miércoles, 21 de septiembre de 2016

DIARREA EPIDËMICA PORCINA Arguello H., P. de Novoa, P Rubio, A. Carvajal 2016

Diarrea epidémica porcina: nuevos desafíos de una vieja conocida

En lechones de menos de dos semanas morbilidad y mortalidad pueden alcanzar el 100 por ciento

Después de una década en la que los brotes de la enfermedad habían sido escasos en Europa, todas las alarmas han saltado a raíz del primer brote descrito en América. Esta revisión tiene por objetivo acercar al lector al estado actual de esta enfermedad dando respuesta a algunas de las preguntas que han surgido recientemente.

Héctor Arguello, Pedro J.G. de Nova, Pedro Rubio y Ana Carvajal
Email: arguello.rguez@gmail.com 
Artículo publicado en la revista Suis n.º 130, septiembre 2016. 

La diarrea epidémica porcina (PED por sus siglas en inglés) es una enfermedad intestinal altamente contagiosa del ganado porcino causada por un Coronavirus, el virus de la diarrea epidémica porcina o PEDV. El principal signo clínico es la aparición de una diarrea acuosa en cerdos de todas las edades, si bien el proceso es particularmente grave en los lechones de menos de dos semanas de vida, en los que tanto la morbilidad como la mortalidad pueden alcanzar el 100 %.
La entrada del PEDV en granjas previamente libres de esta infección provoca brotes epidémicos. En esta situación la morbilidad puede ser del 100 %, con independencia de la edad, observándose diarrea en todas las fases de la producción y pudiendo alcanzarse elevadas tasas de mortalidad en los lechones. Por el contrario, en las granjas que presentan una infección endémica por el PEDV los signos clínicos se observan principalmente en los cerdos destetados, cuando pierden la inmunidad maternal, así como en los animales de reposición que provienen de granjas libres de esta enfermedad.
El PEDV es un viejo conocido que ha vuelto a golpear con fuerza la producción porcina recientemente. Esta revisión tiene por objetivo acercar al lector al estado actual de esta enfermedad dando respuesta a algunas de las preguntas que han surgido recientemente debido al brote de PED en Norteamérica.
La diarrea epidémica porcina es una enfermedad intestinal altamente contagiosa del ganado porcino. (Foto: Anri Gor/shutterstock.com)

El nuevo mapa del PED en el mundo

En la Unión Europea (UE) el PED se describió en los años 70 en el Reino Unido y Bélgica por primera vez, siendo el PEDV o los anticuerpos dirigidos frente al mismo detectados en cerdos de los principales países productores europeos en las décadas de los 70 y los 80. Sin embargo, durante los años 90 la incidencia de los brotes de PED en Europa descendió paulatinamente y además los brotes descritos se asociaron a tasas de morbilidad y, particularmente, a tasas de mortalidad moderadas. Esta tendencia se mantuvo con el cambio de siglo y durante la primera década del siglo XXI el único brote destacable de PED en la UE se produjo en Italia, entre los años 2005 y 2006, con más de 60 granjas con infección confirmada y una tasa de mortalidad en lechones lactantes que osciló entre el 8 y el 34,5 %. Sin embargo, en los últimos 2-3 años se han reportado nuevos brotes de PED en países del entorno europeo como Alemania, Holanda, Francia, Bélgica o Ucrania, entre otros. En Alemania se ha reportado el caso de tres granjas infectadas, una de ellas con tasas de mortalidad en lechones que llegaron al 70 %. Es importante destacar que mediante análisis de laboratorio se ha comprobado que la cepa infectante en estas granjas no tiene homología con las cepas del PEDV circulantes en Europa en los años 70 y 80 (conocida como la CV777) y sí, por el contrario, con la variante de PEDV que asoló el norte de América, como explicaremos al final de este bloque.
Contrariamente a la situación que acabamos de describir en Europa, en Asia el PEDV se ha mantenido como uno de los principales agentes etiológicos de diarrea en las granjas de porcino desde hace más de 30 años. Las primeras descripciones correspondieron a China y Japón, en los años 80, y desde estos países el virus se difundió hacia otros: Corea, Filipinas y Tailandia en los 90 y Taiwán o Vietnam más recientemente, en 2007 y 2009, respectivamente. Entre los frecuentes brotes de PED ocurridos en Asia cabe destacar los que se produjeron en varias provincias del sur de China durante el año 2010, con tasas de mortalidad en lechones lactantes particularmente elevadas, de entre el 50 y el 90 %. Estos brotes especialmente graves de PED se extendieron por el resto de la región en los años siguientes, habiéndose sugerido que podrían estar asociados a una nueva cepa del PEDV particularmente virulenta.
Hasta el año 2013 no se había confirmado ningún caso de PED en el continente americano. En el mes de abril de ese año, el PEDV fue identificado por primera vez en EE. UU., en una granja del estado de Ohio. Un año después de haber sido identificado por primera vez en el país, el virus se había diseminado, afectando a más de 5.000 granjas de 25 estados así como a otros países del continente como México (julio de 2013), Perú (octubre de 2013) Canadá (enero de 2014), Colombia (marzo de 2014) o Ecuador (julio de 2014). El impacto asociado a la entrada y difusión del PEDV en la producción porcina de EE. UU. fue tremendo, con un coste económico durante el primer año estimado en 900-1.800 millones de dólares.
El principal signo clínico es la aparición de una diarrea acuosa en cerdos de todas las edades, con particular gravedad en lechones de menos de dos semanas de vida. (Foto: tratong/shutterstock.com)

El agente etiológico

El PEDV es un Coronavirus perteneciente a la familia Coronaviridae incluyéndose dentro de esta en el género Alphacoronavirus, donde también se encuadran otros coronavirus porcinos como el virus de la gastroenteritis transmisible (VGET) o el coronavirus respiratorio porcino (CVRP). Pese a que el PEDV y el VGET comparten numerosas características, incluida su clasificación cono Alphacoronavirus, sus mecanismos patogénicos o el cuadro clínico y lesional asociado a la infección, no existen reacciones cruzadas claras entre ambos; los ensayos de seroneutralización cruzada indican que los antisueros frente a cada uno de estos dos coronavirus no son capaces de neutralizar al virus heterólogo, y además hay importantes diferencias en las secuencias de los genes que codifican las principales proteínas estructurales, de modo que el diagnóstico diferencial en el laboratorio no plantea grandes retos.
Los coronavirus son virus con envuelta y con un aspecto externo similar a una corona. El PEDV posee cuatro proteínas estructurales. Tres de estas proteínas son proteínas de membrana, las identificadas como proteínas S, M y E, denominadas así por los términos en inglés spike (punta), membrane (membrana) y envelope (envoltura), anteriormente denominada sM o small membrane (membrana pequeña), respectivamente. La cuarta proteína estructural es la nucleocápside o proteína N, que encapsida el ARN monocatenario y de polaridad positiva que constituye el genoma del PEDV. De entre estas proteínas sin duda destaca por su importancia la proteína S por ser inductora de anticuerpos neutralizantes y responsable de la interacción con los receptores celulares de los enterocitos.
El PEDV se replica en el citoplasma de los enterocitos de las vellosidades del intestino delgado, causando un acortamiento de las mismas y una reducción de la capacidad de absorción y de la capacidad enzimática del intestino delgado que se traduce en una diarrea acuosa. La reposición más lenta de los enterocitos infectados en los lechones de pocos días de vida se ha señalado como posible causa de la mayor gravedad de esta infección en los animales más jóvenes en comparación con el resto. Aunque la infección se localiza principalmente en el intestino delgado, el virus también se ha podido localizar en el colon, aunque sin daño tisular aparente.

Las distintas cepas del PEDV

Uno de los aspectos de mayor debate en lo que respecta al PEDV, sobre todo después de los brotes particularmente virulentos ocurridos en Asia desde el año 2010 y de la emergencia del PED en EE. UU. en el año 2013, es si existen nuevas variantes de este virus con una virulencia superior a la de las cepas más clásicas del virus. Los estudios de filogenia han revelado que en el brote de PED ocurrido en EE. UU. han estado implicadas, al menos, dos cepas distintas del PEDV (figura 1) que se diferenciaban, particularmente, en la secuencia del extremo N-terminal del gen que codifica para la proteína S. Las cepas identificadas en los primeros casos se asociaron a elevadas tasas de morbilidad y mortalidad, mientras que en casos posteriores se identificaron aislados con inserciones y delecciones en esta región que se denominaron cepas INDEL o S-INDEL y que se asociaron a brotes con menor mortalidad entre los lechones afectados. En contraposición a estas cepas, a las primeras identificadas se las denominó como cepas NO-INDEL.
Hoy en día se acepta que existen dos genotipos del PEDV, identificados como genotipo 1, que correspondería a los aislados INDEL, y genotipo 2, con dos subgrupos en cada uno de ellos. Los virus que circularon por Europa y también por diferentes países de Asia antes del año 2010 se incluyen en el subgrupo a del genotipo 1 o genotipo G1a. Por el contrario, los virus detectados en los brotes más graves de PED en Asia con posterioridad al año 2010 así como en gran número de granjas en los EE. UU. pertenecen al genotipo 2, subgrupos 2a (restringido por el momento a Asia) y 2b. El subgrupo b del genotipo 1 o genotipo G1b incluye aislados INDEL de acuerdo a las características del gen que codifica para la proteína S y se ha propuesto que derivarían de la recombinación entre los aislados del PEDV más clásicos o aislados del genotipo 1a con aislados del genotipo 2b. Este genotipo G1b ha sido descrito tanto en Asia como en EE. UU. y en diferentes países europeos, mientras que el genotipo G2b ha sido detectado en Asia, EE. UU. y Ucrania.
En concreto, y dentro del ámbito europeo, podemos indicar que el predominio de las cepas INDEL o del genotipo 1 es claro. Los limitados aislados anteriores a 2013 de que se dispone se incluyen en el genotipo G1a mientras que los aislados más recientes, causantes de brotes posteriores a la emergencia del PEDV en el continente americano, son aislados del genotipo G1b con la única excepción puntual de un brote de PED descrito en Ucrania y causado por una cepa de PEDV con un 99,8 % de homología con la cepas NO-INDEL americana o genotipo G2b.
Figura 2. Acortamiento de las vellosidades en intestino delgado consecuencia de la infección por el virus.

La virulencia de las distintas cepas de PEDV

¿Existen diferencias en la virulencia de las diferentes cepas del PEDV? Esta es una de las cuestiones más relevantes en las investigaciones más recientes relativas a este coronavirus. En un estudio reciente de infección experimental en lechones se demostró que las cepas S-INDEL se asocian a una infección más leve o de menor virulencia, con un periodo de incubación más largo, un periodo de diarrea más corto, daño del intestino más focalizado y, en general, menor mortalidad (18 % frente al 55 % de los cerdos infectados) en comparación con los lechones desafiados con cepas NO-INDEL americanas. Sin embargo, es importante señalar que tanto las cepas S-INDEL como la cepa europea más clásica, cepa CV777, son también capaces de provocar cuadros diarreicos graves en las explotaciones, con mortalidades que pueden llegar al 75 % de los lechones lactantes en las dos primeras semanas de vida. Diversos autores puntualizan que tanto el peso vivo de los lechones al nacer como la salud de la cerda y la lactación son factores clave en la gravedad de los cuadros clínicos provocados por el PEDV. No debemos perder de vista tampoco la influencia que otros factores, como el manejo de la granja, el estatus sanitario e inmunitario de los cerdos o la presencia de coinfecciones pueden tener en la gravedad del PED. A este respecto, se ha descrito que la coinfección con otros virus como el delta coronavirus o el orthoreovirus 3 de mamíferos puede agravar los cuadros clínicos asociados al PEDV. El primero de estos virus se ha asociado con diarrea moderada en lechones mientras que el segundo con diarrea grave con mortalidad de hasta el 100 % de los animales infectados.
Figura 3. Enteritis de intestino delgado en lechón lactante.

El origen de la infección y la transmisión del virus

Al igual que en el resto de las infecciones gastrointestinales del ganado porcino, la principal ruta de transmisión del PEDV es la ruta fecal-oral, tanto directa como indirecta. Los cerdos infectados eliminan el virus en heces de forma continua durante los primeros 7-10 días (figura 4) aunque los trabajos más recientes y basados en el empleo de técnicas moleculares más sensibles para la detección indican que esta eliminación puede prolongarse, de forma intermitente, hasta las 36 semanas en algunos animales (figura 4). La combinación de la eliminación de altas concentraciones de virus en las heces por los animales enfermos con la baja dosis infectante facilita la transmisión del PEDV. Además el virus es estable a temperaturas bajas, pudiendo ser infectante en purines a 4 °C durante 28 días y en alimento durante 7 días a 25 °C. Cualquier fómite (equipamiento, botas, camiones, etc.) contaminado con heces infectadas es susceptible de participar en la transmisión del virus. Como hemos comentado anteriormente al hablar de las diversas cepas existentes, se ha demostrado una relación clara entre las cepas americanas y las cepas asiáticas, de forma que parece claro que el brote en Norteamérica se originó a partir de aislados del PEDV procedentes del continente asiático. La forma de entrada en EE. UU. se desconoce, aunque algunos trabajos proponen la participación de contenedores o sacos que se emplean para el traslado de determinadas primas como la vía más probable.
También llama la atención la gran velocidad con la que este virus se propagó por diversos estados de EE. UU., teniendo en cuenta las grandes distancias existentes. Este hecho ha suscitado debate y generado gran cantidad de hipótesis al respecto, tratando de buscar nuevas rutas de infección que pudiesen explicar la rápida difusión del virus. Una de las opciones planteadas desde el momento inicial fue la posibilidad de una transmisión aérea del virus. En este sentido, este y otros virus pueden viajar fácilmente distancias cortas en partículas de heces suspendidas en el aire, aunque los estudios que han tratado de reproducir experimentalmente la infección por el PEDV empleando esta vía de transmisión han fracasado. Otro posible mecanismo de transmisión implicaría la participación de vectores (roedores, aves e insectos) de forma mecánica, aunque por el momento nadie ha podido demostrar que estén involucrados en la misma. El PEDV se ha detectado tanto en semen como en leche de cerdas lactantes de animales infectados, aunque nuevamente no se ha conseguido demostrar que estos materiales puedan ser infectivos y además no se puede excluir la posibilidad de que la presencia del material genético (ARN) en estos fluidos sea consecuencia de su contaminación con heces. Finalmente, un posible origen de infección que ha suscitado un gran debate es el potencial riesgo de transmisión a través del plasma porcino deshidratado atomizado. Empleando técnicas moleculares, se detecta la presencia de ARN vírico en muestras de suero de cerdos infectados, discutiéndose sobre la posibilidad de existencia de una viremia más o menos relevante. Este hecho ha permitido teorizar sobre el riesgo que constituye el plasma que con frecuencia se emplea en la nutrición de lechones. En este sentido, las investigaciones realizadas concluyen que el proceso de atomizado y las condiciones de almacenamiento son suficientes para inactivar el virus en caso de que estuviera presente y viable en el plasma porcino. Tan solo en un experimento se ha logrado reproducir el cuadro clínico de PED en lechones alimentados con plasma porcino deshidratado positivo al PEDV por técnicas moleculares y ningún trabajo ha logrado reproducir el PED mediante la administración de pienso suplementado con plasma porcino deshidratado positivo. Finalmente, el hecho de que en determinados países como Brasil o regiones como el oeste de Canadá se hayan empleado en nutrición porcina toneladas de plasma porcino deshidratado atomizado positivas al PEDV sin que se haya producido ningún brote de esta enfermedad apuntan, nuevamente, a la seguridad de este componente de la dieta en lo que respecta a la transmisión del PEDV. Todo parece indicar que los movimientos de animales infectados y muy particularmente los fallos en los procedimientos de limpieza y desinfección de los vehículos de transporte han sido los factores más directamente implicados en la rápida diseminación del virus en las explotaciones porcinas de Norteamérica.

Avances en el diagnóstico

La gran importancia y el impacto de la epidemia de PED ocurrida en EE. UU. ha impulsado, de forma notable, el desarrollo de nuevas técnicas o de modificaciones de las técnicas de diagnóstico de PED más clásicas. Entre las técnicas de detección directa podemos señalar el aislamiento del virus en líneas celulares, la detección de proteínas o la detección del ARN empleando técnicas como la inmunofluorescencia y la inmunohistoquímica o la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de amplificación isotérmica, respectivamente. Además, existe un número limitado de técnicas indirectas para la detección de los anticuerpos (Ac) dirigidos frente al PEDV entre los que destacan la técnica ELISA (enzimoinmunoensayo), la inmunofluorescencia indirecta, los ensayos de inmunoperoxidasa en monocapa o la seroneutralización (figura 5).
Figura 5. La serología es una de las principales herramientas de diagnóstico. - Detección de Ag virus por ELISA en fases tempranas de la enfermedad. - Detección de Ac en el cerdo en fases de infección más tardías (a partir de las 2 semanas posinfección aproximadamente).
Dentro de los métodos de detección directa, sin duda la PCR se ha convertido en la técnica de elección por su sensibilidad, especificidad y rápida interpretación de los resultados. Se basa en la amplificación del material genético, en este caso de los genes codificantes para las proteínas estructurales N, S y M descritas anteriormente, existiendo dos modalidades, la PCR convencional y la PCR a tiempo real (rRT-PCR). En ambos casos debe existir una etapa previa de transcripción reversa. Otras ventajas asociadas a las técnicas de PCR incluyen la posibilidad de realizar un diagnóstico diferencial con otros virus como el delta coronavirus, el virus de la GET o rotavirus, en un mismo ensayo o el hecho de que se puedan diseñar técnicas de PCR que permitan la identificación del PEDV y la identificación de las distintas cepas del virus. La detección por PCR del virus se puede realizar en muestras de heces, hisopos rectales, fluidos orales o muestras de contenido intestinal o macerado de intestinos. También se ha empleado esta técnica para detectar el virus en muestras ambientales o de pienso en estudios epidemiológicos.
Otros métodos directos incluyen los ELISA para la detección de antígenos víricos que permiten la detección de proteínas del virus presentes en las heces o la inmunohistoquímica o la inmunofluorescencia para la detección del virus en tejidos, en los enterocitos de tramos de intestino afectados. Todas estas técnicas son de utilidad pero se han visto reemplazadas por la PCR, entre otros motivos por la mayor sensibilidad y por la rapidez y la sencillez de la técnica comparada con el resto de las indicadas.
Por lo que respecta a las técnicas de detección indirecta o técnicas serológicas para la detección de anticuerpos frente al virus en animales infectados, debemos indicar que existen desde los años 90 diversas técnicas ELISA, aunque en la mayoría de los casos son técnicas no comerciales. Entre estos ELISA existen diseños diferentes, con técnicas de ELISA indirecto o técnicas de ELISA de competición o de bloqueo. Pueden estar basados en antígenos completos del virus o en proteínas recombinantes del virus (N, S o M) y, por lo general, las sensibilidades y especificidades que se les asocian son elevadas. Las muestras sobre las que se pueden emplear estas técnicas de detección indirecta incluyen suero, leche, calostro, heces o fluidos orales y pueden estar dirigidas frente a inmunoglobulinas de diferentes subtipos, IgM, IgG o IgA.
La tabla 1 resume las técnicas de diagnóstico disponibles en la actualidad y su potencial utilidad para la detección de la PED.
Mientras que los métodos directos están dirigidos hacia la detección del virus en animales enfermos, los métodos indirectos o serológicos permiten determinar la exposición previa de los animales al patógeno. Este aspecto es muy importante, por ejemplo, para el control de la entrada de nuevos animales en la explotación, como es el caso de las cerdas de reposición, y son también una herramienta importante para la evaluación de la eficacia de nuevos candidatos vacunales. La figura 4 resume la cinética de la infección y los tiempos a los que es más útil emplear métodos directos (mientras hay eliminación de virus en heces) o indirectos (cuando la detección del virus ya no es factible) para chequear la enfermedad según el estado del animal.
El tratamiento y la profilaxis del PED
No existe un tratamiento específico para el PED, exceptuando un tratamiento sintomático en los cerdos enfermos. Debemos evitar la deshidratación de lechones lactantes por ser los más vulnerables mediante la aplicación de soluciones electrolíticas, la retirada de alimento seco durante un periodo de 12-24 horas con una reintroducción paulatina del mismo y la disponibilidad constante de agua. Nuestra experiencia personal en el manejo de brotes de PED indica que la utilización de antipiréticos como el paracetamol o de antiinflamatorios no esteroideos puede minimizar el impacto de la infección por el PEDV.
Aparte de este tratamiento sintomático, únicamente disponemos de la inmunoprofilaxis para proteger a los animales de nuestras granjas. En Asia y más recientemente en EE. UU. se han empleado diferentes diseños de vacunas, tanto vacunas vivas atenuadas como inactivadas, aplicándolas en las cerdas para conferir inmunidad pasiva a los lechones durante la lactación. Sin embargo, la protección conferida por estas vacunas es variable y no siempre son efectivas, por lo que su uso es motivo de controversia. Entre los factores que pueden influir en la eficacia de la inmunización se encuentra la vía de administración de la vacuna. En este sentido, un estudio reciente realizado en China concluye que la vacunación con una vacuna atenuada administrada por vía oral produce mayor concentración de IgA frente al PEDV en leche que la administración parenteral de la misma vacuna. Esto se traduce en una menor mortalidad de lechones en granjas infectados por PED. Algunos trabajos señalan que la cepa infectante también puede tener relación con la protección conferida por la vacuna, y en este sentido se cuestiona la protección conferida por vacunas basadas en cepas del genotipo 1 frente a infecciones por aislados del genotipo 2, aunque los trabajos experimentales indican que existe protección cruzada entre ambos genotipos. En cualquier caso, es importante conocer que en el entorno europeo nunca se han empleado vacunas para el control de esta infección y que, por el momento, no existen vacunas disponibles en la región, pudiendo llevarse a cabo la estimulación del sistema inmunitario de las cerdas mediante su exposición empírica al contenido intestinal o las heces de lechones afectados.
Finalmente, la prevención de la infección por el PEDV en una granja, una región o un país debe estar basada en unas adecuadas estrategias de vigilancia y de diagnóstico precoz que se focalicen en los principales riesgos potenciales de la entrada del virus como entrada y/o importación de animales o la de vehículos. En este sentido, es esencial asegurar una adecuada bioseguridad externa de las granjas que incluye el control estricto del acceso de vehículos, de las visitas y de la reposición externa.

Bibliografía

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