miércoles, 19 de noviembre de 2014

ABORTO ENZOÓTICO DE LOS PEQUEÑOS RUMIANTES Jesús Salinas et al. 2014

El aborto enzoótico de los pequeños rumiantes

Es una zoonosis profesional que puede ocasionar abortos y septicemias en mujeres embarazadas



El aborto enzoótico de los pequeños rumiantes
Esta enfermedad, causada por Chlamydia abortus, está ampliamente distribuida y es responsable de numerosas pérdidas económicas por abortos al final de la gestación. Además, está catalogada como zoonosis profesional y puede afectar a mujeres embarazadas.
Jesús Salinas, Daniel Álvarez, Nieves Ortega, Antonio J. Buendía, Laura Del Río, María Carmen Gallego, Joaquín Sánchez, José A. Navarro, Francisco Cuello y María Rosa CaroGrupo de Investigación en clamidiosis animales
Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia
El aborto enzoótico de los pequeños rumiantes o aborto enzoótico ovino (AEO), es una enfermedad de distribución mundial, y es la principal causa de aborto infeccioso en pequeños rumiantes en numerosos países como Reino Unido, Francia, Holanda e Italia, y también en diversas regiones de España en las que se ha estudiado. El agente etiológico responsable de esta patología es Chlamydia abortus, una bacteria gramnegativa intracelular obligada (figura 1) que ha recibido otras denominaciones en los últimos 20 años (Chlamydia psittaci serotipo 1 o, más recientemente, Chlamydophila abortus). Además del alcance económico que implica el AEO, merece especial atención por tratarse de una zoonosis profesional que puede ocasionar abortos y septicemias en mujeres embarazadas en contacto con rebaños infectados.

Figura 1. Detección de C. abortus mediante una tinción de Stamp (izquierda), una tinción de Giemsa (centro) o una inmunofluorescencia (derecha).
Transmisión
Las clamidias se eliminan principalmente en las secreciones vaginales de animales infectados en los momentos previos y posteriores al aborto y en las placentas y fluidos de los fetos abortados. Una vez en el medio ambiente, el microorganismo puede permanecer viable durante varios días.
El contagio suele producirse por vía oral mediante la ingestión de bacterias presentes en el agua o comida contaminadas, o mediante el lamido e ingesta de restos placentarios. Otra vía de infección es la aerógena, a través de la inhalación de aerosoles presentes en ambientes contaminados. Existen otras vías de transmisión posibles pero menos significativas como son la venérea, la orofecal y a través de la secreción láctea en el caso del ganado caprino.

Patogenia y manifestaciones clínicas
Tras la infección por vía oronasal, el microorganismo se establece en los órganos linfoides faríngeos donde, tras un periodo de multiplicación, se establece un estado de latencia, que puede durar más o menos tiempo en función del momento en que los animales queden gestantes. A mediados de la gestación, las clamidias se diseminan vía hemolinfática hasta alcanzar la placenta, desencadenando el aborto, 2-3 semanas antes de la fecha estimada de parto, o un parto a término de corderos muertos o muy débiles que mueren pocos días después (figura 2). Las ovejas raramente presentan sintomatología clínica antes del aborto y vuelven a ser fértiles tras el mismo; por el contrario, en la especie caprina resultan frecuentes las retenciones placentarias, endometritis y vaginitis.
Figura 2. Feto (izquierda) y placenta (derecha) procedentes de un aborto por C. abortus en una explotación de ovejas.
Los cambios patológicos en la placenta se hacen evidentes a partir de los 90 días de gestación. Durante las etapas finales (de los días 125 a 140 de gestación), la placenta se encuentra masivamente infectada por C. abortus y las alteraciones de la unión fetoplacentaria pueden llegar a provocar el aborto (figura 3).
Figura 3. Tinción inmunocitoquímica de una infección clamidial en placenta.
La infección induce una respuesta inmunitaria que protege a las hembras infectadas de abortos sucesivos, aunque sigan excretando C. abortus ocasionalmente durante los partos y los estros en los años posteriores, favoreciendo de esta manera el mantenimiento y la diseminación de la enfermedad en el rebaño afectado.
En lo que respecta a ovejas no gestantes, C. abortus es capaz de producir una infección latente, que no estimula una inmunidad protectora, con la consiguiente reactivación y multiplicación del microorganismo durante la siguiente gestación.
Algunas ovejas infectadas llegan a parir corderos vivos débiles. En los neonatos infectados se han descrito lesiones como neumonía (figura 4), encefalitis, hepatitis e incluso miocarditis. Esto puede deberse a la inmadurez del sistema inmunitario de estos animales, que sería incapaz de prevenir la diseminación del patógeno hacia varios territorios orgánicos.
Figura 4. Pulmón de un cordero afectado por una bronconeumonía clamidial.
Diagnóstico
Los signos clínicos que evidencia un rebaño afectado por C. abortus no son suficientes para llegar a un diagnóstico certero de la enfermedad. Algunos datos epidemiológicos, como la persistencia de la infección en el rebaño y la afectación mayoritaria de primíparas con abortos tardíos, nacidos débiles o mortinatos pueden hacer que el veterinario incluya el AEO como primer diagnóstico diferencial. Sin embargo, existen otras enfermedades abortivas en los pequeños rumiantes que pueden cursar con cuadros similares, como la toxoplasmosis, la brucelosis o la fiebre Q, por lo que la única forma de emitir un diagnóstico certero implica la confirmación del laboratorio.
Las técnicas laboratoriales que se pueden emplear para el diagnóstico de C. abortus pueden clasificarse en directas e indirectas (figura 5). Las primeras persiguen la identificación de C. abortus en las muestras recibidas (bacterioscopía mediante tinción de Stamp, técnicas inmunocitoquímicas, aislamiento o PCR), mientras que las segundas detectan anticuerpos generados por los hospedadores tras la infección (ELISA o RFC).
Figura 5. Representación esquemática delos métodos directos eindirectos utilizados en el diagnóstico laboratorial del AEO en función delas muestras remitidas al laboratorio.
Prevención y control
En la prevención y control de las clamidiosis abortivas en pequeños rumiantes se establecen tres tipos de medidas:
Manejo
El objetivo de estas medidas sería evitar la introducción de animales infectados en rebaños libres de la enfermedad manteniendo a estos últimos en sistema cerrado o incorporando animales de reposición procedentes de granjas libres de C. abortus. Si el patógeno ya está en el rebaño, se debe aislar inmediatamente a las ovejas que aborten, retirar los restos del aborto y limpiar y desinfectar la paridera para limitar en la medida de lo posible la diseminación de la enfermedad. Estas medidas son de difícil aplicación debido a la presencia de portadores asintomáticos y a la imposibilidad de distinguir animales vacunados de infectados mediante diagnóstico serológico convencional.
Tratamiento con antibióticos
Las tetraciclinas se usan en rebaños de ovejas gestantes infectadas para reducir la incidencia de abortos y muertes perinatales. Sin embargo, el uso de antibióticos no garantiza evitar el aborto ni la eliminación de patógenos al ambiente durante el parto. Esto, unido a las preocupaciones típicas del uso de antibióticos como la aparición de resistencias y la seguridad alimentaria, hace que el tratamiento con estos fármacos no deba ser rutinario para controlar la infección, sino que se debe reservar para casos excepcionales.
Vacunación
Como ya se ha mencionado, tras una primoinfección por C. abortus, los animales generan una respuesta inmunitaria de memoria eficaz para no volver a sufrir problemas reproductivos en posteriores contactos con el mismo agente infeccioso, de ahí que la vacunación sea la medida más efectiva para el control y prevención de esta enfermedad.
En la actualidad existen dos tipos de vacunas disponibles comercialmente, las inactivadas y las vivas atenuadas. Las vacunas inactivadas fueron las primeras en utilizarse poco después del descubrimiento de la enfermedad, en la década de los 50. El principal problema que plantea su uso es que, aunque disminuyen significativamente el número de abortos, no impiden la excreción de clamidias en el momento del parto, lo que favorece la persistencia de la infección de forma enzoótica en el rebaño vacunado. La vacuna atenuada es una cepa mutante termosensible del microorganismo, es decir, crece como una cepa normal a 37 ºC, pero a 39 ºC (temperatura corporal normal de las ovejas), su crecimiento es muy limitado. Esta vacuna ha demostrado ser muy efectiva en condiciones de campo, evitando el aborto y la excreción de clamidias. Sin embargo, a pesar de estos buenos resultados, la naturaleza “viva” de una vacuna siempre implica riesgos y limitaciones en su uso, más aún en el caso de C. abortus, que puede causar una grave zoonosis en mujeres embarazadas. Además, esta vacuna no puede administrarse a animales gestantes o a animales tratados con antibióticos, lo que restringe aún más su uso. Existe también el riesgo de que las cepas atenuadas reviertan a ser virulentas y causen enfermedad y aborto en animales vacunados. Estudios recientes han demostrado la conexión entre esta vacuna y la aparición de casos de AEO.
Una forma de evitar los inconvenientes de las vacunas descritas sería el desarrollo de una vacuna subcelular que contenga aquellas moléculas clamidiales que intervengan específicamente en la inducción de una respuesta inmunitaria efectiva. La principal proteína candidata es la MOMP, que induce protección administrada en su forma oligomérica nativa. Sin embargo, la purificación de esta proteína a partir de cultivos es una técnica demasiado costosa para la elaboración y comercialización de este tipo de vacunas para el ganado.
Otro aspecto a considerar son los adyuvantes, sustancias químicas o componentes microbianos capaces de potenciar la respuesta inmunitaria generada por los antígenos vacunales a los que se asocian. Así, la elección del adyuvante en la elaboración de vacunas es de vital importancia ya que son capaces de polarizar la respuesta inmuniataria hacia un tipo específico de inmunidad y hacer que al final la vacuna sea eficaz o no. Empleando modelos experimentales murinos y ovinos de infección y de validación de vacunas frente a C. abortus, se han ensayado y seleccionado adyuvantes que mejoran sustancialmente la protección ofrecida por diversas vacunas inactivadas comercializadas en varios países europeos, incluida España.

Perspectivas
El aborto enzoótico de los pequeños rumiantes, causado por Chlamydia abortus, es una enfermedad ampliamente distribuida, responsable de numerosas pérdidas económicas por producir abortos al final de la gestación. Además, está catalogada como zoonosis profesional, pudiendo afectar especialmente a mujeres embarazadas.
Dada la inespecificidad de sus síntomas, se hace necesario el diagnóstico laboratorial de esta enfermedad en el rebaño. La prevención y el control pasan por el empleo de vacunas, y actualmente existen dos modalidades, las inactivadas y las atenuadas con diferentes ventajas e inconvenientes. Las investigaciones actuales se centran en el desarrollo de nuevas vacunas inactivadas asociadas con adyuvantes que potencien una respuesta inmunitaria eficaz y segura.

Bibliografía

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Cuello, F., Salinas, J., Caro, M.R., Gallego, M.C., Sánchez, M.J., Buendía, A.J., Bretón, J. (1992) Prevalencia de la clamidiosis ovina y caprina en la región de Murcia. An Vet (Murcia). 8: 39-45.
García de la Fuente, J.N., Gutiérrez-Martín, C.B., Ortega, N., Rodríguez Ferri, E.F., Del Río, M.L., Gonzalez, O.R., Salinas, J. (2004) Efficacy of different comercial and new inactivated vaccines against ovine enzootic abortion. Vet Microbiol. 100: 65-76.
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Navarro, J.A., García de la Fuente, J.N., Sánchez, J., Martínez, C.M., Buendía, A.J., Gutierrez-Marín, C.B., Rodriguez-Ferri, E.F., Ortega, N., Salinas, J. (2004) Kinetics of infection and effects on the placenta of Chlamydophila abortus in experimentally Infected pregnant ewes. Vet Pathol. 41: 498-505.
Rodolakis, A., Salinas, J., Papp, J. (1998) Recent advances on ovine chlamydial abortion. Vet Res. 29: 275-288.
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Uriarte Fraile, A., Gil Berduque, J.A. (1999) Abortos infecciosos en ganado ovino. Resultados de 984 brotes analizados durante el período 1995-1998. ITEA. 20: 381-383.
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domingo, 2 de noviembre de 2014

DOSSIER TÉCNICO CANINO/FELINO – RetroMAD1 Huan Ung 2014

DOSSIER TÉCNICO CANINO/FELINO – RetroMAD1
Huan Ung

Introducción:


La plataforma tecnológica de RetroMAD1 fue desarrollada originalmente en el 2007 por Defensia S/B antes de que Biovalence S/B entrara en un acuerdo de desarrollo conjunto el 4 de Noviembre del 2011. RetroMAD1 es una proteína antimicrobial quimérica de tamaño 41.2 kDA, la cual consta de 3 dominios proteínicos: Retrociclina-101, MAP30 y Dermaseptina 01, los cuales están unidos por conectores. Sus propiedades antivirales de amplio espectro se deben a sus dominios, que bloquean la entrada y fusión de los virus así como la integración del ADN viral con el ADN del portador y el desplazamiento del virus a nivel ribosómico.

Esta proteína desnuda de fusión es particularmente única, ya que a pesar de ser una proteína se puede administrar oralmente y retiene la mayor parte de su bioactividad luego de la ingestión; esto en contraposición a la mayoría de las proteínas, que no pueden permanecer bioactivas luego de pasar por el tracto gastrointestinal. Esta proteína también ha mostrado estabilidad aún bajo condiciones extremas como temperaturas altas de hasta 70° C por 15 minutos sin por ello perder la bioactividad y proteólisis con enzimas gástricas como pepsina al PH2, tripsina y quimotripsina al PH8. Los dominios permanecen separados y activos, sin replegarse ni bloquearse mutuamente.

La tecnología RetroMAD1 ganó el Premio de Oro a la Innovación Farmacéutica en BioMalasia 2011. BioValence S/B también ha participado exhibiendo esta tecnología en BioPharma Asia 2013 así como en la exhibición realizada en Singapur en el 2014. Localmente, esta tecnología ha sido presentada en el 25avo. Congreso Anual de la Asociación de Veterinarios de Malasia 2014, el cual tuvo lugar en el Lotus Desaru Beach Resort, en Kota Tinggi, Johor.

El Departamento de Servicios Veterinarios de Malasia (DVS por sus siglas en inglés) nos otorgó una aprobación especial el 12 de Marzo del 2014 para realizar un estudio de campo a gran escala centrado en un virus canino y seis virus felinos.
El virus canino principal en el cual nos estamos enfocando es el Parvovirus Canino 2 o PVC-2 (n=143). Los ensayos clínicos han mostrado hasta el momento una tasa de recuperación del 80% versus un promedio del 55% en los perros que sólo reciben un tratamiento estándar para el PVC-2.
Los principales virus felinos en los cuales nos enfocamos son: Virus de Inmunodeficiencia Felina (VIF), Virus de Leucemia Felina (VLFe), Peritonitis Infecciosa Felina (PIF), Calicivirus Felino (FCV) y Rinotraqueitis Viral Felina (RVF).

1.- Actividad Antiviral
Figura 1 RetroMAD1.jpg
TRADUCCIÓN DE FIGURA 1A EN ORDEN DE LECTURA:
HIV Entrada Env: gp120 + gp41
Las Theta-Defensinas bloquean a las glicoproteínas receptoras virales de entrada.
CD4 Coreceptor – Fusión Núcleo Viral →Decapsidación
Péptidos antimicrobiales catiónicos seleccionados bloquean la fusión viral.
ssARN →Transcripción Reversa → dsADN → ADN del portador
Proteína inactivadora de ribosomas bloquea la actividad de la integrasa y su desplazamiento.
→Desplazamiento → Integración → Desplazamiento → Proteínas estructurales → Germinación → Maduración proteolítica


Figura 1A: RetroMAD1 inhibiendo una infección viral en diferentes fases del ciclo de replicación viral.
RetroMAD1 inhibe a los virus en 4 diferentes fases del ciclo de replicación viral:
·         Entrada del virus: Las Theta-Defensinas (Retrociclina 101), dominio de RetroMAD1, enlazan y bloquean a las glicoproteínas virales que intentan entrar a las células.
·         Fusión Viral: Las proteínas catiónicas antimicrobiales (CAP por sus siglas en inglés) de la Dermaseptina 01, parte de RetroMAD1, evita la fusión y la decapsidación del virus en las células del portador.
·         Integración viral al ADN: La proteína MAP30 bloquea a las enzimas integrasa de tal forma que los virus ARN -como los Retrovirus- no pueden integrarse en el genoma del portador como un ADN proviral.
·         Bloqueo de desplazamiento: La proteína inactivadora de ribosomas (RIP) también inhibe el desplazamiento del mARN viral a nivel ribosomal, deteniendo el pre- ensamblaje de proteínas virales.
Figura1B RetroMAD1.jpg
Figura 1B: Estructura en 3D de RetroMAD1 y sus sitios activos.

Estudios computacionales bioinformáticos se realizaron combinando varios tipos de software bioinformático para construir la estructura 3D de RetroMAD1. (Figura 1B) Cada dominio proteico fue enlazado por conectores. Los sitios activos de cada dominio se muestran en violeta.
·         Sitios activos de Retrociclina 101: Cistina 31, 29, 27, 36, 38, 40.
·         Sitio activo de MAP30: Arginina 217; Tirosina 126, 165; Ácido Glutámico 214.
·         Sitios activos de Dermaseptina 01: Leucina 329; Lisina 330; Treonina 327; Alanina 323.
De este estudio podemos concluir que los diferentes dominios no se replegan ni bloquean los sitios activos de RetroMAD1.

Actividad Antiviral de Amplio Espectro
RetroMAD1 es una droga de amplio espectro que ha mostrado resultados positivos y es efectiva contra virus ADN y ARN en diferentes especies.
Nombre de Virus ARN                                 Tipo        Portador    Familia             Género                       Estudio         
Virus de Inmunideficiencia Felino (VIF)    ssARN    Gato           Retroviridae     Lentivirus                  In Vivo
Virus de Leucemia Felina (VLFe)               ssARN     Gato            Retroviridae     Gammaretrovirus   In Vivo
Calicivirus Felino (FCV)                                ssARN     Gato            Caliciviridae      Vesivirus                  In Vivo
Coronavirus Felino                                       ssARN     Gato            Coronaviridae   Alphacoronavirus  In Vivo e
                                                                                                                                                                           In Vitro
Coronavirus Canino                                    ssARN     Perro           Coronaviridae   Alphacoronavirus   In Vivo
Necrosis Nerviosa Viral (VNN o                ssARN     Peces           Nodaviridae      Betanodavirus         In Vivo
NNV)
Chikungunya                                               ssARN      Humanos    Togaviridae       Alphavirus               In Vitro
Fiebre del Dengue                                     ssARN      Humanos     Flaviridae          Flavivirus                  In Vitro

Nombre de Virus DNA                               Tipo         Portador       Familia                Género                    Estudio
Virus de Panleucopenia Felina (VPF)      ssADN      Gato               Parvoviridae    Parvovirus              In Vivo
Rinotraqueitis Viral Felina (RVF)             dsADN      Gato               Herpesviridae  Vericellorirus        In Vivo
Rotavirus Simio A                                      dsADN       Monos           Reoviridae        Rotavirus                In Vivo
Parvovirus Canino 2 (PVC-2)                  ssADN         Perros           Parvoviridae    Parvovirus              In Vivo
Herpes Simple 1 (HSV-1)                         dsADN        Humanos      Herpesviridae Simplexvirus           In Vitro
Herpes Simple 2 (HSV-2)                         dsADN       Humanos      Herpesviridae  Simplexvirus           In Vitro
Parvovirus Hepatopancreático(HPV)    ssADN        Camarón       Parvoviridae    Parvovirus               In Vivo
Síndrome de Mancha Blanca (VSMB)    dsADN       Camarón      Nirmaviridae    Whispovirus           In Vivo
Baculovirus Monodon (MBV)                  dsADN       Camarón      Baculoviridae   Baculovirus             In Vivo
Herpesvirosis Koi (HVK)                           dsADN        Peces      Alloherpesviridae Cyprinvirus            In Vivo                          

2. Citotoxicidad
TRADUCCIÓN DE FIGURA 2A EN ORDEN DE LECTURA:
Concentración
Tiempo
72 horas
Viabilidad celular (%) (Línea vertical)
Concentración (µg/mL) (Pie de imagen)

Figura 2A RetroMAD1.jpg
Figura 2A: Prueba de viabilidad celular en varias concentraciones de RetroMAD1 en un periodo de 72 horas.
En la prueba de citotoxicidad de RetroMAD1, un cultivo de células CRFK (Crandell-Rees de riñón de gato) fue expuesto a diferentes concentraciones de RetroMAD1 en un periodo de 72 horas. Los resultados son como se detallan en la Figura 2A: Las líneas celulares no mostraron señales de muerte celular excepto a 100 µl/mL, donde la viabilidad celular se reduce al 20%. La información de viabilidad celular muestra que la droga es completamente segura hasta dosis de 80 µg/ml en un tiempo de exposición de 72 horas.

3a. Estudio In Vitro
TRADUCCIÓN FIGURA 3Ag:
Actividad Antiviral de RetroMAD1 contra el PIF vía tratamiento simultáneo (Título)
Reducción del ARN Viral (%) – (Línea vertical)
Tiempo (horas) – (Pie de imagen)
Figura 3A Gatos.jpg
Figura 3Ag: Actividad antiviral de RetroMAD1 contra el PIF (Peritonitis Infecciosa Felina) en varios puntos de tiempo.
Los resultados obtenidos en la Figura 3Ag sugieren que RetroMAD1 muestra actividad inhibitoria contra el PIF vía tratamiento simultáneo en dosis altas no tóxicas (MNTD por sus siglas en inglés) arrojando un 72.33, 90.56 y 85.17% de inhibición en 24, 48 y 72 horas, respectivamente. Este estudio muestra que RetroMAD1 es efectivo contra el PIF in vitro.

3b. Entrada de RetroMAD1 en las células
    Proteína Recombinante               
        (etiquetada FITC)                               Núcleo celular                                Imagen combinada
Figura3A.jpg
Figura 3A: FITC etiquetado a His-Tag en RetroMAD1 muestra que se congrega alrededor del núcleo luego de entrar a la célula.
FITC = Isotiocianato de fluoresceína
DAPI = 4’, 6-diamidino-2-fenilindol
Los exámenes histológicos de fluoresceína revelan que RetroMAD1 no solamente se transporta dentro del citoplasma celular sino también a la periferia del núcleo celular, posiblemente a través del retículo endoplasmático. Aún se especula si RetroMAD1 se transporta dentro del núcleo de la célula o no. De todas formas, esto no compromete su actividad antiviral.
4a. Estudios de campo en perros
TRADUCCIÓN DE FIGURA 4A:
Enfermedad/Infección      # de Muestras      Tasa de  recuperación
                                                                                                                   sintomática

Virus Caninos              Parvovirus Canino (PVC-2)        143                          80.4
                                   Coronavirus Canino (CCV)           3                          100.0

Figura 4A RetroMAD1.jpg

Figura 4A: Estudio a pequeña escala realizado durante ensayo clínico de RetroMAD1  en enfermedades que afectan animales pequeños.
TRADUCCIÓN DE FIGURA 4B:
Grupo A                                                         Grupo B
9 días – 17%                                                  8 días – 9%
8 días – 33%                                                  7 días – 32%
5 días – 33%                                                  6 días – 4%
4 días – 17%                                                  5 días – 18%
                                                                       4 días – 14%
                                                           3 días– 23%

Figura 4B RetroMAD1.jpg
                                                                      
Figura 4B: Gráfico circular de la duración de la recuperación (en días) del Grupo A (tratamiento convencional) y Grupo B (RetroMAD1 + tratamiento convencional).
En un ensayo clínico a gran escala con veterinarios malayos registrados así como veterinarios filipinos, se realizó un breve estudio en perros con resultados sorprendentes. (Figura 4A) RetroMAD1 se utilizó en el tratamiento del Parvovirus Canino 2 mostrando altos índices de recuperación (80.4%, n=143). Adicionalmente, en un estudio comparativo de perros infectados con CPV-2 que fueron tratados únicamente con tratamientos convencionales, los animales tuvieron un 55% de supervivencia. Se observó un aumento en la tasa de recuperación de los perros infectados, así como un tiempo de recuperación más corto, siendo la duración de la recuperación en el Grupo A un promedio de 1.62 días menos que el Grupo B. (Figura 4B)
Resultados similarmente extraordinarios se lograron en un estudio preliminar en donde RetroMAD1 se utilizó en el tratamiento del Coronavirus Canino, con una alta tasa de recuperación (100%; n=3); sin embargo, la muestra de estudio es pequeña.
En la actualidad se realizan más estudios con mayor número de muestras.




4b. Estudio de campo gatos
Traducción tabla 4Ag:
                                   Enfermedad/Infección       #de Muestras   Tasa de recuperación
                                                                                                             Sintomática (%)

Virus Felinos              Virus de Inmunodeficiencia        25                                   76.0
                                   Felino  (VIF)
                                   Virus de Leucemia Felina(VLFe)   28                       67.9
                                   Virus de Panleucopenia               10                       90.0
                                   Felino  (VPF)
                                   Rinotraqueitis Viral Felina (RVF)  6                        83.3
                                    Calicivirus Felino (FCV)                  8                        75.0
                                   Peritonitis Infecciosa Felina(PIF)  21                          9.5

Tabla 4Ag.jpg
Tabla 4Ag: Estudio a pequeña escala realizado durante ensayo clínico de RetroMAD1 en enfermedades que afectan a animales pequeños.

En un ensayo clínico a pequeña escala con veterinarios malayos registrados, gatos sintomáticos con Virus de Inmunodeficiencia Felina (VIF) tuvieron una alta tasa de recuperación (76%; n=25) mientras que gatos similares con Virus de Leucemia Felina (VLFe) tuvieron también recuperaciones extraordinarias (67.9%; n=28). Otros estudios clínicos incluyeron al Virus de Panleucopenia Felino (VPF) con una muy alta tasa de recuperación (90%; n=10). Las infecciones análogas Rinotraqueitis Viral Felina (RVF) y Calicivirus Felino (FCV) obtuvieron también notables tasas de recuperación (83.3%; n=6 y 75%; n=8, respectivamente).
Un caso de VIF notable fue el del gato Orange, diagnosticado en las últimas etapas de VIF durante el 2007. Este gato inició un régimen de tratamiento con RetroMAD1. Orange logró una recuperación impresionante después de 4 meses de tratamiento, actualmente se encuentra en condición normal y saludable.

5. Seguridad farmacológica

18 ratas macho y 18 ratas hembra fueron colocadas al azar en 3 grupos (dosis alta, dosis baja y control), consistiendo cada uno de 6 ratas macho y 6 ratas hembra. A dos grupos se les administró oralmente diferentes dosis de RetroMAD1 en el periodo de un día. Cada grupo de investigación recibió una dosis única de 20mg/kg  5 ml/kg B.W. (dosis alta). Al grupo de control se le administró placebo oralmente (agua destilada) 5ml/kg B.W.

Estas ratas fueron posteriormente sujetas a ayuno durante la noche (se les permitió solamente tomar agua). Las ratas fueron alimentadas dos horas antes de la administración de la dosis. Después de recibir la dosis, no se les permitió comer o tomar agua por 3-4 horas. Las ratas fueron continuamente monitoreadas en intervalos de 30 minutos, 2 horas, 3 horas, 24 horas y 48 horas para observar si existían signos de cambios de comportamiento o el inicio de síntomas clínicos o toxicológicos.
La tasa de mortalidad se monitoreó por un periodo de 2 semanas. Las ratas fueron sujetas a ayuno y luego se les practicó la eutanasia por sobredosis de xilazina y del anestésico ketamina. La toxicidad se estimó a través del análisis bioquímico del suero, hematología e histología, de acuerdo a los métodos estándar.
Resultados:
No hubo muertes ni se observaron signos clínicos de toxicidad en ninguna de las ratas de los tres grupos durante el estudio.


 TRADUCCIÓN PRIMERA COLUMNA DE TABLA 5A:
Dosis
Machos
Control
Dosis baja
Dosis alta
Hembras
Control
Dosis baja
Dosis Alta

Tabla5A RetroMAD1.jpg
Tabla 5A: Perfil del hígado de las ratas que participaron en el estudio farmacológico.

Evaluar el perfil del hígado permite medir la bioquímica de la sangre producida en el hígado. Basándonos en la lectura de la Tabla 5ª, los grupos de ratas macho y ratas hembra que recibieron dosis altas y el grupo de ratas macho que recibió dosis bajas no mostraron ningún cambio significativo en su nivel de AST y ALT.                 

El grupo de ratas hembra que recibió una dosis baja de RetroMAD1 tuvo a una sola rata con una diferencia en el nivel de ALT cuando se la comparó con el grupo de control. La evaluación de los elementos tóxicos se caracteriza por un aumento del ALT, en cambio un bajo nivel de ALT sugiere que no han existido cambios en la función del hígado. Esta lectura indica que no existen efectos tóxicos en el hígado de las ratas de ambos sexos tras la administración oral de RetroMAD1.                                   


TRADUCCIÓN PRIMERA COLUMNA DE TABLA 5B:
Dosis
Machos
Control
Dosis baja
Dosis alta
Hembras
Control
Dosis baja
Dosis Alta

Tabla 5B RetroMAD1.jpg
Tabla 5B: Perfil renal de ratas que participaron en el estudio farmacológico.

El perfil renal se realiza para observar si existen anormalidades renales. Los exámenes efectuados para este propósito son de electrolitos, creatinina y nitrógeno ureico en la sangre (BUN). Los niveles de creatinina y de nitrógeno ureico en la sangre de ratas saludables es de aproximadamente 12-20 mg/dL (decilitros) y 0.3-0.4 mg/dL, respectivamente.

Ambos grupos no mostraron ninguna diferencia significativa en la lectura de los niveles de electrolitos y creatinina al ser comparados con el grupo de control. Las ratas macho a las que se administró oralmente RetroMAD1 en dosis altas y bajas mostraron una diferencia en los niveles BUN al compararlos con el grupo de control. Los niveles bajos de BUN no son un indicativo de mal funcionamiento renal. Más aún, los valores de los niveles de creatinina, comparados con el grupo de control, sugieren que RetroMAD1 no produce anormalidades renales.


 TRADUCCIÓN PRIMERA COLUMNA DE TABLA 5C:
Dosis
Machos
Control
Dosis baja
Dosis alta
Hembras
Control
Dosis baja
Dosis Alta

Tabla 5C RetroMAD1.jpg
Tabla 5C: Perfil lipídico de ratas que participaron en el estudio farmacológico.

El perfil lipídico es un panel de análisis de sangre que se realiza para detectar anormalidades en los lípidos. El análisis de los triglicéridos, así como los resultados del LDL y HDL, no fueron significativamente diferentes al grupo de control.  La rata hembra a la cual se administró oralmente RetroMAD1 mostró una diferencia en su nivel de triglicéridos.

Un aumento en el nivel de triglicéridos sugiere riesgos para el corazón, al contrario de un bajo nivel de triglicéridos. Esto indica que la administración oral de RetroMAD1 no produce efectos tóxicos en los lípidos.


 TRADUCCIÓN PRIMERA COLUMNA DE TABLA 5D:
Dosis
Machos
Control
Dosis baja
Dosis alta
Hembras
Control
Dosis baja
Dosis Alta
Dosis
Machos
Control
Dosis baja
Dosis alta
Hembras
Control
Dosis baja
Dosis Alta

Tabla 5D.jpg
Tabla 5D: Hematología de ratas que participaron en el estudio farmacológico.

La hematología es el estudio de la morfología y fisiología de la sangre. Se realiza un control hematológico para identificar anormalidades en la sangre. Las ratas macho y las ratas hembra no mostraron una diferencia significativa con el grupo de control dentro de los parámetros examinados. Sin embargo, en las ratas macho que recibieron dosis orales bajas de RetroMAD1 y en las ratas hembra que recibieron dosis orales bajas y altas de RetroMAD1, se detectó una baja en los niveles de MCHC y un aumento en los niveles de WBC. 

La Tabla 5D muestra un aumento en los niveles de neutrófilos B y una disminución en los niveles de concentración local de neutrófilos S. El contenido de los gránulos respectivos podría poseer propiedades antimicrobianas o virales y se evaluaron en cuanto a su participación en combatir la infección según los resultados del análisis. Esto sugiere que una nutrición adecuada es esencial para estabilizar el sistema inmunológico del cuerpo en la presencia de drogas.

6. La farmacocinética de RetroMAD1

 TRADUCCIÓN FIGURA 6A:
Farmacocinética de RetroMAD1 en ratas. (Título)
Concentración de RetroMAD1 (μg/ml) (Línea vertical)
Ø  Suero sanguíneo
Ø  Médula ósea
Ø  Estómago
Ø  Intestinos
Ø  Hígado
Ø  Riñones
Ø  Control
Tiempo (hora) (Línea en pie de imagen)

A.jpg



TRADUCCIÓN FIGURA 6B:
Concentración de RetroMAD1 en el suero de ratones en diferentes puntos de tiempo. (Título)
Concentración de RetroMAD1 (μg/ml) (Línea vertical)
Ø  Ratones tratados
Ø  Ratones en grupo de control

30 minutos – 1 hora – 2 horas – 4 horas – 8 horas – 12 horas – Día 2 – Día 3 – Día 4 – Día 5 – Día 6 – Día 7 – Día 10

Tiempo (línea en pie de imagen)
B.jpg
Figura 6: A.) Farmacocinética de RetroMAD1 en diferentes órganos y en diferentes puntos de tiempo. B.) Concentración de RetroMAD1 en el suero de ratones en diferentes puntos de tiempo.

La farmacocinética se realizó utilizando ratas de laboratorio. Estas ratas recibieron RetroMAD1 y luego de 12 horas se les practicó la eutanasia. Sus órganos fueron extraídos y cuantificados para el estudio de RetroMAD1. La figura 6A muestra que RetroMAD1 es absorbido por el tracto gastrointestinal 30 minutos después de su ingestión (estómago e intestinos) y luego pasa al hígado a través del sistema portal hepático llegando a un pico de una hora después de la ingestión.

Luego abandona el hígado e ingresa al sistema circulatorio en donde la droga es detectada dos horas luego de la ingestión tanto en el suero como en la médula ósea. Después de 12 horas de circulación, la droga es expulsada del cuerpo a través de los riñones.
Una investigación adicional (Figura 6B) corrobora el resultado pues muestra que RetroMAD1 llega a su pico en el suero de los ratones de 1 a 2 horas después de la ingestión. Muestras de sangre obtenidas 30 minutos post alimentación por gavaje en los días 2-10 evidencian una línea recta, lo cual indica que no existe bioacumulación residual de dosis anteriores.

7. Estabilidad de RetroMAD1

Traducción de figura 7A:
Estabilidad de la proteasa (Título)

Marcador  - Tripsina PH8 – Control negativo – Tripsina PH8 – Quimotripsina PH8 – Pepsina PH2

1 hora – 2 horas – 3 horas – 1 hora – 2 horas – 3 horas – 1 hora – 2 horas – 3 horas

Tiempo           Pepsina (pH2)             Tripsina (pH8)            Quimotripsina (pH8)
1 hora             No digerida                No digerida                   No digerida
2 horas            No digerida                No digerida                   No digerida
3 horas            No digerida         Parcialmente digerida       Parcialmente digerida

Figura 7A RetroMAD1.jpg
Figura 7A: Estudio de exposición de RetroMAD1 contra varias digestiones de proteasas.

En este estudio, se expuso a RetroMAD1 a varias digestiones de proteasas hasta por 3 horas, luego se realizó una Electroforesis en Gel SDS para determinar la integridad de la proteína. Los resultados del gráfico muestra que RetroMAD1 no fue digerido por la Pepsina al PH2 incluso luego de 3 horas y fue solo parcialmente digerido por la Tripsina PH8 y la Quimotripsina PH8 luego de 3 horas. Estos resultados muestran que RetroMAD1 se mantiene bioactivo incluso después de ser expuesto a las enzimas digestivas del tracto gastrointestinal.

Termostabilidad

TRADUCCIÓN TABLA 7A:
Primer recuadro: Integridad de RetroMAD1
Tabla 7A.jpg
Tabla 7A: Termostabilidad de RetroMAD1 al ser expuesto a varias temperaturas.

TRADUCCIÓN TABLA 7B:
Actividad Antiviral de RetroMAD1 contra HSV-2 vía tratamiento simultáneo (MOI 0.1) – 24 h (Título)
Reducción de ADN Viral (%) – (Línea vertical)
Ø  Día 1
Ø  Día 7
Ø  Día 30
Ø  Día 180
Temperatura (°C) (Línea pie de gráfico)
Figura 7B RetroMAD1.jpg
Figura 7B: Actividad antiviral de RetroMAD1 contra el HSV-2 luego de ser expuesto a varias temperaturas.

RetroMAD1 es extremadamente estable en el calor. Se diseñó un experimento en el cual se expuso RetroMAD1 a varias temperaturas (Tabla 7A) por 1, 7, 30 y 180 días. Luego, la droga pasa por una Electroforesis en Gel SDS. Los resultados muestran que RetroMAD1 permanece intacto a través de la observación de la banda de RetroMAD1 en el gel.

Para testear la bioactividad de RetroMAD1, su efectividad contra el Virus del Herpes Simple 2 (HSV-2) fue examinada. De acuerdo a los resultados (Figura 7B) RetroMAD1 inhibe al HSV-2, el cual no logró infectar las células del Vero (riñón de mono verde africano). Por lo tanto, podemos llegar a la conclusión de que las diferentes temperaturas a las que RetroMAD1 fue expuesto no afectaron su bioactividad.

8. Polvo micronizado de RetroMAD1
Figura 8A RetroMAD1.jpg
Figura 8A: Microscopía electrónica de RetroMAD1 en polvo/mL
Se ha producido con éxito una presentación de RetroMAD1 en polvo, utilizando el Secado de Fluido Supercrítico (SCFD por sus siglas en inglés). Esto es para protocolos de formulación futura utilizando tabletas. Los cristales cúbicos de RetroMAD1 miden aproximadamente 1 μg de diámetro.

TRADUCCIÓN FIGURA 8B:
Actividad Antiviral de Polvo Micronizado de RetroMAD1 contra el HSV-2 vía tratamiento simultáneo (MOI 0.1) – (Título)

Reducción del ADN Viral (%) – (Línea vertical)

RetroMAD1 – 10 μg/mL                               RetroMAD1 – 15 μg/mL                               RetroMAD1 - 5 μg/mL
(en agua + NaOH)                           (en agua + NaOH)                                          (en agua)
(Pie de imagen)

Figura 8B.jpg
Figura 8B: Actividad Antiviral de RetroMAD1 en polvo en varias concentraciones contra el HSV-2 en un tratamiento simultáneo.
La actividad antiviral del polvo micronizado de RetroMAD1 fue evaluada en cuanto a su actividad antiviral contra el HSV-2. El resultado obtenido, tal como sugiere la Figura 8B, sugiere que RetroMAD1 en polvo exhibe actividad inhibitoria contra el HSV-2 con un 80-100% de inhibición.

Por lo tanto, el polvo micronizado de RetroMAD1 puede ser introducido como una nueva ruta en la administración de la droga en el futuro.

9. Instalaciones
TRADUCCIÓN DE PIES DE FOTO DE ÚLTIMA PÁGINA DE DOSSIERS EN INGLÉS:
Ø  Instalaciones de cGMP
Ø  Laboratorio de Investigación y Desarrollo
Ø  Laboratorio de procesos de optimización