AISLAMIENTO DEL VIRUS DE LA ENCEFALITIS VENEZOLANA DE UN MURCIELAGO FRUGIVORO (ARTIBEUS TURPIS) EN MEXICO l Dres. C. Wong-Chis* y W.F. Scherer

 AISLAMIENTO DEL VIRUS DE LA ENCEFALITIS VENEZOLANA DE UN MURCIELAGO FRUGIVORO (ARTIBEUS TURPIS) EN MEXICO 

C. Wong-Chis* y W.F. Scherer

Se aisló el virus de la encefalitis venezolana de las vísceras de un murciélago Artibeus turpis capturado en el sudeste de México. Los aislamientos de arbovirus procedentes de murciélagos, las características de las infecciones experimentales arbovíricas de estos animales y sus pautas naturales de conducta hacen que los murciélagos sean de importancia potencial, con respecto a algunas enfermedades producidas por arbovirus, como fuentes de virus para los mosquitos u otros artrópodos vectores. Introducción Existen numerosas pruebas de que los murciélagos influyen en el curso natural de diversas enfermedades víricas (1). Si se tienen en cuenta su intima relación con los mosquitos, y otros vertebrados, su distribución omnipresente, el concepto de portadores asintomáticos y el fenómeno de la hibernación en determinadas especies de murciélagos (21, se puede atribuir a estos animales importancia potencial en las enfermedades causadas por arbovirus. Una de estas, en las Américas, es la encefalitis venezolana (EV), producida por un virus que, según se ha demostrado experimentalmente, infecta a diversas especies de murciélagos insectívoros (3). En el presente artículo se describe el aislamiento del virus EV de los órganos de un murciélago Artibeus turpis, capturado en 1963 en Sontecomapan, Veracruz, en la costa tropical del este de México. ‘Estas investigaciones se realizaron en colaboración con la OPS y el Gobierno de México y contaron, en parte, con el apoyo de la subvención 5-Tl-AI-231 del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos y, en parte, con el contrato DA-49-193- MD-2295 del ejército de este país. *Jefe de la Sección de Virología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F. 3Profesor y Jefe del Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Comell, Nueva York, E.U.A. 339 

 Materiales y métodos Situación y captura de los murciélagos Los murciélagos fueron capturados de noche con redes invisibles japonesas, en un pequeño sector de selva tropical de unos 300 por 400 m aproximadamente, a 1.2 km al noroeste de Sontecomapan, aldea situada al nivel del mar, al sudoeste de Veracruz, México (4). Se extrajeron asépticamente trozos de tejido cardíaco, pulmonar y hepático de cada murciélago en un cercano laboratorio de campo y, después de reunidos y cerrados herméticamente en ampollas de vidrio, se almacenaron a-60°C en hielo seco hasta el momento de la prueba. Pruebas de los virus Se deshelaron los tejidos cardíacos, pulmonares y hepáticos y se maceraron en un mortero con el fin de preparar una suspensión al 10% en albúmina bovina, enfriada al 1% en solución de Hanks, que contenía 100 unidades de penicilina por ml y 100 pg de estreptomicina, también por ml. Después de centrifugado a 400 G durante 10 minutos a YC, se inoculó el líquido sobrenadante a camadas de ocho ratones de dos a tres días de edad, en cantidades de 0.01 ml por vía intracraneana (ic) y 0.02 ml por vía subcutánea (SC). Los ratones lactantes inoculados se mantuvieron con sus madres y se examinaron diariamente durante 14 días para descubrir los síntomas de enfermedad.  prob6 también el inóculo para determinar la esterilidad bacteriana en agar sangre y en caldo de soja con tripticasa. Se extrajeron asepticamente los cerebros y los músculos de las extremidades traseras de los ratones muertos o moribundos y se preparó una suspensión al 10 % que serviría de fuente subsiguiente de virus. Para la prueba en cultivos celulares en embrión de pollo (CEP), preparados en la forma antes descrita (51, se inoculó 0.1 ml de suspensión vírica en cada uno de los tres tubos de cultivo que se incubaron a 37OC. Se examinaron diariamente los cultivos y se reunieron y mantuvieron a-60°C los líquidos de cultivos celulares en los que se observaron pronunciados efectos citopáticos para que sirvieran de fuente subsiguiente de virus. Identificación inmunológica de los virus aislados Se identificó el agente vírico mediante las pruebas de fijación del complemento (FC) y neutralización. Se preparó un antígeno con cerebros de ratones moribundos inoculados con material del pase 2 desangrando a los animales y utilizando una suspensión al 20 % en 0.15 M NaCl. Después de conservada a 4OC durante la noche, se centrifugó la suspensión a 10,000 G por una hora, a SOC, y se introdujo el sobrenadante en ampollas, manteniéndolo a-60°C. Los antisueros eran de ratón o conejo inoculados con virus EV, cepa 63U2 (4), o procedían de una persona convaleciente que contrajo una infección de laboratorio con virus 63U2. Los sueros se calentaron a 60°C durante 20 minutos, efectuándose pruebas de fijación del complemento (4). La nueva identificación de virus comprendía una prueba de neutralización cualitativa en CEP de virus EV, cepa 63U2, utilizándose antisuero de conejo preparado con virus de ratón lactante en el pase 3 a una dilución de 1:20, frente a dos o tres diluciones de virus al céntuplo, como suspensión al lO%de cerebro y músculos de ratón. La neutralización positiva se mdicó mediante células normales de embrión de pollo en cultivos en tubo, con medio líquido inoculado con l-3 diluciones de virus y antisuero, y la total destrucción celular en cultivos inoculados con diluciones correspondientes de virus sin antisuero, después de 3 a 5 días, a 37oc. Resultados En la noche del 6 de agosto de 1963 se reunieron 6.5 especímenes de murciélagos capturados en la selva de Sontecomapan (cuadro 1). Se aisló una cepa de virus, la 63Y75, de una suspensión de 10 % de un conjunto de tejidos cardíacos, pulmonares y hepáticos tomados de un macho Artibeus turpis (cuadro 2). Se produjeron ocho defunciones al segundo día en la camada original de ocho ratones lactantes inoculados y en el material original se obtuvieron

 CUADRO 1 -Vísceras de murciélago obtenidas en la selva de Sontecomapan, Veracruz, México, el 6 de agosto de 1963, sometidas a prueba para determinar la presencia de arbovirus. Especie Carollia perspicillata Artibeus turpis Glossophaga soricina Otrosb Machos 19 9 3 2 Sexo Hembrasa 13(3) 8(I) 4 Desconocido 6 1 Total 32 23 7 3 Total a( ) número de hembras preñadas. bl macho Artibeus lituratus, 1 macho Artibeus jatnaicensis y 1 Vampiroides majar de sexo desconocido. Wong-Chiu y Scherer . ENCEFALITIS VENEZOLANA 341 títulos de 10-4.5 por 0.03 ml de tejido, cuando se inoculó en ratones lactantes por las vías ic y SC. Una suspensión al lO%, preparada con cerebro y músculo de ratón muerto y representativa del pase 1 en ratón lactante, produjo la muerte de un segundo grupo de ocho ratones lactantes en el primer día; otro grupo de 10 ratones lactantes murieron en el primer día, después de la inoculación del virus en el pase 2. En un antígeno fijador del complemento preparado con cerebros de ratón, después de los pases del virus en ratones, se obtuvo un título de 1: 16 frente a ocho unidades de EV, cepa 63U2, antisuero de ratón o suero convaleciente humano, pero el antígeno 63Y75 no reaccionó en una dilución de 1:4, con ocho unidades de anticuerpo de suero específico de ratón, con respecto al virus de Tlacotalpán, cepa 61D240 (6), o al virus Patois, cepa 63A49 (7). Se aisló de nuevo el virus satisfactoriamente de una suspensión de víscera original congelada, alrededor de siete semanas después del primer aislamiento (cuadro 2). La suspensión produjo la muerte a los nueve ratones lactantes de una camada en los días 1-3, y pases subsiguientes en ratones o cultivos celulares en embrión de pollo produjeron la muerte inmediata o efectos citopáticos. En un antígeno de FC, preparado con cerebros de ratón lactante con el virus aislado de nuevo, se obtuvo un título de 1: 16 frente a ocho unidades de suero EV de convaleciente humano, y el virus se neutralizó en CEP mediante una dilución de 1:20 de EV, cepa 63U2, de antisuero de conejo. Resumen La encefalitis venezolana (EV) se reconoció primeramente como enfermedad de los equinos (8), pero han ocurrido infecciones recientes de virus de EV en proporciones epidémicas en las poblaciones humanas (9), habiéndose aislado el virus de varios animales (1, 10). 

El presente informe de un aislamiento de virus EV procedente del murciélago frugívoro Artibeus turpis, en México, extiende la gama de huéspedes del virus EV. La validez del aislamiento fue corroborada por el hecho de que el antígeno 63Y75 fue el cuarto de una serie de siete especímenes, elaborados en el mismo cubículo en las primeras horas de una mañana; los otros seis especímenes, tres elaborados antes del 63Y75 y tres después resultaron negativos. No era probable la contaminación en el campo, porque sólo 

 CUADRO 2-Aislamiento y reaislamiento de virus EV, cepa 63Y75, de las vísceras de un murciélago macho Artibeus turpis. Fecha de la prueba Material Aislamiento 31 de enero de 1964 5 de febrero de 1964 ll de febrero de 1964 Reaislamiento 20 de marzo de 1964 24 de marzo de 1964 24 de marzo de 1964 Sistema utiiizadoc Mortalidad de ratones 0 razón entre CEP y ECPd Día de la muerte de ratones o ECPe CPHa RL-plb RL-P~~ RL RL RL CPH RLpl RL-p 1 RL RL CEP 8/8 2 818 1 lO/lO 1 919 l-3 ll/11 l-2 616 2 %Ionjunto de tejidos cardíacos, pulmonares y hepáticos de murciélago. bSuspensiÓn de cerebro y músculos de ratón lactante, pases 1 6 2. ‘RL=ratón lactante: CEP=cultivo celular en embrión de pollo. dECP=efecto citopático. eEl día de inoculación se consideró como el día 0. 

 uno de los 65 murciélagos capturados y prepa- can que los murciélagos pueden tener imporrados el 6 de agosto de 1963, con el fin de co- tancia potencial con respecto a algunas enferlocar las vísceras en ampollas sobre hielo seco, medades arbovíricas. En cuanto a su función, produjo un virus. Por lo tanto, este aislamiento podrían servir indudablemente como fuentes de virus EV, junto con los informes de otros de virus para los mosquitos vectores durante los aislamientos de arbovirus procedentes de mur- períodos de viremia, pero es preciso realizar esciélagos (II), las características de la infección tudios ulteriores para evaluar la excreción o seexperimental por arbovirus de estos animales creción de virus EV por los murciélagos y la po- (3, 12) y su frecuente proximidad natural a los sible propagación directa del virus al hombre o mosquitos, hombres y equinos vectores, indi- los equinos. 0

 REFERENCIAS (1) Sulkin, S.E. ‘“The bat as a reservoir of viruses in nature”. Progr Med Virol 4: 157-207, 1962. (2/ Sulkin, S.E., Allen, R., Sims, R. y Taylor, S.K. “Batsin relation to arthropod-borne viruses: An experimental approach with speculations”. AmerJPublHlth 55:1376-1385, 1965. (3) Corristan, E.C., La Motte, L.C. Jr. y Smith, D.G. “Susceptibility of bats to certain encephalitis virus.“Fed Proc 15:584, 1956. (4) Scherer, W.F. et al. “Venezuelan equine encephalitis virus in Veracruz, Mexico, and the use of hamsters as sentinels”. Science 1451274-275, 1964. (5) Scherer, W.F. “Inapparent vira1 infection of cells in vitro. I. Conversion of mapparent to apparent infection by environmental alteration of chicken embryonic cells m cultures inoculated with Japanese encephalitis virus”. Amer J Path 45:393-411, 1964. (61 Scherer, W.F. et al. “Isolation of Tlacotalpan virus, a new Bunyamwera-group virus from Mexican mosquitoes”. Amer J Trop Med Hyg 16:79-91, 1967. (7) Zarate, M.L., Geiger, R.H., Shope, R.E. y Scherer, W.F. “Intergroup antigenic relationships among arboviruses manifested by a Mexican strain of Patois virus and viruses of the Bunyamwera, C, California Capim and Guama groups”. Amer J Epid 88:273-286, 1968. (8) Kubes, V. “La peste loca de las bestias. Sus manifestaciones, tratamientos y prevención”. Min de Agr y Grfa de Venezuela, 1936. (9) Sellers, R.F., Bergold, G.H., Suárez, O.M. y Morales, A. “Investigations during the Venezuelan equine encephalitis outbreaks in Venezuela 1962-1964”. Amer J Trop Med Hyg 14:460-469, 1965. (10) Sidwell, R.W., Gebhart, L.P. y Thorpe, B.D. “Epidemiological aspects of Venezuelan equine encephalitis virus infections”. Bact Rev 31:65-81, 1967. (Il) Sulkin, S.E., Sims, R.A. y Allen, R. “Isolation of St. Louis encephalitis virus from bats&Czdarida b. mexicana) in Texas”. Science 152:223-225,1966. (1.2) Sulkin, S.E., Allen, R y Srms, R. “Studies of arthropod-borne vrrus infections m Chiroptera. 1. Susceptibility of insectivorous species to experimental infection with Japanese B and St. Louis encephahtis viruses”. Amer J Trop Med 12:800-814, 1963. Isolation of Venezuelan encephalitis (VE) virus from a frugivorous bat (Artibeus turpis) in Mexico (Summary) Venezuelan encephalitis was first recognized as a disease of equines (8) but recent VE virus infections have occurred in epidemic proportions in human populations (9), and the virus has been isolated from a number of animals (1, IU). 

This report of an isolation of VE virus from a frugivorous bat, Artibeus turpis, in Mexico extends the host range of VE virus. The validity of the isolation was substantiated by the fact that 63Y75 was the fourth of a series of seven specimens processed in the same cubicle early one morning; the other six specimens, three processed before and three after 63Y75, were negative. Contamination in the field was not likely to have occurred because only one of the group of 65 bats caught and processed on 6 August 1963 to put organs in ampules on dry ice yielded a virus. Wang-Chia y Sch& . ENCEFALITIS VENEZOLANA 343 Therefore, this isolation of VE virus, together arbovirus diseases. Their role could certainly be with reports of other arbovkus isolations from as sources of virus for vector mosquitoes during bats (II), the characteristics of experimental periods of viremia, but further studies are also arbovirus infection in these animals (3, I2), needed to evaluate excretion or secretion of and their frequent natural proximity to vector VE virus by bats and possible direct spread of mosquitoes, man and equmes, indicate that virus to man or equmes. bats may be of potential importance to some Isolamento do vík da encefalite venezuelana (EV) num morcêgo frugívoro (Artibeus turpis) no México (Resumo) A encefalite venezuelana foi identificada primeiramente como doenca dos equinos (8) mas têm ocorrido infeccóes recentes por virus de EV em proporcões epidêmicas nas populacões humanas (9), tendo-se isolado o virus de &ios animais (1, IU). 

A presente comunicacão do isolamento de virus EV procedente do morcêgo frugivoro Artibeus turpis, no MBxico, amplia a gama de hospedenos do virus EV. A validez do isolamento foi corroborada pelo fato de que o antfgeno 63Y75 foi o quarto de urna serie de sete espécimes, elaborados no mesmo cubículo, nas primeiras horas de urna manha; os outros seis espécimes, três elaborados antes do 63Y75 e três depois, derdm resultados negativos. Náo era provável a contaminacão no campo, porque apenas um dos 65 mor&gos capturados e preparados a 6 de agosto de 1963, com o fim de colocar as visceras em ampolas sobre gêlo seco, produziu um vírus. Portanto, êsse isolamento de vírus EV, com as comunicacöes de outros isolamentos de arbovírus procedentes de morcêgos (1 l), as características da infeccáo experimental por arbovírus dêsses animais (3, 12) e sua,freqüente proximidade natural aos mosquitos, homens e equinos vetores, indicam que os morcêgos podem ter importancia potencial com respeito a algumas doencas arbovíricas. Quanto å sua funcão, poderiam servir indubit%vehnente como fontes de virus para os mosquitos vetores durante os períodos de viremia, mas é preciso fazer novos estudos para avaliar a excrecão ou secrecão de vírus EV pelos morcêgos e a possível propagacão direta do virus ao homem ou aos equinos. Isolement du virus de l’encéphalite vénézuélienne (EV) d’une chauve-souris frugivore (Artibeus turpis) au Mexique (Résumé) L’encéphahte vénézuéhenne est surtout connue comme maladie des équins (8) mais récemment des infections du virus EV dans des proportions endémiques ont été enregistrées dans certaines populations humaines (9), le virus ayant Bté isolé dans plusieurs animaux (1, 10). Le présent rapport traite de l’isolement du virus EV provenant de la chauve-souris frugivore Artibeus turpis, au Mexique, ce qui étend encare la gamme des hôtes du virus EV. La validité de l’isolement a été corroborée par le fait que l’antig%ne 63Y75 est le quatrigme d’une série de spécimens, analysés dans la même éprouvette aux premiEres de la matinée. Sur les six autres spdcimens, trois ont bté analysés avant le 63Y75 et trois apr& et ont donné des résultats nhgatifs. Il n’est pas probable que la contamination ait lieu sur le terrain, car une seule des 65 chauves-souris capturées et préparées le 6 août 1963, afin de placer les vis&res dans des ampoules sur de la glace skhe a produit un vhus. En conséquence, l’isolement du virus EV, ainsi que les rapports sur les autres isolements d’arbovirus provenant de chauvesouris (Il), les caract&istiques de l’infection experimentale de ces animaux au moyen d’arbovirus (3, 12) et le fait que fréquemment ils soient naturellement pr&s des moustiques (II), des hommes et des équins vecteurs, indiquent que les chauves-souris peuvent avoir une importance potentielle par rapport I certaines maladies “arboviriques”. En ce qui concerne leur fonction, elles pourraient certainement servir de sources de virus pour les moustiques vecteurs durant les périodes de virémie, mais il convient de mener des études ultérieures pour évaluer I’excrétion ou la sécrétion du virus EV par les chauves-souris et l’éventuelle propagation directe du virus 2 l’homme ou aux équins.