AISLAMIENTO DEL VIRUS DE LA ENCEFALITIS VENEZOLANA DE UN
MURCIELAGO FRUGIVORO (ARTIBEUS TURPIS) EN MEXICO
C. Wong-Chis* y W.F. Scherer
Se aisló el virus de la encefalitis venezolana de las vísceras de
un murciélago Artibeus turpis capturado en el sudeste de
México. Los aislamientos de arbovirus procedentes de murciélagos, las características de las infecciones experimentales
arbovíricas de estos animales y sus pautas naturales de conducta hacen que los murciélagos sean de importancia potencial, con respecto a algunas enfermedades producidas por
arbovirus, como fuentes de virus para los mosquitos u otros artrópodos vectores.
Introducción
Existen numerosas pruebas de que los murciélagos influyen en el curso natural de diversas
enfermedades víricas (1). Si se tienen en
cuenta su intima relación con los mosquitos, y
otros vertebrados, su distribución omnipresente, el concepto de portadores asintomáticos
y el fenómeno de la hibernación en determinadas especies de murciélagos (21, se puede atribuir a estos animales importancia potencial en
las enfermedades causadas por arbovirus. Una
de estas, en las Américas, es la encefalitis venezolana (EV), producida por un virus que, según
se ha demostrado experimentalmente, infecta a
diversas especies de murciélagos insectívoros
(3). En el presente artículo se describe el aislamiento del virus EV de los órganos de un murciélago Artibeus turpis, capturado en 1963 en
Sontecomapan, Veracruz, en la costa tropical
del este de México.
‘Estas investigaciones se realizaron en
colaboración con la OPS y el Gobierno de México y
contaron, en parte, con el apoyo de la subvención
5-Tl-AI-231 del Servicio de Salud Pública de los
Estados Unidos y, en parte, con el contrato
DA-49-193- MD-2295 del ejército de este país.
*Jefe de la Sección de Virología, Instituto de
Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional
Autónoma de México, México, D.F.
3Profesor y Jefe del Departamento de
Microbiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Comell, Nueva York, E.U.A.
339
Materiales y métodos
Situación y captura de los murciélagos
Los murciélagos fueron capturados de
noche con redes invisibles japonesas, en un pequeño sector de selva tropical de unos 300 por
400 m aproximadamente, a 1.2 km al noroeste
de Sontecomapan, aldea situada al nivel del
mar, al sudoeste de Veracruz, México (4). Se
extrajeron asépticamente trozos de tejido cardíaco, pulmonar y hepático de cada murciélago
en un cercano laboratorio de campo y, después
de reunidos y cerrados herméticamente en
ampollas de vidrio, se almacenaron a-60°C en
hielo seco hasta el momento de la prueba.
Pruebas de los virus
Se deshelaron los tejidos cardíacos, pulmonares y hepáticos y se maceraron en un mortero con el fin de preparar una suspensión al 10%
en albúmina bovina, enfriada al 1% en solución
de Hanks, que contenía 100 unidades de penicilina por ml y 100 pg de estreptomicina, también por ml. Después de centrifugado a 400 G
durante 10 minutos a YC, se inoculó el
líquido sobrenadante a camadas de ocho ratones de dos a tres días de edad, en cantidades
de 0.01 ml por vía intracraneana (ic) y 0.02 ml
por vía subcutánea (SC). Los ratones lactantes
inoculados se mantuvieron con sus madres y se
examinaron diariamente durante 14 días para
descubrir los síntomas de enfermedad. prob6 también el inóculo para determinar la esterilidad bacteriana en agar sangre y en caldo
de soja con tripticasa. Se extrajeron asepticamente los cerebros y los músculos de las extremidades traseras de los ratones muertos o
moribundos y se preparó una suspensión al
10 % que serviría de fuente subsiguiente de
virus.
Para la prueba en cultivos celulares en embrión de pollo (CEP), preparados en la forma
antes descrita (51, se inoculó 0.1 ml de suspensión vírica en cada uno de los tres tubos de cultivo que se incubaron a 37OC. Se examinaron
diariamente los cultivos y se reunieron y mantuvieron a-60°C los líquidos de cultivos celulares en los que se observaron pronunciados efectos citopáticos para que sirvieran de fuente subsiguiente de virus.
Identificación inmunológica de los virus aislados
Se identificó el agente vírico mediante las
pruebas de fijación del complemento (FC) y
neutralización. Se preparó un antígeno con cerebros de ratones moribundos inoculados con
material del pase 2 desangrando a los animales
y utilizando una suspensión al 20 % en 0.15 M
NaCl. Después de conservada a 4OC durante la
noche, se centrifugó la suspensión a 10,000 G
por una hora, a SOC, y se introdujo el sobrenadante en ampollas, manteniéndolo a-60°C. Los
antisueros eran de ratón o conejo inoculados
con virus EV, cepa 63U2 (4), o procedían de
una persona convaleciente que contrajo una infección de laboratorio con virus 63U2. Los sueros se calentaron a 60°C durante 20 minutos,
efectuándose pruebas de fijación del complemento (4).
La nueva identificación de virus comprendía
una prueba de neutralización cualitativa en
CEP de virus EV, cepa 63U2, utilizándose antisuero de conejo preparado con virus de ratón
lactante en el pase 3 a una dilución de 1:20,
frente a dos o tres diluciones de virus al
céntuplo, como suspensión al lO%de cerebro y
músculos de ratón. La neutralización positiva
se mdicó mediante células normales de embrión
de pollo en cultivos en tubo, con medio líquido
inoculado con l-3 diluciones de virus y antisuero, y la total destrucción celular en cultivos
inoculados con diluciones correspondientes de
virus sin antisuero, después de 3 a 5 días, a
37oc.
Resultados
En la noche del 6 de agosto de 1963 se
reunieron 6.5 especímenes de murciélagos capturados en la selva de Sontecomapan (cuadro
1).
Se aisló una cepa de virus, la 63Y75, de una
suspensión de 10 % de un conjunto de tejidos
cardíacos, pulmonares y hepáticos tomados de
un macho Artibeus turpis (cuadro 2). Se produjeron ocho defunciones al segundo día en la camada original de ocho ratones lactantes inoculados y en el material original se obtuvieron
CUADRO 1 -Vísceras de murciélago obtenidas en la selva de Sontecomapan, Veracruz, México, el 6 de
agosto de 1963, sometidas a prueba para determinar la presencia de arbovirus.
Especie
Carollia perspicillata
Artibeus turpis
Glossophaga soricina
Otrosb
Machos
19
9
3
2
Sexo
Hembrasa
13(3)
8(I)
4
Desconocido
6
1
Total
32
23
7
3
Total
a( ) número de hembras preñadas.
bl macho Artibeus lituratus, 1 macho Artibeus jatnaicensis y 1 Vampiroides majar de sexo desconocido. Wong-Chiu y Scherer . ENCEFALITIS VENEZOLANA 341
títulos de 10-4.5 por 0.03 ml de tejido, cuando
se inoculó en ratones lactantes por las vías ic y
SC. Una suspensión al lO%, preparada con cerebro y músculo de ratón muerto y representativa del pase 1 en ratón lactante, produjo la
muerte de un segundo grupo de ocho ratones
lactantes en el primer día; otro grupo de 10 ratones lactantes murieron en el primer día, después de la inoculación del virus en el pase 2. En
un antígeno fijador del complemento preparado con cerebros de ratón, después de los pases
del virus en ratones, se obtuvo un título de
1: 16 frente a ocho unidades de EV, cepa 63U2,
antisuero de ratón o suero convaleciente humano, pero el antígeno 63Y75 no reaccionó en
una dilución de 1:4, con ocho unidades de anticuerpo de suero específico de ratón, con respecto al virus de Tlacotalpán, cepa 61D240 (6),
o al virus Patois, cepa 63A49 (7).
Se aisló de nuevo el virus satisfactoriamente
de una suspensión de víscera original congelada, alrededor de siete semanas después del primer aislamiento (cuadro 2). La suspensión produjo la muerte a los nueve ratones lactantes de
una camada en los días 1-3, y pases subsiguientes en ratones o cultivos celulares en embrión
de pollo produjeron la muerte inmediata o
efectos citopáticos. En un antígeno de FC, preparado con cerebros de ratón lactante con el virus aislado de nuevo, se obtuvo un título de
1: 16 frente a ocho unidades de suero EV de
convaleciente humano, y el virus se neutralizó
en CEP mediante una dilución de 1:20 de EV,
cepa 63U2, de antisuero de conejo.
Resumen
La encefalitis venezolana (EV) se reconoció
primeramente como enfermedad de los equinos
(8), pero han ocurrido infecciones recientes de
virus de EV en proporciones epidémicas en las
poblaciones humanas (9), habiéndose aislado el
virus de varios animales (1, 10).
El presente informe de un aislamiento de virus EV procedente del murciélago frugívoro Artibeus turpis, en
México, extiende la gama de huéspedes del virus EV. La validez del aislamiento fue corroborada por el hecho de que el antígeno 63Y75
fue el cuarto de una serie de siete especímenes,
elaborados en el mismo cubículo en las primeras horas de una mañana; los otros seis
especímenes, tres elaborados antes del 63Y75 y
tres después resultaron negativos. No era probable la contaminación en el campo, porque sólo
CUADRO 2-Aislamiento y reaislamiento de virus EV, cepa 63Y75, de las vísceras de un murciélago macho
Artibeus turpis.
Fecha de la prueba Material
Aislamiento
31 de enero de 1964
5 de febrero de 1964
ll de febrero de 1964
Reaislamiento
20 de marzo de 1964
24 de marzo de 1964
24 de marzo de 1964
Sistema
utiiizadoc
Mortalidad
de ratones
0 razón entre
CEP y ECPd
Día de
la muerte
de ratones o
ECPe
CPHa
RL-plb
RL-P~~
RL
RL
RL
CPH
RLpl
RL-p 1
RL
RL
CEP
8/8 2
818 1
lO/lO 1
919 l-3
ll/11 l-2
616 2
%Ionjunto de tejidos cardíacos, pulmonares y hepáticos de murciélago.
bSuspensiÓn de cerebro y músculos de ratón lactante, pases 1 6 2.
‘RL=ratón lactante: CEP=cultivo celular en embrión de pollo.
dECP=efecto citopático.
eEl día de inoculación se consideró como el día 0.
uno de los 65 murciélagos capturados y prepa- can que los murciélagos pueden tener imporrados el 6 de agosto de 1963, con el fin de co- tancia potencial con respecto a algunas enferlocar las vísceras en ampollas sobre hielo seco, medades arbovíricas. En cuanto a su función,
produjo un virus. Por lo tanto, este aislamiento podrían servir indudablemente como fuentes
de virus EV, junto con los informes de otros de virus para los mosquitos vectores durante los
aislamientos de arbovirus procedentes de mur- períodos de viremia, pero es preciso realizar esciélagos (II), las características de la infección tudios ulteriores para evaluar la excreción o seexperimental por arbovirus de estos animales creción de virus EV por los murciélagos y la po-
(3, 12) y su frecuente proximidad natural a los sible propagación directa del virus al hombre o
mosquitos, hombres y equinos vectores, indi- los equinos. 0
REFERENCIAS
(1) Sulkin, S.E. ‘“The bat as a reservoir of viruses in
nature”. Progr Med Virol 4: 157-207, 1962.
(2/ Sulkin, S.E., Allen, R., Sims, R. y Taylor, S.K.
“Batsin relation to arthropod-borne viruses: An
experimental approach with speculations”.
AmerJPublHlth 55:1376-1385, 1965.
(3) Corristan, E.C., La Motte, L.C. Jr. y Smith, D.G.
“Susceptibility of bats to certain encephalitis
virus.“Fed Proc 15:584, 1956.
(4) Scherer, W.F. et al. “Venezuelan equine encephalitis virus in Veracruz, Mexico, and the use of
hamsters as sentinels”. Science 1451274-275,
1964.
(5) Scherer, W.F. “Inapparent vira1 infection of cells
in vitro. I. Conversion of mapparent to apparent infection by environmental alteration of
chicken embryonic cells m cultures inoculated
with Japanese encephalitis virus”. Amer J Path
45:393-411, 1964.
(61 Scherer, W.F. et al. “Isolation of Tlacotalpan
virus, a new Bunyamwera-group virus from
Mexican mosquitoes”. Amer J Trop Med Hyg
16:79-91, 1967.
(7) Zarate, M.L., Geiger, R.H., Shope, R.E. y Scherer,
W.F. “Intergroup antigenic relationships among
arboviruses manifested by a Mexican strain of
Patois virus and viruses of the Bunyamwera, C,
California Capim and Guama groups”. Amer J
Epid 88:273-286, 1968.
(8) Kubes, V. “La peste loca de las bestias. Sus manifestaciones, tratamientos y prevención”. Min de
Agr y Grfa de Venezuela, 1936.
(9) Sellers, R.F., Bergold, G.H., Suárez, O.M. y Morales, A. “Investigations during the Venezuelan
equine encephalitis outbreaks in Venezuela
1962-1964”. Amer J Trop Med Hyg
14:460-469, 1965.
(10) Sidwell, R.W., Gebhart, L.P. y Thorpe, B.D.
“Epidemiological aspects of Venezuelan equine
encephalitis virus infections”. Bact Rev
31:65-81, 1967.
(Il) Sulkin, S.E., Sims, R.A. y Allen, R. “Isolation of
St. Louis encephalitis virus from bats&Czdarida
b. mexicana) in Texas”. Science
152:223-225,1966.
(1.2) Sulkin, S.E., Allen, R y Srms, R. “Studies of
arthropod-borne vrrus infections m Chiroptera.
1. Susceptibility of insectivorous species to
experimental infection with Japanese B and St.
Louis encephahtis viruses”. Amer J Trop Med
12:800-814, 1963.
Isolation of Venezuelan encephalitis (VE) virus from a frugivorous bat
(Artibeus turpis) in Mexico (Summary)
Venezuelan encephalitis was first recognized
as a disease of equines (8) but recent VE virus
infections have occurred in epidemic proportions in human populations (9), and the virus
has been isolated from a number of animals (1,
IU).
This report of an isolation of VE virus
from a frugivorous bat, Artibeus turpis, in
Mexico extends the host range of VE virus. The
validity of the isolation was substantiated by
the fact that 63Y75 was the fourth of a series
of seven specimens processed in the same
cubicle early one morning; the other six
specimens, three processed before and three
after 63Y75, were negative. Contamination in
the field was not likely to have occurred
because only one of the group of 65 bats
caught and processed on 6 August 1963 to put
organs in ampules on dry ice yielded a virus. Wang-Chia y Sch& . ENCEFALITIS VENEZOLANA 343
Therefore, this isolation of VE virus, together arbovirus diseases. Their role could certainly be
with reports of other arbovkus isolations from as sources of virus for vector mosquitoes during
bats (II), the characteristics of experimental periods of viremia, but further studies are also
arbovirus infection in these animals (3, I2), needed to evaluate excretion or secretion of
and their frequent natural proximity to vector VE virus by bats and possible direct spread of
mosquitoes, man and equmes, indicate that virus to man or equmes.
bats may be of potential importance to some
Isolamento do vík da encefalite venezuelana (EV) num morcêgo frugívoro
(Artibeus turpis) no México (Resumo)
A encefalite venezuelana foi identificada
primeiramente como doenca dos equinos (8)
mas têm ocorrido infeccóes recentes por virus
de EV em proporcões epidêmicas nas populacões humanas (9), tendo-se isolado o virus de
&ios animais (1, IU).
A presente comunicacão
do isolamento de virus EV procedente do
morcêgo frugivoro Artibeus turpis, no MBxico,
amplia a gama de hospedenos do virus EV. A
validez do isolamento foi corroborada pelo fato
de que o antfgeno 63Y75 foi o quarto de urna
serie de sete espécimes, elaborados no mesmo
cubículo, nas primeiras horas de urna manha;
os outros seis espécimes, três elaborados antes
do 63Y75 e três depois, derdm resultados negativos. Náo era provável a contaminacão no
campo, porque apenas um dos 65 mor&gos
capturados e preparados a 6 de agosto de 1963,
com o fim de colocar as visceras em ampolas
sobre gêlo seco, produziu um vírus. Portanto,
êsse isolamento de vírus EV, com as comunicacöes de outros isolamentos de arbovírus procedentes de morcêgos (1 l), as características da
infeccáo experimental por arbovírus dêsses animais (3, 12) e sua,freqüente proximidade natural
aos mosquitos, homens e equinos vetores, indicam que os morcêgos podem ter importancia
potencial com respeito a algumas doencas arbovíricas. Quanto å sua funcão, poderiam servir
indubit%vehnente como fontes de virus para os
mosquitos vetores durante os períodos de viremia, mas é preciso fazer novos estudos para
avaliar a excrecão ou secrecão de vírus EV
pelos morcêgos e a possível propagacão direta
do virus ao homem ou aos equinos.
Isolement du virus de l’encéphalite vénézuélienne (EV) d’une chauve-souris
frugivore (Artibeus turpis) au Mexique (Résumé)
L’encéphahte vénézuéhenne est surtout
connue comme maladie des équins (8) mais
récemment des infections du virus EV dans des
proportions endémiques ont été enregistrées
dans certaines populations humaines (9), le
virus ayant Bté isolé dans plusieurs animaux (1,
10). Le présent rapport traite de l’isolement du
virus EV provenant de la chauve-souris frugivore Artibeus turpis, au Mexique, ce qui étend
encare la gamme des hôtes du virus EV. La validité de l’isolement a été corroborée par le fait
que l’antig%ne 63Y75 est le quatrigme d’une
série de spécimens, analysés dans la même
éprouvette aux premiEres de la matinée. Sur les
six autres spdcimens, trois ont bté analysés
avant le 63Y75 et trois apr& et ont donné des
résultats nhgatifs. Il n’est pas probable que la
contamination ait lieu sur le terrain, car une
seule des 65 chauves-souris capturées et préparées le 6 août 1963, afin de placer les vis&res
dans des ampoules sur de la glace skhe a produit un vhus. En conséquence, l’isolement du
virus EV, ainsi que les rapports sur les autres
isolements d’arbovirus provenant de chauvesouris (Il), les caract&istiques de l’infection
experimentale de ces animaux au moyen
d’arbovirus (3, 12) et le fait que fréquemment
ils soient naturellement pr&s des moustiques
(II), des hommes et des équins vecteurs, indiquent que les chauves-souris peuvent avoir
une importance potentielle par rapport I certaines maladies “arboviriques”. En ce qui concerne leur fonction, elles pourraient certainement servir de sources de virus pour les moustiques vecteurs durant les périodes de virémie,
mais il convient de mener des études ultérieures
pour évaluer I’excrétion ou la sécrétion du virus
EV par les chauves-souris et l’éventuelle propagation directe du virus 2 l’homme ou aux
équins.
