jueves, 2 de julio de 2015

AVANCES EN EL DESARROLLO DE VACUNAS FRENTE AL VIRUS DE LA LENGUA AZUL J. Ortego, E. Calvo-Pinilla, F. de la Poza y A. Marín-López 2015

Avances en el desarrollo de vacunas frente al virus de la lengua azul

Hasta la fecha se han descrito 26 serotipos de este virus, que no inducen protección cruzada tras la infección, lo que complica las estrategias de vacunación



Avances en el desarrollo de vacunas frente al virus de la lengua azul
En la actualidad, para prevenir y controlar los brotes de BTV se están usando vacunas inactivadas, cuya eficacia ha sido buena pero muestran una serie de inconvenientes. Por este motivo, se han ensayado varios prototipos de vacunas recombinantes basadas en vectores virales, con resultados prometedores.
Javier Ortego, Eva Calvo-Pinilla, Francisco de la Poza y Alejandro Marín-López

Centro de Investigación en Sanidad Animal (INIA-CISA)
La familia Reoviridae engloba un grupo de virus que comparten una serie de propiedades morfológicas y genéticas comunes: poseen genoma lineal de ARN de doble cadena (dsRNA) fragmentado en 10-12 segmentos genómicos, contienen dos o tres capas de proteínas concéntricas, carecen de una envuelta lipídica, presentan una estructura icosaédrica con un diámetro de 70 a 85 nm y se replican en el citoplasma de la célula infectada. Esta familia incluye virus de importancia clínica como los Rotavirus en humanos y los Orbivirus en animales. Entre los Orbivirus, el virus de la lengua azul (BTV) que infecta a rumiantes ha causado recientemente importantes brotes en Europa. Este virus produce la enfermedad de la lengua azul o fiebre catarral ovina, enfermedad infecciosa no contagiosa que se transmite por la mordedura de insectos del género Culicoides. Estos actúan como vectores competentes en la transmisión del virus. Los brotes de lengua azul han producido importantes pérdidas económicas debido a la enfermedad y muerte de los animales, a la pérdida de productividad, a las restricciones en el comercio y desplazamiento de los animales y al alto coste de las campañas de vigilancia y vacunación. Hasta la fecha se han descrito 26 serotipos de este virus, que no inducen protección cruzada tras la infección, lo que complica las estrategias de vacunación [5-7].

Estudio y caracterización de la infección en ratones

Los modelos animales de laboratorio son esenciales para el estudio de la biología de los virus animales y para el análisis de las vacunas desarrolladas frente a ellos, tanto para determinar su eficacia en prevenir la enfermedad como para comprobar la necesaria seguridad del tratamiento. Los estudios de BTV en hospedadores naturales están limitados por la complejidad del sistema, el alto coste del mantenimiento de animales grandes y la necesidad de un laboratorio de nivel de bioseguridad 3 para el desarrollo de estos ensayos. Durante años, diferentes grupos de investigación han tratado de establecer un modelo de animal de laboratorio para BTV con el fin de facilitar los estudios de patogénesis, respuesta inmunitaria y vacunación frente al virus. Los ratones adultos silvestres no son sensibles a la infección por BTV, por lo que no existe la posibilidad de desafiarlos frente al virus para determinar si una vacuna los protege. El BTV infecta a ratones neonatos y estos se han usado para analizar el nivel de atenuación de vacunas vivas, pero es necesario un modelo de ratón adulto para permitir el estudio de la respuesta inmunitaria adquirida en la vacunación frente a un virus.
Los ratones IFNAR(-/-) son ratones modificados genéticamente que carecen de la subunidad b del receptor de interferón tipo I (a/b). El bloqueo de la actividad INF-a/b permite que algunos virus repliquen más eficientemente y como consecuencia estos ratones son más sensibles a algunas infecciones virales. Aunque la respuesta de IFN-I está bloqueada en estos ratones, no tienen alterada su capacidad de generar una respuesta inmunitaria adquirida frente a un patógeno. Se ha descrito que estos animales pueden desarrollar niveles normales de anticuerpos neutralizantes y linfocitos T citotóxicos tras una vacunación con diferentes virus atenuados.

En busca de un nuevo modelo de animal pequeño de laboratorio para BTV, se pensó en analizar la infección y patogénesis del virus en los ratones IFNAR(-/-), puesto que los datos existentes sugerían que esta cepa de ratón podría ser susceptible a la infección por BTV.

En primer lugar, se observó que los ratones IFNAR(-/-) infectados con el serotipo 4 del BTV (BTV-4) mostraban signos clínicos de enfermedad que empezaban a las 48 horas posinfección y que consistían en letargia, postura encorvada, hipotermia y legañas típicas de conjuntivitis. Se comprobó que el virus infectaba eficientemente a los ratones IFNAR(-/-), produciéndose la muerte de todos los animales a los 5 o 6 días posinfección con una dosis de 103 ufp/ratón de BTV-4. Además, se detectó viremia en los ratones infectados con valores máximos de 5x104 ufp/ml. Todos estos datos indican que el BTV se replica y es patogénico en los ratones IFNAR(-/-), lo que sugiere que la inactivación de la respuesta innata que activa IFN-I, permite que la infección de BTV prolifere en estos animales. Por otra parte, se estudió también en estos ratones la infección de otros serotipos de BTV y se comprobó que la infección con BTV-8 y BTV-1 producía los mismos signos clínicos, viremia y lesiones descritos para la infección con BTV-4 [3].
Adicionalmente se concluyó que en las infecciones estudiadas con los distintos serotipos de BTV, el virus se diseminaba en los ratones IFNAR(-/-) reproduciéndose la infección que tiene lugar en rumiantes. Por ejemplo, en vacas infectadas con BTV se encuentran altos títulos de virus en los pulmones, nódulos linfáticos precapsular y mesentérico, timo y bazo. En los estudios de infección por vía intravenosa o subcutánea en ratones IFNAR(-/-), BTV se detectó principalmente en bazo, timo, nódulos linfáticos inguinal, mediastínico y poplíteo, y pulmones, coincidiendo que los órganos diana del virus en rumiantes (figura 1).

El análisis patológico de ratones infectados con BTV mostró muchas similitudes en cuanto a las lesiones descritas en hospedadores naturales. Los desórdenes de permeabilidad del sistema vascular presentes en rumiantes se reflejan en las petequias observadas en la superficie del bazo y los pulmones de ratones infectados con BTV. El engrosamiento de los nódulos linfáticos refleja el curso de la respuesta inmunitaria. Por otra parte, la depleción linfoide en órganos linfoides y el edema pulmonar también se han descrito en rumiantes. Las similitudes en la patología entre ratones IFNAR(-/-) y rumiantes infectados con BTV indican que este modelo de ratón puede ser una buena herramienta para estudiar determinados aspectos de la patología de BTV [2, 3].
El coste para analizar nuevas vacunas de BTV en sus especies naturales es el mayor obstáculo para los laboratorios e industrias. El modelo de ratón adulto IFNAR(-/-) es un buen modelo animal para evaluar las vacunas frente a BTV.

Generación de vacunas recombinantes y estrategias de inmunización combinadas

En la actualidad, para prevenir y controlar los brotes de BTV se están usando vacunas inactivadas, cuya eficacia ha sido buena pero muestran una serie de inconvenientes. En primer lugar, sólo son preventivas frente a un serotipo del virus. Es necesario un control muy riguroso de la calidad de cada lote de vacunas. Además, no son vacunas marcadoras y los animales vacunados no se pueden diferenciar serológicamente de los animales infectados. Estos problemas se solventarían con el uso de vacunas recombinantes marcadoras.

Se han ensayado varios prototipos de vacunas recombinantes basadas en poxvirus como vectores virales con resultados prometedores. Estas vacunas ofrecen una buena inmunogenicidad asociada a la replicación del virus que funciona como vector vacunal. Los virus vaccinia, capripox y canarypox que expresan juntas o por separado las proteínas de la cápsida de BTV VP2 (principal inductora de anticuerpos neutralizantes), VP5 y VP7, y las no estructurales NS1, NS2 y NS3 han inducido una buena respuesta inmunitaria, tanto humoral como celular, frente al antígeno de BTV usado en la vacunación; así como buenos niveles de protección frente a la infección con el virus de serotipo homólogo. Similares resultados se han obtenido utilizando como vacunas recombinantes estructuras que simulan la partícula viral (VLP) generadas en el sistema de expresión basado en baculovirus recombinantes, aunque tienen como desventaja su alto coste de producción e inestabilidad de las VLP.

En nuestro laboratorio se han generado vacunas frente a BTV basadas en la inmunización combinada heteróloga administrando los mismos antígenos de BTV primero como vacuna ADN y posteriormente usando el vector vacunal MVA (virus vaccinia cepa modificada Ankara). Ya que los ratones IFNAR(-/-) han sido usados eficazmente para validar la eficacia de vacunas inactivadas, también se han empleado para ensayar la eficacia de las vacunas recombinantes. La estrategia de vacunación ADN/MVA expresando las proteínas VP2, VP5 y VP7 de BTV-4 indujo una protección total frente a un desafío homólogo con BTV-4 pero no frente al desafío con el virus heterólogo BTV-8 [4]. Para la generación de vacunas que induzcan protección cruzada frente a los distintos serotipos de BTV se ha introducido la proteína NS1 de BTV en la composición vacunal. La proteína NS1 es la más conservada entre los 26 serotipos de BTV y se ha descrito que contiene en su secuencia aminoacídica epítopos que estimulan la respuesta inmunitaria celular frente al virus, al igual que las proteínas VP2 y VP7. La vacunación ADN/MVA expresando las proteínas VP2, VP7 y NS1 de BTV-4 generó altos niveles de anticuerpos específicos frente a estos tres antígenos, así como anticuerpos neutralizantes frente al virus homólogo BTV-4. Ensayos de Elispot y tinción intracelular de citoquinas mostraron que estos tres antígenos activaban una respuesta celular CD8+ en esplenocitos de ratones inmunizados (figura 2). Y lo más importante, esta estrategia de vacunación ADN/MVA expresando VP2, VP7 y NS1 de BTV-4 indujo una protección completa frente al virus homólogo BTV-4 y un grado muy alto de protección heteróloga, del 100 % frente a BTV-8 y del 85 % frente a BTV-1 (figura 3) [1].

En resumen, aunque será necesaria la caracterización de la estrategia y composición vacunal en el huésped natural del virus de la lengua azul, los resultados obtenidos en el modelo de ratón INFAR(-/-) sugieren que la estrategia de inmunización ADN/MVA expresando las proteínas VP2, VP7 y NS1 de BTV-4 podría ser una prometedora vacuna marcadora y segura frente a las infecciones de los múltiples serotipos de BTV.

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