Maximum Likelihood phylogenetic tree was reconstructed using MEGA v5.2.2 [23].

Results


Epidemiological characteristic of PRRSV of the 2013 outbreak in Chile


From the beginning of the epidemic in October 2013 until April 2015 2, 883 pig farms including commercial and backyard were sampled throughout the country. At the beginning of the epidemic, when the number of cases peaked between October of 2013 and May of 2014, 39 commercial farms became infected (Fig 1). Between October of 2013 and April of 2015, 45 commercial and 17 backyard farms were confirmed as PRRSV positive. In 3 out of the 12 affected companies, its sow farms remained PRRSV negative. In these companies it is likely that transmissions occurred horizontally between farms rather than by internal pig flow (i.e. downstream from sow farms that supplied growing farms).

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Fig 1. Epidemic curve showing the number of outbreaks in commercial pig farms, and backyard pigs per month from October of 2013 to April of 2015.
Most new cases were reported at the beginning of the outbreak from October of 2013 to April of 2014. The last new positive breeding herd was detected in October of 2014.

PRRSV infections in backyard pig farms were also reported during the epidemic. No further events occurred between June and July of 2014. The last new PRRSV introduction in a commercial sow farm was detected in October of 2014. Since then, all infections or reinfections correspond to growing or finishing farms, likely because of pig flows. A total of 45 swine farms had been affected by April of 2015; of which ten were sow farms; seven were nurseries; 25 growing-to-finishing; and three farrow-to-finish farms were affected. By April of 2015, 16 commercial farms remained positive, and six sow farms had been successfully stabilized.

Genetic diversity within Chilean sequences


All ORF5 sequences obtained were identified as North American type 2 PRRSV. The viral sequences belonged to commercial (n = 20), and backyard (n = 8) outbreak samples, and three additional sequences samples obtained in 2000, 2001 and 2006 were also included (Table 1). Fig 2 shows the location of sequenced viruses and the density of all backyard and commercial farms sampled during surveillance activities.

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Fig 2. Map of sampled Chilean commercial and backyard swine during the national PRRS control and eradication program.
The density of commercial and backyard farms in the central region in Chile is represented as a color gradient. Locations from where sequences were obtained are identified with stars.

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Table 1. Chilean porcine reproductive and respiratory syndrome virus sequences obtained for the study.

The genetic distance between ORF 5 PRRS Chilean sequences isolated between 2013 and 2015 ranged from 0 to 3.2x10-2 nucleotide substitution/site. The substitution rate of Chilean sequences analyzed by Bayesian phylogeny reconstruction was estimated at 1.0x10-2(95%HPD 6.0x10-3–1.5x10-2) nucleotide substitution/site/year.

The highest identity of the Chilean PRRSV ORF5 with sequences publicly available was 97.5%, specifically from a PRRSV collected from Indiana in 2013 (PRRSV2/Indiana/XW079/2013, # KP283445). Chilean PRRSV ORF5 sequences had no indels with respect to PRRSV2/Indiana/XW079/2013. Specific amino acid differences between PRRSV2/Indiana/XW079/2013 and one of the first isolates (PRRS/5451/Chile/2013) were located at sites 15 (L->P), 58 (K->Q), 104 (K->R), 161 (I->V), and 199 (H->R). Nucleotide differences within the 28 ORF5 PRRSV sequences collected in Chile between October 2013 and April 2015, ranged from 0 to 18 (pairwise p- distance = 0.030), and the number of amino acid differences ranged from 0 to 8. Relevant initial mutations observed between the viruses collected in October 2013 and the ones collected afterward were located at amino acid sites 58 (R->Q) and 61 (N->D). Mutations observed exclusively in at least 2 of the 3 sequences collected in 2015 were located at sites: 57 (D->N), 72 (V->A), 34 (S->D), 102 (Y->H), 104 (R->G), and 106 (Y->H).

The 2013–2014 Chilean and closest reference PRRSVs in reconstructed phylogeny belonged to a cluster that included viruses from lineages previously defined as 1 & 2 (Fig 3). By contrast, PRRSV sequences from viruses collected in Chile in 2000, 2001, and 2006 belonged to a monophyletic cluster, grouped with viruses of PRRSV type 2 Lineage 5 as described by Shi et al., 2010 [3] (Fig 3). ORF5 sequences from the 2013 outbreak were at least 14.33% different from the PRRSV that circulated in Chile during the early 2000’s. This finding confirms that the PRRSV that caused the 2013 outbreak was a new introduction, rather than a re-emergence of the virus previously present in the country.

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Fig 3. Maximum clade credibility tree of PRRSVs.
Chilean isolates from 2000, 2001, and 2006 are depicted in a blue branch. Viruses from the 2013–2015 Chilean epidemic are depicted in a red branch.

Viral sequences from the 2013 Chilean epidemic clustered within a monophyletic group. The tMRCA of Chilean viruses and the most closely related PRRSV reference virus (GeneBank#KP283445), which was isolated in the U.S, in 2013, was estimated in May 2012 (95%HPD April 2011-March 2013) (Fig 4). The tMRCA of all Chilean viruses collected between 2013 and 2015 was May 2013 (95%HPD October 2012-August 2013) but whether this ancestor was initially circulating on the first reported commercial farm or a different commercial or backyard farm, remains unclear. Initial branching of the 2013 Chilean viruses into two clades has a high statistical support (posterior probability). One branch comprises sequences belonging to the first reported commercial and backyard herds located nearby. This clade died out after depopulation of the first reported commercial farm (and spillover backyard farm) infected with this virus. A second clade comprised all viruses collected subsequently after the first reported case (and neighboring backyard infected farms) (Fig 4). The tree topology does not show a structured pattern of commercial and backyard samples (i.e. commercial or backyard samples grouped together in the tree), suggesting that viral circulation appears to occur between and within these two groups. However, there is low variability between viral sequences, so precise inferences of these relationships are difficult to draw.

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Fig 4. MCC phylogenetic tree of the Chilean PRRSV and closest reference sequences.
The Chilean porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) belongs to a single monophyletic group introduced at least one month prior to the first detected case. The maximum clade credibility tree shows the Chilean PRRSV sequences collected between 2013 and 2015 and the closest reference sequences. The node showing the tMRCA of all Chilean sequences, and Chilean sequences with the closest reference PRRSV are indicated with * and ** respectively. Names of sequences sampled from commercial farms are colored in blue, and sequences from backyard pigs are indicated in red.

The ORF7 was sequenced (length = 372 nucleotides) from PRRSV obtained from isolate PRRS/5451/Chile/2013 (GenBank# KY972579). A total of 85 reference viruses from all North American type 2 viruses spectrum were used to reconstruct the phylogeny. Consistent with ORF5 phylogeny, ORF7 was closely related to viruses from the United States collected between 2012 and 2014 (S1 Fig). The sequence with the highest identity (97.6%, 9 nucleotides difference) was KT257992.1 ISU73, collected from a swine farm in Missouri, 2014.

Discussion


Results from this study show that the 2013 epidemic was caused by a single PRRSV strain genetically distinct to the one detected and eliminated from the country before 2009, confirming that the 2013 virus was a new introduction rather than a re-emergence of the virus that was present in Chile in the 2000s. Furthermore, the 2013 Chilean viruses share the closest ancestor with a contemporary North American PRRSV. Nevertheless, the reference sequences used in this study were obtained from a public repository, GenBank, and they represent only a proportion of all the variety of existing viruses, and most of them are from North America. As a consequence, more closely related viruses to the Chilean ones may not have been sequenced and published.

The introduction of PRRV into disease-free countries has been documented; however, these previous experiences differ from the Chilean epidemic in several aspects. Sweden documented PRRSV introduction in 2007. The virus was not detected by clinical disease, but by serological surveillance. Initial assessment of the situation (limited spread) allowed them to proceed with depopulation of positive premises. Retrospective inspection of production data from some the infected farms showed altered parameters such as repeat breeders and a decrease of weaned piglets. In contrast to the severe clinical disease caused by the virus introduced in Chile. From the Swedish outbreak it was concluded that the introduction may have occurred through unknown indirect contact, either from Denmark or by insufficiently disinfected sow transporting vehicles from Germany. The sequence data analysis was not informative to infer the origins because the identity with the closest ORF5 sequence available from public repositories was only 90.7% (40 nucleotide differences). Because in Europe sequencing is not used as a routine surveillance tool, its usefulness was limited in this situation [7]. By contrast, the high ORF5 sequence identity of the Chilean viruses and the North American ones allowed inference of a close relationship and elucidation of the origins of the epidemic. Another example of PRRSV introduction into a disease-free country was an outbreak that occurred in 2012 in Switzerland. The outbreak was caused by imported semen from a positive boar from Germany. The importer was alerted of the PRRSV detection, and testing of sow farms that had been inseminated with semen from the infected source as well as contact herds were conducted within a few weeks. Elimination of the virus was achieved promptly after depopulation in farms where the virus had spread [8].

The route of PRRSV introduction into Chile in 2013 is still unknown and several hypotheses have been proposed. Of these, indirect transmission of the North American PRRSV strain through neighboring countries is very unlikely because the dense-pig population areas in Chile are geographically isolated, and because cases were not located close to country borders. Other hypotheses are the importation of live animals (for genetic improvement), importation of vaccines or semen, anthropogenic (people acting as fomites), importation of swine products or illegal entry of risk materials. Introduction via animals or semen had been responsible for PRRSV transboundary transmission as mentioned above [78]; however, the first reported farm did not import animals or semen, and strict health regulations restrict legal imports of animals and biological products into the country. Another hypothesis of PRRSV introduction is through imported pork, however, this route has been historically considered unlikely [2425]. Investigations about the different hypothesis are still ongoing.

Phylogenetic analysis of viruses circulating in commercial and backyard farms infected at the beginning of the outbreak suggests that the 2013 PRRSV had likely been circulating undetected in the Chile for at least one month prior to the reported epidemic. Therefore, although we call the first reported farm the ‘index farm’ it is also possible that the first case occurred elsewhere. Field epidemiological investigations conducted by the SAG suggest that PRRSV transmission into backyard pig farms occurs most likely as a spillover from commercial swine farms, and not in the opposite direction. This is supported by phylogenetic analysis, which shows no specific clustering of viral sequences into backyard or commercial farms, suggesting transmission between these two types of farms rather than exclusive viral circulation in any of the farm types. Spread of the disease within the country may have been related to personnel, equipment, transport as well as legal and/or illegal animal movement. Wild boars may also represent an alternative route of entry and dissemination of PRRSV. However, the presence of wild boar distribution in Chile is very limited and confined mostly to southern areas of Chile, not in the proximity of the index farm and areas with high pig population [26]. Because there are no wild boars in the northern regions of Chile, it is unlikely that there was an introduction from neighbor countries on Chile’s northern borders: Peru and Bolivia. An introduction via wild boar through southern areas of the country is also unlikely because Argentina, sharing the remaining border with Chile, has never reported PRRSV.

In this study, we used ORF5 and ORF7 to study the molecular epidemiology of PRRS in Chile. Although ORF5 and 7 cover ~7% of the PRRSV genome, it is one of the most variable regions in PRRS genome. Additionally, because ORF5 contains important antigenic sites for neutralizing antibodies, it provides relevant evolutionary information of the virus [427,28]. PRRSVs from the Chilean 2013 outbreak belonged to a monophyletic cluster that included viruses from lineages 1 & 2. PRRSV lineage 1 defined by Shi et al., 2010 has experienced sporadic spread throughout North America, especially between the years 2000 and 2004. In 2001, a highly pathogenic strain from this lineage, named MN184, caused severe clinical disease and spread within the US. The highly pathogenic virus showed characteristics deletions in its nsp2 [29]. One limitation of this study is that nsp2 sequences were not available for us to analyze, and therefore, we were not able to determine these markers of pathogenicity.

The number of farms infected with PRRSV has decreased gradually as a result of the National PRRSV Control and Eradication Program, and it is expected that the disease will be promptly eliminated from the country. The current eradication program is similar to the one implemented to PRRS control during the 2000s. In both programs, vaccination was forbidden. In endemic countries, PRRS vaccines have been an efficient tool to control disease by reducing clinical presentation, especially using live modified or attenuated vaccines [3032]. However, modified live vaccines can reverse virulence, spread to other farms or can recombine with field wild-type viruses, which can originate new outbreaks [303335]. Because in Chile there was no PRRS vaccine applied, the origins of the epidemic cannot be attributed to a vaccine virus.

One challenging aspect during the Chilean epidemic was the control of reinfections in farms undergoing elimination programs. Most of these reinfections were a result of the absence of additional off-site nurseries and growing to finisher farms to perform the partial or total depopulations and difficulties in carrying out herd closure in farrow to finish farms.

Chile is one of the few countries that have achieved PRRS eradication after endemic viral circulation. However, the 2013 PRRSV introduction evidenced that despite the country’s relative isolation due to geographical barriers as well as restrictions reinforced by the national animal health services, foreign animal diseases are an important threat to the national swine population. The 2013 PRRS outbreak resulted in devastating economic losses for the industry and costly resources deployed by the animal health services for disease control. The 2013 PRRS outbreak has revealed the vulnerability of the system due to globalization and international trade. Lessons learned from this epidemic can contribute to improving prevention and emergency preparedness in PRRS-free countries as well as those areas or regions that are progressively achieving PRRS control.

Conclusions


Results from our study show that PRRSV from the 2013–2015 epidemic in Chile was caused by a PRRSV different from the one that circulated in Chile prior to 2009. The closest reference sequences to the ones from PRRSVs that caused the Chilean epidemic were from viruses present in the United States. These PRRSVs may have been circulating in the country for at least one month before being detected. Limited transmission of the virus seems to occur between commercial and backyard farms without any structured pattern between them. Results from this study contribute to the understanding of the transboundary origin and the dynamics of transmission of PRRSV within a susceptible population in a disease-free country, and will ultimately contribute to the design of control and eradication strategies.

Supporting information



pone.0181569.s001.pdf

0.02
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Maximum Likelihood phylogenetic tree of the ORF7 obtained from the 2013–2015 epidemic in Chile.
The clade (blue) with the closest viruses to the Chilean sequence (name in red) contained viruses from North America isolated in recent years.
(PDF)

S1 Fig. Maximum Likelihood phylogenetic tree of the ORF7 obtained from the 2013–2015 epidemic in Chile.


The clade (blue) with the closest viruses to the Chilean sequence (name in red) contained viruses from North America isolated in recent years.

(PDF)

Acknowledgments


We thank all personnel from the Agricultural and Livestock Service (SAG) and Chilean pork producers for their support and contributions to this study. We are grateful to Dr. Sagar Goyal (University of Minnesota) for providing MARC-145 cell line. The authors wish to thank Ms. Elana Peach-Fine who assisted in the proof-reading of this manuscript.

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