VIRUS Y CULTIVOS CELULARES. Patricio Berríos Etchegaray. 2019

VIRUS Y CULTIVOS CELULARES

Patricio Berríos Etchegaray

2019

El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales.

La implementación de los cultivos celulares hizo posible el desarrollo de la virología. El descubrimiento de los antibióticos permitió utilizar el cultivo celular “in vitro” como una técnica de laboratorio de rutina. Desde 1949 en que Enders descubrió que el virus de la poliomielitis podía multiplicarse en cultivos celulares casi todos los virus animales han sido propagados en cultivos celulares. Por otra parte, se acepta que cualquier tipo de células de mamíferos, capaces de dividirse “in vivo”, lo pueden hacer “in vitro”. 

En los inicios de la virología los virus se multiplicaban en animales susceptibles generalmente animales de laboratorio, y en huevos embrionados de gallina.  El amplio uso de los cultivos celulares en la propagación de virus animales ha permitido no depender de la utilización de animales de laboratorio para este fin.

Se conocen tres modalidades de cultivos celulares: cultivo de órganos, de tejidos y de células. Cultivo de órganos: Trozos pequeños menores de 1 cm de diámetro pueden mantenerse “in vitro” durante 7 a 14 días sin perder su estructura y función. Su aplicación más importante ha sido el cultivo de trozos de mucosa respiratoria para realizar estudios de histopatogénesis causados por virus respiratorios. En cultivos de tejidos se utilizan fragmentos de tejidos finamente picados y embebidos en plasma lo que les permite adherirse al vidrio de las botellas de cultivo.  En los cultivos celulares el tejido se disocia mecánicamente o mediante enzimas proteolíticas como la tripsina al 0,25%. Una vez contadas las células y suspendidas en un medio nutritivo adecuado se siembran en una concentración adecuada (100.000 células por 1 ml) en botellas, tubos o microplacas. Para multiplicarse “in vitro” las células necesitan un medio de cultivo adecuado que le proporcione los nutrientes necesarios para multiplicarse. Uno de los medios más utilizados es el medio Eagle esencial (MEM) que es básicamente una solución isotónica de sales, tamponado a un pH de 7,4, que contiene glucosa, vitaminas, coenzimas y aminoácidos. A los medios de cultivos de células es necesario agregarles antibióticos para impedir la infección bacteriana, y suero fetal bovino que contiene un factor de crecimiento.  En este medio y a una temperatura de 37° C las células se multiplican sobre la superficie del vidrio del continente formando monoestratos o monocapas de células visibles con un microscopio invertido.  Ejemplo: el virus herpes bovino 1 se mutiplica en células de riñón fetal bovino produciendo un típico efecto con destrucción de las células y la liberación de virus al medio de cultivo.

Considerando el número de divisiones que las células son capaces de realizar “in vitro” se describen tres tipos de cultivo: Cultivo celular primario en que las células solo se dividen en un número bajo, unas 20 a 30 veces, conocidos como pasajes o subcultivos. En los cultivos celulares secundarios las células pueden dividirse unas 100 veces. Las líneas celulares pueden dividirse potencialmente en forma indefinida debido a que han perdido la inhibición por contacto. Estas líneas se originan desde tumores o por mutaciones.  Ejemplos de líneas celulares son las células HeLa provenientes de un cáncer uterino, y las células MDBK (Madin-Darby bovine kidney).

Las células en un cultivo celular pueden presentar dos tipos de morfologías: Tipo fibroblasto que se originan desde tejidos conectivos y tienen forma de huso. Tipo epiteliales que se origina desde órganos glandulares y tienen forma poligonal.

El efecto que pueden causar los virus inoculados en cultivos celulares depende del tipo de virus y de la susceptibilidad de las células. Este efecto puede ser: efecto citopático (ECP) lítico y muerte celular debido a la detención de la síntesis de macromoléculas tales como ácidos nucleicos y proteínas celulares, a alteraciones de la permeabilidad de los lisosomas, a alteraciones de la membrana celular, inducción de aberraciones cromosómicas y desarrollo de cuerpos de inclusión que alteran la estructura y función de las células infectadas. En las infecciones no citolíticas no hay alteraciones morfológicas ni en la división celular. En la transformación celular ciertos virus oncogénicos, que no destruyen a las células infectadas, las transforman al integrar su genoma en el genoma celular, causando diversos efectos como la pérdida de la inhibición por contacto lo que las hace dividirse indefinidamente.

Mis experiencias con cultivos celulares

En 1973, en Davis University of California USA, me inicié en los cultivos celulares al estilo americano. La tecnóloga del Dr Delbert McKercher, Midori Ethel Wada que era Master of Science al pedirle ayuda para hacer cultivos celulares me dijo aquí los candidatos a doctores se hacen sus cositas solitos y me pasó un pequeño manual del laboratorio que contenía todos los pasos para realizar un cultivo celular. Empecé haciendo cultivos de riñón fetal caprino necesarios para propagar el nuevo virus herpes caprino motivo de mi tesis doctoral. Me costó, hasta que aprendí las mañas para hacer un buen cultivo celular. El virus herpes producía un nítido efecto citopático lo que facilitaba su observación. Solo tuve un problema cuando se me contaminaron los cultivos y no podía encontrar el origen de la contaminación. Le busqué por todos lados y los hongos contaminantes se mantenían, y yo estaba contra el tiempo… desesperado porque se me iba la tesis y el doctorado,  un día estaba absorto mirando la cámara de cultivos celulares y me fijé en un frasquito que estaba al fondo de la cámara, era un frasco de vidrio color café que contenía NaOH para alcalinizar los medios ácidos, y empecé a hablar conmigo mismo estarán lo hongos allí y mi mentalidad científica me decía que no, porque los hongos no crecen en ese pH tan alcalino, mi otro yo el discutidor cuestionaba la situación argumentando que los hongos crecen en cualquier parte. Lo sopesé y eliminé el hidróxido, preparé uno nuevo y lo esterilicé. ¡Y se fueron los hongos! Seguí con mi trabajo entregando el virus herpes clonado tres veces a su debido tiempo para ser inoculado en cabras gestantes lo que fue un éxito al producir aborto. La tesis doctoral fue aprobada en 1974 sin mayores problemas.

En 1976 empecé a hacer cultivos celulares en el laboratorio de virología de la Escuela de Medicina Veterinaria de la U de Chile. Necesitaba células de origen equino para estudiar virus respiratorios equinos especialmente el virus de la rinoneumonitis equina. Mi alumno de tesis era Víctor Riveros V. hombre versátil, buen clínico y bueno para el laboratorio. Pasó un mes sin conseguir que creciera una sola célula de riñón fetal equino. Probamos el medio de cultivo, el suero fetal, el agua  destilada y no se replicaban ante la paciencia de mi alumno de tesis. Tuve una inspiración y eliminé todo, absolutamente todo, y preparamos todos los medios de nuevo. Y las células crecieron. Era el agua destilada la mala.  De ahí en adelante todo bien dentro de la normalidad de los cultivos celulares. Fueron muchos mis alumnos tesistas que trabajaron las células con éxito. Incluso Francisco Cortes C.  en 1982 llegó más allá y por iniciativa propia hizo pasajes del riñón fetal equino hasta alcanzar un número mínimo que permitía considerarlas como una línea celular establecida la que fue estudiada en la tesis de Aldo Gaggero B. “Caracterización de una línea celular de crecimiento “in vitro” derivada de riñó fetal equino” 1984. La línea celular yo la denominé RFE-13.

Tuve éxito en hacer cultivos primarios de riñón fetal bovino, equino y caprino, los de porcino nunca me resultaron. Cultivos de células testiculares de caprino las utilicé en mi tesis doctoral.

Siempre amé a mis células, les hablaba y las trataba con una gran consideración como si fueran mujeres. No me fallaban. Estos cultivos eran exigentes, no sabían de feriados. El suero fetal había que ir a buscarlo al matadero Lo Valledor bien temprano en la mañana. Su filtración era demorosa, pero así se ahorraba porque el suero fetal de afuera era carísimo. Por cierto los riñones fetales había que ir a buscarlos al matadero. Un día me descresté en una escalera resbalosa y perdí unos buenos litros de suero fetal bovino. Otra vez casi choque en mi auto que resbaló en el petróleo que se había derramado en la carretera. Siempre pasaban cosas, recuerdo cuando un viejito me lavó con agua no limpia mis riñones, yo se lo agradecí por su buena intención y después los tuve que eliminar porque estaban contaminados. Hasta la política influyó en la mantención de las células, cuando había protestas contra Pinochet se cotaba la luz con los cadenazos contra los cables de la corriente, y se apagaban los congeladores causando la muerte de las células.

En realidad fue una verdadera odisea iniciar el cultivo celular en mi laboratorio de Virología, sin medios económicos, sin personal adecuado, y sin la comprensión de algunas autoridades universitarias que no entendían las dificultades que presentaba esta técnica. Recuerdo a un colega austríaco que nos visitó en 1976 y al ver mi laboratorio me dijo que así se trabajaba en los inicios de la virología, sin tener congeladores de -70° C necesarios para mantener a las células sin tener que hacer pasajes todas las semanas como estábamos obligados a hacerlo.

Actualmente la cosa es diferente, hay congeladores de -70° C., y Nitrógeno líquido para mantener las células, el suero fetal se importa al igual que los medios de cultivo. Hay cámaras de cultivo de alta complejidad.  Microplacas y pistolas ACCU-JETT llamadas auxiliares de pipetas, todo disponible en el mercado. Obviamente que para comprar estos artefactos hay que tener financiamiento con algún proyecto de investigación que lo considere.

Echo de menos a los cultivos celulares porque eran cosas vivas que requerían un cuidado extremado y mucho cariño. Actualmente aconsejo a mi señora, Damaris Vega P.  que trabaja con cultivos celulares de peces en la escuela de Medicina Veterinaria de la U. de Chile.