2. LOS VIRUS COMO ENTIDADES FÍSICAS
2. 1. Tamaño de los virus
Los virus son tan pequeños que pueden pasar a través de filtros que normalmente retienen a las bacterias. Comparten esta característica con las clamydias y mycoplasmas que presentan una fase filtrable.
El tamaño de los virus se ha establecido por procedimientos de ultrafiltración, ultracentrifugación y microscopía electrónica. Esta característica física se expresa en nanómetros (nm) o milimicras (mμ), unidad que corresponde a 0,000.001 mm. El rango de tamaño de los virus se encuentra entre 25 y 300 nm. Los virus más pequeños son los picornavirus de la fiebre aftosa y de la poliomielitis humana, y los parvovirus que tienen un diámetro de aproximadamente 25 nm. Los virus más grandes corresponden a los virus pox que causan las viruelas, con un tamaño aproximado de 300 nm. Los filovirus (virus Ebola) pueden alcanzar un largo cercano a los 300 nm.
Los mimivirus “Acanthamoeba polyphaga mimivirus” son los virus ADN más grandes con alrededor de 400 nm de diámetro. Su cápside es de forma icosaédrica, el virión carece de envoltura y el genoma es ADN circular de cadena doble (ADNdh), de 1,2 Mb de longitud y tienen 1.260 genes. En 2010 se ha identificado un virus gigante marino que infecta a la “Cafeteria roenbergensis”, que tendría una gran relevancia ecológica. Estos virus “CroV” tienen un genoma que contiene aproximadamente unos 730.000 pares de bases lo que lo convierte en el virus marino más grande conocido lo que lo convierte en el virus marino más grande conocido. El virus, denominado CroV, posee numerosos genes que suelen utilizar las células vivas para reparar daños en el AND y para sintetizar proteínas y azúcares. El virus, denominado CroV, posee numerosos genes que suelen utilizar las células vivas para reparar daños en el AND y para sintetizar proteínas y azúcares.
El tamaño de las partes constitutivas de los virus se expresa en Angstroms (Aº), medida que corresponde a una décima de nanómetro. En los virus con forma de bala (rhabdovirus) el ancho de la partícula viral es de 500 Aº y el tamaño de las proyecciones de superficie es de 100 Aº. El largo de estos virus es de 180 nm.
2. 2. Morfología viral
La morfología viral está dada por la disposición espacial de sus estructuras. La forma de los virus se ha establecido mediante observación con el microscopio electrónico que es capaz de resolver partículas que se encuentren a una distancia de 0,001 μm. La técnica más usada es la tinción negativa con fosfotungstato de potasio. En cortes de tejido se utiliza la tinción con acetato de uranilo.
Los virus presentan diversas morfologías, pudiendo ser isométricos o esferoidales (virus aftoso), alargados o tubulares (virus mosaico del tabaco) o tener formas mixtas (fagos bacterianos).
Algunos virus tienen forma de bala (virus de la rabia) o formas complejas como ladrillos (virus de las viruelas), otros son alargados (virus Lassa).
Químicamente los virus están constituidos por un solo tipo de ácido nucleico (AN), escasas proteínas, y en algunos casos por lípidos y glúcidos de origen celular. Estas moléculas forman las siguientes estructuras: nucleoproteína, cápside, matriz, envoltura o manto lipídico y espículas o proyecciones de superficie (peplómeros).
El ácido nucleico, ARN o ADN, siempre tiene una ubicación central. El ácido nucleico junto a proteínas que se les adhieren y facilitan su plegamiento conforman la nucleoproteína, también denominada nucleoide o “core”.
Las proteínas constituyen una verdadera cápsula que encierra y protege al ácido nucleico. La envoltura proteica se denomina cápside (del griego capsa: caja) y está formada por pequeñas subunidades de naturaleza polipeptídica, llamados capsómeros. La función de la cápside viral es fundamentalmente protectiva; además es antigénica y le confiere la forma a los virus no envueltos.
Cada capsómero está conformado por subunidades estructurales constituidos por tres polipéptidos o protómeros. Los capsómeros se ensamblan de acuerdo a principios geométricos y se distribuyen generalmente como hexámeros y pentámeros, visibles al microscopio electrónico.
Algunos virus presentan una estructura proteica, ubicada entre la cápside y la envoltura lipídica, llamada matriz, que les da una mayor rigidez.
El conjunto de ácido nucleico y cápside denominado nucleocápside se organiza estructuralmente adoptando dos fomas o simetrías: icosaédrica y helicoidal.
En los virus con simetría icosaédrica la cápside envuelve como una cápsula al ácido nucleico viral. Estos virus en microscopía electrónica se observan con formas esféricas debido a que son poliédricos isométricos. La mayoría son icosaédricos, con 20 caras triangulares y 12 vértices. El número total de capsómeros es característico para una determinada familia viral. Los adenovirus tienen 252 capsómeros y los herpes 162. El número de capsómeros y su presentación geométrica constituyen criterios utilizados en la clasificación viral
En los virus con simetría helicoidal la nucleocápside se presenta como un espiral en que el ácido nucleico sigue la curvatura de la envoltura proteica, distinguiéndose nucleocápsides helicoidales rígidas y flexibles. Los virus con nucleocápside rígidas se observan en microscopía electrónica como un cilindro o resorte alargado.
Los virus con nucleocápsides flexibles se presentan como estructuras pleomórficas, en que la nucleocápside se enrolla sobre sí misma. En este caso la nucleocápside es envuelta por una matriz proteica y una envoltura lipídica con proyecciones de superficie.
Los virus envueltos presentan una envoltura o manto lipídico originado en la célula hospedadora. La envoltura es típica de los virus herpes.
Ciertos virus presentan proyecciones de superficie de carácter glicoproteico, llamados peplómeros. Los coronavirus poseen peplómeros que les confieren un aspecto de corona, de allí su nombre.
3. LOS VIRUS COMO ENTIDADES QUÍMICAS
3. 1. Composición química
Los virus más simples están formados por el ácido nucleico genómico y escasos polipéptidos, mientras que los más complejos tienen además hidratos de carbono y lìpidos. Los arenavirus contienen ribosomas de origen celular que adquieren al salir por gemación de la célula donde se han multiplicado; estos ribosomas son afuncionales.
Acidos nucleicos. El ácido nucleico viral se encuentra en el interior del virión, enrollado y firmemente unido a proteínas constituyendo el núcleo viral o “core”. Según sea el ácido nucleico que contengan los virus se clasifican primariamente en: desoxirribovirus con ADN y ribovirus con ARN. Los ribovirus constituyen el único ejemplo en la naturaleza en que la información genética se almacena exclusivamente en el ARN.
El ácido nucleico viral que constituye el genoma del virión es el responsable del carácter infeccioso del virus y al contener toda la información necesaria para perpetuar una especie viral o linaje es responsable de la continuidad genética de la especie viral. Un virus defectivo que carece de ácido nucleico no es infeccioso; a su vez, un virus tratado con un inactivante como la luz ultravioleta pierde su infecciosidad.
Los ácidos nucleicos virales son haploides, presentan una copia de cada gen con excepción de los virus de la leucosis que son diploides.
El ADN celular es biténico y el ARN celular es monoténico; sin embargo, los ácidos nucleicos virales presentan varias excepciones, existiendo ADN monoténicos (parvovirus), ADN cíclicos (virus polioma), ARN biténicos (reovirus) y ARN fraccionados (myxovirus, arenavirus y bunyavirus).
Las cadenas de un ácido nucleico biténico son de polaridad opuesta y complementaria: si una es positiva (+) la otra será negativa (-). Un virus monoténico es (+) o de cadena (+) cuando su genoma tiene la polaridad para actuar como ARN mensajero dentro de la célula, iniciando y completando la síntesis de proteínas virales. Un virus será considerado como (-) si su genoma no puede actuar como ARNm directo, requiriendo la síntesis de ARNm específico viral. Los virus (+) son capaces de infectar a las células con su ácido nucleico el que actúa como ARNm.
El peso molecular del genoma viral varía entre 2 y 160 millones de daltones. Los virus ADN tienen entre 4,5 y 200 kbp; los virus ARN tienen entre 2 y 18 kb. Genomas tan pequeños sólo contienen entre 4 y 200 genes que les permiten codificar no más de 200 proteínas.
Proteínas. Son codificadas por el genoma viral y producidas por la célula hospedadora. Están constituidas por L-aminoácidos corrientes y muchas de ellas son glicoproteínas. Debido al pequeño tamaño del genoma viral su número es escaso por lo que se repiten.
Las proteínas virales se clasifican en proteínas estructurales y no estructurales.
Las proteínas virales estructurales pueden ser internas se ubican en la nucleoproteína, y externas que constituyen la cápside, el manto lipoproteico y las proyecciones de superficie. Las proteínas virales no estructurales corresponden a aquellas que se producen precozmente durante el ciclo de replicación viral, pueden ser proteínas tempranas de desnudamiento o proteínas que bloquean la síntesis de las macromoléculas celulares.
Las proteínas de la cápside, envoltura lipídica y proyecciones de superficie constituyen verdaderos receptores que se unen con los receptores celulares, confiriendo la especificidad de los virus por las células lo que se traduce en un marcado tropismo de los virus por ciertas células, tejidos u órganos comprometiendo, por lo tanto, a determinados sistemas y órganos a la acción patógena viral. Si la célula no tiene receptores para un virus éste no la infectará al no poder introducir su ácido nucleico. Consecuentemente si una especie animal o vegetal no tiene células con receptores para un determinado virus no será infectado por él. Sin embargo, esto se ha conseguido experimentalmente mediante la inoculación de ácido nucleico (transfección) del virus de la poliomielitis humana en una célula de origen canino no susceptible a este virus, lográndose que estas células repliquen el ácido nucleico viral y produzcan nuevos viriones.
Las proteínas virales conforman los determinantes antigénicos responsables de la antigenicidad del virión, lo que permite al organismo infectado reconocer a los virus como extraños y montar una respuesta inmunológica para finalmente eliminarlos. Estas proteínas se organizan en cápsides icosaédricas o nucleocápsides helicoidales que además de conferir una determinada forma al virus, protegen el acido nucleico viral de la acción deletérea de las endonucleasas celulares y de pH extremos.
Los lípidos, de origen celular, se ubican en el manto de los virus envueltos como una capa bilipídica que presenta los enlaces hidrofóbicos hacia el interior del virus. Los virus adquieren la envoltura lipídica en la membrana citoplasmática por un proceso similar a la gemación. En algunos virus se han detectado glicolípidos, fosfolípidos, colesterol y triglicéridos. Los virus envueltos son susceptibles a la acción de solventes de lípidos como el cloroformo y éter.
Los carbohidratos, también de origen celular, se encuentran asociados a proteínas y lípidos formando glicoproteínas y fosfolípidos. En algunos virus se han encontrado manosa, glucosa, galactosa y glucosamina.
La calidad y concentración de los lípidos y carbohidratos serán semejantes a la de la membrana citoplasmática de la célula en que el virus se replicó.
Las espículas o proyecciones de superficie, constituidas por 2 ó 4 glicoproteínas, tienen propiedades antigénicas, y participan en la unión específica del virus a la célula y en el fenómeno de interferencia viral.
Las enzimas virales pueden ser proteínas estructurales (nucleoproteína) o proteínas tempranas. De acuerdo a su funcionalidad se clasifican en seis grupos:
1. Enzimas que afectan la interacción del virus con la superficie de la célula. Ejemplo:
neuroaminidasa, lisozima.
2. Enzimas que transcriben el ADN viral en ARNm. Ejemplo: ARN polimerasa ADN
dependiente.
3. Enzimas que transcriben el ARN viral en ADN. Ejemplo: transcriptasa reversa.
4. Enzimas que replican ADN viral. Ejemplo: ADN polimerasa ADN dependiente.
5. Enzimas que adicionan grupos terminales específicos al ácido nucleico viral. Ejemplos:
nucleótido fosfohidrolasa (convierte el terminal 5`trifosfato en difosfato), guaniltransferasa,
ARN metilasa, y poli(A) polimerasa.
6. Otras enzimas virales son: proteína kinasa (fosforilan proteínas), ribonucleasas,
desoxyrribonucleasas, endorribonucleasas y polinucleótido ligasa.
3. 2. Inactivación viral
Se entiende por inactivación viral la pérdida de la capacidad infecciosa de un virus, es decir la propiedad de infectar células susceptibles. La inactivación viral ocurre cuando el ácido nucleico viral o las proteínas virales son alteradas por tratamientos físicos o químicos, lo que conduce a que el ácido nucleico no se transcriba ni se replique, o a que el virus no se una específicamente a las células. Los principales inactivantes virales son el calor, las radiaciones y ciertas substancias químicas.
1. Calor. Los virus animales son muy variables en cuanto a su termosensibilidad, siendo más susceptibles los virus envueltos. El tratamiento térmico realizado a temperaturas superiores a 55º C desnaturaliza las proteínas ubicadas en la cápside y envoltura lipídica. La mayoría de los virus pierde totalmente su infecciosidad cuando son tratados a 55 - 60º C.
En términos generales los virus se inactivan rápidamente, en segundos, cuando son sometidos a 60º C; en minutos cuando son tratados a 37º C; en horas a 25º C y en días a 4º C. Mantenidos a -70º C o a temperaturas más bajas en N líquido (-196º C) no pierden su infecciosidad.
Algunos virus son muy susceptibles a los cambios bruscos de temperatura, como por ejemplo cambios de +37º C a -70º C. Frente a la acción de la temperatura algunos virus pueden ser estabilizados con sales (Mg Cl2, Mg SO4 y Na2 SO4) en concentraciones molares; de esta forma pueden ser mantenidos a temperatura ambiente (25º C) durante semanas sin perder su infecciosidad.
En el laboratorio se utilizan autoclaves (calor húmedo) y el horno Pasteur (calor seco) para inactivar virus y bacterias.
2. Radiaciones. Los virus son inactivados por radiaciones ionizantes y no ionizantes. Las radiaciones ionizantes, raxos X o gamma, producen rupturas en el ácido nucleico viral; las no-ionizantes, luz visible (solar) y luz ultravioleta (LUV) también afectan el ácido nucleico al romper polinucleótidos o al formar dímeros de bases. Para desinfectar laboratorios se utilizan lámparas de LUV.
3. Sustancias químicas. Se utilizan como desinfectantes o como inactivantes de virus en la preparación de vacunas.
Se agrupan en: agentes oxidantes como el cloro en hipoclorito de Na, y el yodo en tintura; agentes alkilantes: formaldehido y glutaraldehido; agentes desnaturalizantes de proteínas: alcohol y fenol; agentes desnaturalizantes de ácido nucleico: beta-propiolactona y acetil etilenimina (AEI) binaria; detergentes; y colorantes vitales: rojo neutro, naranja de acridina y proflavina. Los colorantes vitales se unen con el ácido nucleico viral el que se hace más sensible a la acción de la luz.
3. 3. Preservación de la infecciosidad viral
En el laboratorio se mantiene la viabilidad de los virus, con fines de estudio o diagnóstico, manteniendo las suspensiones virales en congelación a temperaturas de -70º C (temperatura del hielo seco) o a -196º C (temperatura del N líquido) y adicionadas de elementos protectores como el dimetil sulfóxido (DMSO), glicerol o suero sanguíneo en un medio isotónico y pH fisiológico. A temperatura de refrigeración, +4º C, la infecciosidad de los virus se mantiene aproximadamente durante una semana. Los virus también pueden ser mantenidos viables en forma liofilizada, agregándoles caseína o suero sanguíneo a la suspensión viral.
3. 4. Purificación viral
El objetivo de todo proceso de purificación viral es obtener suspensiones virales libres de componentes celulares. Virus purificados son necesarios para estudios morfológicos, caracterización físico-química, aislamiento de ácido nucleico, preparación de antígenos para producir sueros antivirales o para ser utilizados en pruebas serológicas y en la preparación de vacunas subunitarias.
Un adecuado esquema de purificación viral permite no solamente separar a los virus de las partículas subcelulares sino que también concentrarlos. Primero se centrifuga, la suspensión viral a 1.500 x G para eliminar los contaminantes groseros, y el sobrenadante obtenido se centrifuga a alta velocidad, 100.000 x G para disminuir el volumen de la suspensión viral.
Es posible obtener preparaciones virales altamente purificadas utilizando las siguientes técnicas: centrifugación diferencial, que consiste en aplicar ciclos alternados de baja y alta velocidad, precipitación con sales (polietilenglicol, sulfato de amonio, fluorcarbonos halogenados), en que se separan por precipitación las proteínas virales de las proteínas contaminantes, y ultrafiltración a través de filtros con poros de tamaño menor a 0,10 μ.
Cuando se requiere un mayor grado de pureza se utiliza la centrifugación en gradiente y la isopícnica. En la centrifugación en gradiente zonal de sucrosa o glicerol, a 90.000 x G durante 1 a 3 horas, los virus se separan de las partículas contaminantes subcelulares como ribosomas o restos de membranas celulares, debido a que poseen coeficientes de sedimentación diferentes. En la centrifugación isopícnica en gradiente de una sal pesada como el cloruro de cesio, a 100.000 x G durante 14 horas, los virus se separan de los contaminantes subcelulares, que tienen un coeficiente de sedimentación similar, debido a que su densidad de flotación es diferente.
En la preparación de muestras para el diagnóstico viral, éstas se centrifugan entre 1.500 y 3.000 rpm durante 15 a 20 minutos para sedimentar los contaminantes más pesados, utilizándose el sobrenadante como inóculo viral. Para evitar las contaminaciones bacterianas el sobrenadante es pasado a través de filtros que retienen a las bacterias (filtros Seitz de 0,45 μ y Millipore de 0, 10 μ ), o se les agrega antibióticos.
