lunes, 27 de febrero de 2012

VACUNAS VETERINARIAS: retos, expectativas y riesgos. Siomara Martínez, Miriam Pedroso Reyes, Belkis Corona González

Retos, expectativas y riesgos de las vacunas veterinarias

  1. Inmunidad a Bacterias extracelulares
  2. Inmunidad contra los virus
  3. Inmunidad a parásitos
  4. Evasión de la inmunidad
  5. Alteración de la señalización de las citoquinas
  6. Desarrollo de vacunas de nueva generación
  7. Vacunas de DNA
  8. Vacunas verdes
  9. Vaccinología inversa
  10. Adyuvantes para las Vacunas Mucosales
  11. ¿Qué son los motivos CpG?
  12. Efectos adversos y Riesgos Potenciales de los Adyuvantes
  13. Análisis de riesgo en la producción de vacunas veterinarias como parte de las medidas de Bioseguridad
  14. Vacunas vivas convencionales
  15. Programas de seguridad
  16. Otras consideraciones
  17. A manera de conclusiones
  18. Bibliografia
  19. Glosario

Resumen

Las vacunas veterinarias continúan siendo una vía sostenible y económica que ha demostrado su efectividad a través de los años en el control de las enfermedades infecciosas. En la la problemática existente en cuanto a la multiresistencia de muchas bacterias a los antibióticos, así como la residualidad delos mismos en alimentos de origen animal ha reafirmado la importancia de las vacunas. El desarrollo y surgimiento de diferentes tecnologías como la Ingeniería Genética, la Biología Molecular y la revolución ocurrida en el conocimiento de la respuesta inmune, ha posibilitado el surgimiento de nuevas generaciones de vacunas de mayor potencia y conceptos en la presentación de los antígenos al sistema inmune. Estas nuevas generaciones de vacunas han generado nuevas medidas en la Bioseguridad de dichos biológicos. En el presente artículo reseña se presenta un análisis de las principales tendencias en el desarrollo e investigaciones en la vaccinología veterinaria, así como sus riesgos y expectativas en el uso de este de productos.

Introducción

  1. La vacunación continua siendo una de las vías más sostenibles y utilizadas en el control de enfermedades infectocontagiosas en medicina veterinaria, dado por su mayor factibilidad económica y por el problema que representa la residualidad de los antibióticos en productos animales de consumo humano como leche, y huevos.
    Una vacuna ideal es relativamente fácil de definir, pero pocas vacunas lo logran, incluso existen microorganismos para los cuales no hay vacunas. Se puede plantear que son muchos y diversos los retos que deben vencerse para lograr vacunas adecuadas.
    Tradicionalmente, las estrategias de vacunación ayudaron a erradicar y controlar epidemias en , sin embargo las vacunas utilizadas (vacunas inactivadas y atenuadas) tenían desventajas como los peligros de inactivación incompleta y reversión de la patogenicidad que producían casos clínicos de las enfermedades después de las vacunaciones.
    A pesar del uso y el desarrollo de las vacunas tradicionales ha surgido la necesidad de la obtención de nuevas vacunas , lo que esta motivado por diferentes causas como: todos los microorganismos desarrollan mecanismos de evasión que interfieren con la respuesta inmune y no en todos esta que mecanismos inmunes son verdaderamente eficientes, la evolución rápida de los microorganismos, el surgimiento de nuevas variantes patógenas más virulentas y resistentes a drogas, la reemergencia de enfermedades infecciosas a nivel mundial, la aparición del VIH que marca una pauta en las investigaciones vaccinológicas e inmunológicas y el conocimiento de la etiología infecciosa para otras enfermedades donde hasta ahora no se había reconocido la participación de microorganismos, este reconocimiento ha sido posible por el aporte que los estudios moleculares brindaron al esclarecimiento de la etiopatogenía de las mismas.
    Los avances tecnológicos de las últimas décadas que incluyen la manipulación genética , las técnicas de ADN recombinante, los nuevos métodos de atenuación de patógenos , los avances en inmunología particularmente en lo referido a la presentación antigénica y procesamiento de antígenos que ha permitido dirigir las vacunas hacia la búsqueda de repuestas inmunes más especificas así como la utilización de nuevos adyuvantes , ha servido de base fundamental para las llamadas vacunas de nueva generación. A diferencia de las vacunas tradicionales, las nuevas vacunas explotan el conocimiento íntimo de la estructura molecular de los patógenos así como una mayor comprensión del mecanismo de inmunidad hacia ellos.
    Basado en esto se han desarrollado nuevos adyuvantes, vectores y formulaciones vacunales que permiten una mejor orientación de la respuesta lo que nos hace prever un futuro mas alentador con relación a la posibilidad de obtener vacunas mas eficientes.

    Inmunidad

  2. Inmunidad a microbios
Es por todos aceptado que una de las funciones del sistema inmune es la protección contra los agentes infecciosos. El sistema inmune de los vertebrados posee mecanismos altamente específicos para detectar, destruir y eliminar agentes extraños. Las armas específicas del sistema inmune cambian extremadamente rápido en respuesta a la aparición de nuevos estímulos, mientras que las inespecíficas son relativamente constantes.
La evolución de una enfermedad infecciosa en un individuo involucra una secuencia de interacciones entre el microbio y el hospedero dentro de las que se encuentra por un lado invasión, desarrollo y colonización del mismo por parte del microorganismo y la fuerte presión que ejercen los mecanismos de la respuesta inmune por otro. El conocimiento de las características esenciales de la inmunidad hacia los diferentes microorganismos es esencial en la estrategia de obtención de una vacuna. La resultante de esta interacción nos dará enfermedad en mayor o menor medida o resistencia. En este sentido como consecuencia de la presión ejercida por el sistema inmune los microorganismos han desarrollado diferentes mecanismos de evasión de la inmunidad.
Por otra parte, los microorganismos poseen atributos que son detectados por el hospedero que pueden sentar las para la estimulación deseada de la respuesta inmune. Un ejemplo de esto lo constituyen los motivos CpG. En la misma medida factores propios de la respuesta del hospedero hacia los microorganismos como las citoquinas pueden ser adecuadamente empleados como elementos estimulantes de la inmunidad. De aquí que se considere la interacción microorganismo-hospedero un elemento clave en la estrategia de obtención de vacunas (tanto la respuesta del hospedero al desafío que representa la infección, como la respuesta del microorganismo a la respuesta inmune).
Características generales de la inmunidad a microbios:
  • Los mecanismos de defensa contra los microbios están mediados por la inmunidad natural y la adquirida.
  • Diferentes microbios estimulan diferentes mecanismos efectores de la respuesta inmune
  • La sobrevivencia y patogenicidad de los microbios en el hospedero esta influenciada de forma crítica por la habilidad de los primeros para evadir el sistema inmune de los segundos.
  • La injuria tisular y la enfermedad pueden ser causadas por la respuesta del hospedero más que por el propio microorganismo.
Uno de los más trascendentales descubrimientos de la inmunología ha sido el esclarecimiento de elementos básicos de la respuesta inmune como son los patrones de citoquinas inducidos como consecuencia de la estimulación de las células T. Se definieron dos tipos de clones de células T CD4+ o (T helper) y las subpoblaciones T helper 1(Th1) y T helper 2 (Th2). La respuesta Th1 (asociado a Inmunidad a mediación celular) incluye: IL2, IFN, y Th2 (asociado a inmunidad humoral) incluye IL4, IL5, IL9, IL10, IL13. Ambos clones secretan IL3 y el TNF (26).
Estos patrones se han identificado con similares características para las especies veterinarias.
Las evidencias de la polarización de la respuesta TCD4+ son abundantes. De forma muy general se plantea que la respuesta Th1 se desarrolla preferencialmente en las infecciones con bacterias intracelulares y virus y la Th2 en las infecciones helmínticas y bacterias extracelulares.
Se hace necesaria una visión general de los mecanismos de la inmunidad natural y especifica contra el tipo de microorganismo en particular como punto de partida para este análisis.


Inmunidad a Bacterias extracelulares

Las bacterias extracelulares son capaces de replicarse fuera de los tejidos, en la circulación, en los espacios extracelulares de los tejidos conectivos y en varios espacios tisulares como las vías aéreas y la luz intestinal. Ejemplo: cocos Gram + como Staphylococcus, Streptococcus, Gram - meningococos y gonococos, incluyendo microorganismos entéricos como Escherichia coli.
Estos microorganismos causan enfermedad por dos mecanismos principales: Primero inducen inflamación que provoca destrucción tisular en el sitio de la lesión, ejemplo: Cocos piogénicos son responsables de infecciones supurativas. Segundo muchas bacterias inducen toxinas con diversos efectos patológicos algunas son endotoxinas que son generalmente componentes de la pared celular y otros exotoxinas que son activamente secretados por la bacteria. La endotoxina de las bacterias Gram - también llamada lipopolisacarido (LPS) es un potente estimulador de la secreción de citoquinas y un activador policlonal de las células B.
Inmunidad a bacterias extracelulares
Inmunidad natural
Los microbios extracelulares son rápidamente matados por los mecanismos microbicidas de los fagocitos. Un mecanismo fundamental de inmunidad natural es la fagocitosis realizada por neutrófilos, monocitos, y macrófagos tisulares. Otro elemento es la activación del complemento ej. peptidoglican de la pared celular promueve la formación de la Componente 3 del Complemento ( C3) convertasa de la vía alterna del complemento . El LPS de los Gram - puede activar la vía alterna o incluso unirse al Componente 1 del Complemento q (C1q) y activar la vía clásica del Complemento.
Las endotoxinas como el LPS activan la secreción de citoquinas por los macrófagos y estimulan la clásica cascada de citoquinas de la inflamación TNF, IL1, IL6, IL8 ,todos estos mediadores estimulan la inflamación y la activación de los linfocitos específicos para los microbios, así como todos los mecanismos de adhesión al endotelio vascular y la diapédesis , lo cual sirve para eliminar a las bacterias aunque también injurian a los tejidos vecinos como efecto colateral de esos mecanismos de defensa . Esas citoquinas inducen proteínas de fase aguda, fiebre y amplifican la respuesta T y B. Si grandes cantidades de estas citoquinas se producen se obtienen efectos dañinos y son responsables de las manifestaciones clínico-patológicas del schok séptico o schok endotóxico presentando la coagulación intravascular progresiva y el colapso vascular.
Inmunidad específica
La inmunidad humoral es el principal mecanismo protector específico contra las bacterias extracelulares.
Algunos de los componentes inmunogénicos de la pared celular y la cápsula son polisacaridos que constituyen el prototipo de los antígenos Timo independiente que estimulan directamente las células B y provocan fuerte respuesta de IgM.
Otras Igs se producen probablemente como consecuencia de la producción de citoquinas que promueven el "switch" de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas.
Las IgG y las IgM tienen tres tipos de mecanismos efectores:
Opsonizan bacterias, aumentan la fagocitosis por la unión al receptor Fc sobre monocitos, macrófagos y neutrófilos.
Tanto IgG como IgM activan el complemento por unión con el C 3 del complemento
Las deficiencias de C3 provocan alta susceptibilidad a infecciones piógenas.
Tanto IgG como IgM neutralizan toxinas. Las IgA secretoras neutralizan las toxinas a nivel intestinal.
Respuesta T
La principal respuesta T es la T CD4+ en respuesta a los antígenos que se presentan asociados con el MHC II. Los microbios extracelulares son procesados por las células presentadoras de antígenos y presentados a los TCD4+.
Inmunidad natural a Bacterias intracelulares.
Uno de los principales mecanismos de defensa contra las bacterias intracelulares es la fagocitosis.
Aunque los parásitos intracelulares obligados son relativamente resistentes a la degradación de las células del sistema mononuclear fagocítico. Por lo que habitualmente la inmunidad natural es inefectiva en controlar este tipo de microorganismos.
Inmunidad específica a Bacterias intracelulares
La principal respuesta protectora a las bacterias intracelulares es la inmunidad a mediación celular.
Esta forma de inmunidad se trasmite a individuos no inmunes por medio de las células linfoides, pero no por el suero siendo este uno de sus rasgos distintivos.
Como es conocido en la inmunidad mediada por células las células T son fundamentales, pero no son las únicas que participan ya que en el mecanismo efector de la misma participan además de los linfocitos T, los macrófagos activados por los linfocitos T por medio del IFN , la respuesta inmune a las bacterias intracelulares es análoga a la Hipersensibilidad retardada DTH. Los antigenos de las bacterias intracelulares provocan una fuerte respuesta T. Muchos de estos microbios contienen una pared celular cuyos constituyentes activan macrófagos directamente y funcionan como adyuvantes. Un ejemplo es el Muramyl dipeptido presente en la pared celular de las micobacterias. En este caso tanto los linfocitos TCD4+, TCD8+ participan en los mecanismos protectivos. Uno de los mecanismos protectivos de estas células es la producción de IFN . La acción del IFN es activar los macrófagos en su función degradativa, y reducir o erradicar las bacterias viables, no obstante, las bacterias intracelulares son capaces de resistir esta acción y persistir en el sitio afectado del organismo por largos períodos, incluso en individuos con inmunidad celular efectiva . Esta situación conduce a la acumulación de macrófagos activados formándose granulomas que rodean al microorganismo e impiden su diseminación.
El sello característico de estas infecciones desde el punto de vista histológico es la inflamación granulomatosa. Así la respuesta del hospedero es la principal causa de injuria tisular.
La primera exposición a Mycobacterium tuberculosis induce una inflamación local y la bacteria prolifera en el fagocito. Simultáneamente se desarrolla inmunidad tipo T especifica. Después que la inmunidad se ha desarrollado ocurren severas reacciones granulomatosas en el sitio de persistencia del microorganismo.
Recientemente se ha demostrado que los micobacterias activan las células T . Los ratones infectados con micobacterias presentan incrementado el número de linfocitos T en los nódulos linfáticos.

Inmunidad contra los virus:

Inmunidad natural
Los mecanismos de la inmunidad natural contra los virus incluyen:
  • Las células NK y los Interferones
  • Células NK
Las células NK tienen la capacidad de matar células tumorales y células infectadas por virus. A diferencia de las células T no presentan el receptor para el antígeno, y no requieren la presencia del Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el proceso de reconocimiento del antígeno. Surgen tempranamente en el curso de la infección antes que los linfocitos T y la respuesta anticuerpo.
Los Interferones.
Otro de los mecanismos de defensa inespecíficos contra los virus son los Interferones: IFN leucocitario, IFN de los fibroblastos, e IFN derivado tanto de los linfocitos T CD4+ y TCD8+.
Una de las principales habilidades de los Interferones es su capacidad de establecer un estado antiviral en la célula. Estas citocinas ejercen su actividad por la interacción con los receptores celulares para cada tipo de interferon como consecuencia de esta interacción se produce la señal de activación de la vía.
Ambos tipos de IFN los y los establecen el estado antiviral por la inducción de dos enzimas bien caracterizadas:
-la proteína -kinasa dependiente del RNA de doble cadena que fosforila al factor de iniciación eucariótica eIF2 provocando la inhibición de la síntesis de proteína y la 2´5¨oligoadenilato sintetasa (2´5¨OS) que cataliza la formación de 2´5´oligoadenilato que activa a la ribonucleasa L a degradar RNA
Además de esta función los interferones son moduladores de la respuesta inmune: Expresión del MHC I El Interferon / y el MHC I y II el IFN, estimulan la activación de macrófagos y células NK, la proliferación de células B, e incrementan la expresión de receptores de alta afinidad para el Fc de las IgG sobre algunas células y de los receptores de IL2 sobre las células T
Inmunidad especifica a los virus
Los componentes de la inmunidad antiviral específica son la respuesta anticuerpo y la actividad de los linfocitos T
Los anticuerpos.
Los anticuerpos pueden neutralizar un virus in vivo por bloqueo de la adhesión del virión al receptor celular, por opsonización , lisis de la célula infectadada por la acción de células asesinas ( ADCC, citoxicidad -dependiente de anticuerpos) o por el complemento. Sin embargo por regla general los anticuerpos protegen contra los virus solo en etapas tempranas de la infección viral y resulta difícil trasmitir una inmunidad protectora antiviral.por medio de los anticuerpos.
Los linfocitos T.
Los linfocitos T están divididos en linfocitos Th (Thelper ) CD4+ y los CTL (Linfocitos T citotóxicos) CD8+. Los CTL son los linfocitos T específicos que poseen la capacidad de matar las células infectadas por el virus, las células Th CD4+ son las responsables de la secreción de citoquinas que activan tanto a los CTL, como a las células no específicas en la inmunidad antiviral céluals NK y macrófagos.
A diferencia de los anticuerpos que reconocen las proteínas virales intactas, las células T reconocen cortos fragmentos producidos por la degradación de la proteína en la fase de procesamiento antigénico en el citosol. Constituyen fragmentos peptídicos de 9 a 12 aminoacidos asociados con la molécula del MHC solo este complejo péptido –MHC es reconocido por el receptor TCR de la célulaT por lo que se habla de la restricción MHC. Solo los péptidos asociados al MHC serán reconocidos por la célula T, tanto la Th (Thelper) CD4+, como los CTL – CD8+
El proceso de presentación antigénica comienza en el citosol donde la proteína es degradada en el proteasoma en péptidos pequeños. Los péptidos son transportados al retículo endoplásmico por transportadores asociados con el antígeno procesado TAP. Este transportador es preferencial para péptidos de talla adecuada y apropiado C terminal y así unirlos al MHC de cada especie. El complejo péptido-MHC abandona el retículo endoplásmico, atraviesa el Golgi y arriba a la superficie celular del linfocito T donde interactúa con el TCR y la molécula CD8 de CTL.

Inmunidad natural a parásitos.

Un rasgo distintivo de las infecciones parasitarias es su cronicidad para esto hay muchas razones podemos señalar entre otras. Una de ellas es la complejidad del ciclo de vida de los mismos en los que existen hospederos de varias especies, la débil inmunidad natural que ellos desarrollan y otra es la gran capacidad de los parásitos para evadir o resistir el ataque del sistema inmune. No obstante la actividad del complemento por la vía alterna es un elemento que en ocasiones contribuye en la eliminación de los mismos
Inmunidad específica a parásitos.
La producción de IgE y eosinofilia es una respuesta observada con frecuencia en las infecciones parasíticas. En experimentos in vitro se ha observado citoxicidad dependiente de anticuerpos con IgE específica la que se une a la superficie del helminto, esta molécula de IgE se une a los eosinófilos por el receptor para el Fc que presentan estas células y el eosinófilo activado secreta el contenido de los gránulos del citoplasma de estás células que lisan el parásito. La respuesta granulomatosa es otro mecanismo desarrollado para impedir la diseminación de la infección, sin embargo esta respuesta no es eficiente por ejemplo en la Schistosomiasis la formación del granuloma conduce a una fibrosis severa asociada a con una disrupción de los vasos venosos en el hígado, hipertensión portal y cirrosis.
Las citoquinas son otro elemento que también esta implicado en la resistencia específica a los parásitos. Las células TH2 producen IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Ëstas citoquinas actúan como colaboradoras en la activación de las células B, y son más apropiadas para responder a helmintos. También están implicadas en reacciones alérgicas (ya que la IL-4 activa la producción de IgE y la IL-5 activa a los eosinófilos.
La tabla 1 resume los elementos esenciales de la inmunidad a los microbios
  • Tabla 1. Inmunidad a microbios
  • Agente
  • Inmunidad natural
  • Inmunidad específica
  • Bacterias intracelulares obligadas
Fagocitosis es inefectiva
Inmunidad celular
  • Bacterias extracelulares
Fagocitosis
Inmunidad humoral
Virus
  • Actividad NK,
Interferón  
  • Actividad del Complemento.
Combina humoral y celular
  • Humoral útil en etapas tempranas
  • Difícil transferir inmunidad sérica
  • La capacidad neutralizante in vitro no se relaciona con la in vivo.
  • Generalmente insuficiente Principal mecanismo: A mediación celular!
  • Actividad CTL
Parásitos
Generalmente ineficiente
Inmunidad humoral en algunos casos y/o a mediación celular en dependencia del parásito

Evasión de la inmunidad:

La evasión de la inmunidad es un mecanismo desarrollado por todos los microorganismos y ocurre como resultado de la presión que el sistema inmune ejerce sobre la biología de los microorganismos en la interrelación huésped-parásito con la consecuente ocurrencia o no de la enfermedad. En esta revisión se mostraran algunos ejemplos de evasión desarrollados por los virus como una evidencia del relativo valor de la inmunidad en el combate contra las infecciones y de la necesidad de conocer mejor estas estrategias de evasión al diseñar medidas de control y/o erradicación de las enfermedades infecciosas.
Evasión de las bacterias extracelulares
Los mecanismos de virulencia de las bacterias extracelulares están íntimamente relacionados a los factores que favorecen la invasión y diseminación de los tejidos.
Esto se ve favorecido por determinadas proteínas de superficie, mecanismos antifagocíticos e inhibición o inactivación del complemento. Las bacterias Gram- contienen uno o más residuos de ácido siálico que inhiben al complemento por la vía alterna.
Otro mecanismo es la variación de los antígenos de superficie. Los antígenos de superficie de muchas bacterias están contenidos en pili que son estructuras involucradas en los mecanismos de adhesión a las células del hospedero. El principal antígeno de los pili es una proteína de 35 kd llamada pilin. Los genes del pilin del gonococo los que varían y permite a la bacteria a escapar del ataque de los anticuerpos específicos.
Evasión de las bacterias intracelulares.
Como se ha señalado la fagocitosis es uno de los mecanismos que se desarrolla en respuesta a la infección por micobacterias sin embargo, las micobacterias inhiben la fusión fago-lisosoma e Interfieren también con el funcionamiento de los lisosomas. Listeria monocytogenes produce una hemolisina que forma poros en la membrana del fagosoma, lo que libera la bacteria en el citoplasma e impide su degradación en el fagolisosoma.
Evasión viral
La estrategia desarrollada por los virus para evadir el sistema inmune es variada se puede señalar: la variación antigénica, inhibición de la actividad del complemento, interferencia con la función anticuerpo. , la homología con citoquinas, e interferencia con la función de las citoquinas, con la inmunidad a mediación celular y/o con el MHC clase I, inhibición de la apoptosis. La latencia es otro mecanismo desarrollado, que minimiza la posibilidad de reconocimiento inmune.
Variación antigénica.
Como ejemplo de variación antigénica se puede señalar: Anemia infecciosa equina y Fiebre aftosa, la variabilidad antigénica en Fiebre aftosa constituye un obstáculo para la obtención de vacunas exitosas tanto convencionales como sintéticas.
Los herpes virus codifican proteínas que rompen varias de las etapas de activación del complemento. Ellos codifican una glicoproteína de envoltura llamada gC como una defensa viral contra la activación del complemento. La gC se une a C3 y derivados de este como C3b, lo que está descrito para HSV-1 y 2, PRV, HVB -1 y HVE-1. Con la utilización de virus recombinante se ha estudiado la protección proporcionada por gC contra la neutralización del complemento y se ha demostrado para HSV-1 y 2. La protección ocurre en presencia tanto de HSV inmune y no inmune indicando que gC actúa tanto contra la activación del complemento innata como la activa. El componente gC se ha encontrado durante la unión inicial del virión para la mayoría de los alfaherpesvirus estudiados con la excepción de los HSV- 2.
Interferencia con la función anticuerpo.
Se ha reportado que un grupo de los herpesvirus inducen una actividad de unión al receptor Fc, aunque los genes virales responsables de esta actividad se han identificado solo en pocos casos. El ejemplo mejor estudiado ha sido el del virus Herpes simplex 1 en el cual están incluídos un complejo de dos glicoproteínas virales, gE y gI. La expresión de gE sola provoca una unión de baja afinidad, pero la coexpresión de gE y gI incrementa la eficiencia de la unión. Los genes gE y gI están conservados en los alfaherpesvirus.
La habilidad de unión al Fc de IgG no inmune se considera un medio de enmascaramiento de la superficie de la célula infectada por el virión lo que la "protegería" contra los anticuerpos específicos. Evidencias recientes sugieren que la unión a la región Fc de anticuerpos virus-específicos vía puente bipolar puede inhibir la activación de la vía clásica del complemento y la citotoxicidad dependiente de anticuerpo desarmando al anticuerpo que se une a la superficie del virión o la célula infectada.

Alteración de la señalización de las citoquinas.

  • Variación de la respuesta a las citoquinas
El herpesvirus bovino 1 es un ejemplo. Como se conoce las células endoteliales aumentan su adherencia hacia los polimorfonucleares (PMN) bajo el influjo del TNF entre otras citoquinas. Sin embargo, durante la infección por HVB1 este virus disminuye el influjo de PMN hacia el pulmón en respuesta a un invasor secundario Pasteurella haemolytica. Este flujo se altera porque se afecta la función de las células endoteliales del pulmón lo que provoca una inhibición del movimiento de los PMN a través de la barrera sangre-tejido. En un experimento desarrollado con el fin de investigar este efecto se emplearon células endoteliales del pulmón aisladas de feto bovino, estas células mostraron su capacidad habitual de adhesión a los PMN. Lo que se vio incrementado como resultado de la exposición de las células endoteliales al TNF (rBo TNF) a diferentes tiempos: 8, 12 y 24 horas. Las células endoteliales infectadas con el HVB1 respondieron en menor intensidad al (rBo TNF). Se observó además una disminución de la unión de los PMN a las células endoteliales infectadas con HVB1 y simultaneamente tratadas con (rBo TNF) a las 10 y 12 horas post-infección. Estos resultados sugieren que HVB1 previene la infiltración de los PMN inducida por las citocinas por medio de la modificación de la respuesta de las células endoteliales del pulmón a las mismas.
Evasión parasitaria.
Los protozoos como Plasmodium, Leishmania y Tripanosoma, desarrollan variados mecanismos de evasión: Penetran y se multiplican en las células, varían sus antígenos de superficie, eliminan cubiertas proteicas que adquieren e incluso modulan la respuesta inmune del hospedero, incluso desarrollan un mecanismo de activación selectiva de células T helper.
Secuestro anatómico.
Trichinella spp por ejemplo desarrolla quistes que hacen al sistema inmune no accesible al parásito.
Enmascaramiento.
Por "adquisición" de proteínas del hospedero Schistosoma mansoni adquiere glicolípidos de los grupos sanguíneos.
Cambios del patrón de citoquinas.
Leishmania major induce un patrón de tipo Th2 con predominio de IL4 que hacen al hospedero mas susceptible, ya que altos niveles IL 4 inhiben el patrón de respuesta Th1.
Variación antigénica
Trypanosoma spp es un ejemplo. Se señala que presenta una variación programada lo que ha hecho muy compleja la posibilidad real de obtener vacunas eficientes contra estos parásitos.
Existen muchas otros resultados que evidencian los mecanismos de evasión desarrollados. Se debe reflexionar acerca de la compleja red de factores que debemos tener en cuenta para elaborar estrategias de control y eficientes productos vacunales.

Desarrollo de vacunas de nueva generación

Una de las áreas donde el impacto de la Biotecnología ha sido mayor, es sin duda la salud animal y dentro de esta , la obtención y producción de nuevas vacunas ha sufrido una verdadera revolución.
Las enfermedades infecciosas continúan siendo el más importante contratiempo para una eficiente producción animal en países desarrollados y en vías de desarrollo por lo que establecer programas de inmunizaciones es sin dudas una de las vías de control más sostenibles.
Las nuevas tecnologías han impactado en la Vaccinología moderna en tres aspectos fundamentales:
  • Nuevas formas de producción de vacunas
  • Nuevas presentaciones antigénicas
  • Nuevas estrategias de obtención y diseño.
Así, los criterios tradicionales del desarrollo de vacunas se han basado en la selección de patógenos en un marco amplio mientras que los criterios actuales se basan en la virulencia antigénica utilizando antígenos que sean más viables.
Ambas estrategias coinciden en que las vacunas sean: Seguras, de bajo costo, fácil administración y fuerte y larga protección.
La estrategia de desarrollo de vacunas basadas en la virulencia antigénica se basa en que muchos antígenos virulentos estimulan inmunidad protectiva no siendo esenciales para la reproducción y la transmisión de la enfermedad, por lo cual es posible la obtención de los mismos utilizando diferentes vías de expresión y sistemas portadores o presentadores de antígenos.
Esta estrategia de desarrollo de vacunas ha sido la base para el desarrollo de nuevas generaciones de vacunas.
Las estrategias que se utilizan para la generación de estas vacunas han permitido el desarrollo de diferentes generaciones de vacunas dentro de las cuales se destacan algunas por el impacto que han tenido. A continuación trataremos las principales vacunas que conforman estas nuevas generaciones.
Vacunas por subunidades (recombinantes o purificadas): Han estado basadas en los criterios de selección de antígenos de virulencia lo que ha permitido vacunas más eficaces, seguras, de bajo costo relativo y de respuestas inmunes más específicas y duraderas. Un paso critico para el desarrollo de una vacuna por subunidades es la identificación de los componentes individuales (proteínas o glicoproteínas) relacionadas con la protección. En ocasiones muchas proteínas incluidas en la formulación de vacunas pueden ser inmunosupresivas . Resulta imprescindible identificar las proteínas inmunodominantes o sea imprescindibles para inducir protección y que eliminen la acción de las otras.
Combinando los análisis geonómicos y el entendimiento de la patogénesis molecular de las enfermedades, es posible identificar proteínas específicas inmunodominantes.
La utilización de componentes subunitarios inmunógenos es un alternativa de inmunización, por su poder inmunógeno limitado deben ir a unidos a adyuvantes potentes para propiciar una buena respuesta inmune En tal sentido las investigaciones de adyuvantes han incluido nuevas estrategias como la inclusión de citoquinas para potenciarlas y dirigir la repuesta inmune
Para el desarrollo de una vacuna por subunidades se deben considerar tres pasos críticos que son:
- Conocimiento de la estructura molecular del patógeno.
- Entendimiento de los mecanismos de la inmunidad.
  • Producción de las proteínas de interés
Estas pueden basarse en proteínas nativas purificadas o proteínas recombinantes.
Teniendo en cuenta las características de las proteínas candidatas se seleccionan los sistemas de expresión a utilizar, los mismos pueden ser:
Sistemas de expresión procariota: (no realizan modificaciones postransduccionales): E. coli, Salmonella, BCG.
Sistemas de expresión eucariota: (realizan modificaciones postransduccionales). Estos a su vez pueden ser:
  • Células Eucariotas inferiores: levaduras como Sacharomices cerevisiae y Pichia pastoris

  • Células de mamíferos: sistemas virales
Los pasos fundamentales en el diseño de una vacuna por ingeniería genética se describen en la figura 1
Las ventajas potenciales de las vacunas por subunidades radican en que las mismas incrementan la seguridad, disminuyen la competencia antigénica ya que solo pocos componentes son incluidos en las mismas, además, los antígenos incluidos resultan importantes targets o blancos para el sistema inmune. Otra ventaja a tener en cuenta es la posibilidad de diferenciar animales vacunados de los animales infectados (denominadas Vacunas marcadas). La principal desventaja como se señalo es la necesidad el uso de fuertes adyuvantes en las formulaciones, aunque se ha señalado también que las respuestas inmune son por lo general mas cortas que las vacunas vivas.
Vacunas vivas atenuadas por mecanismos moleculares: La sustitución de los métodos convencionales de atenuación ha eliminado uno de los peligros potenciales de las vacunas atenuadas: la reversión de la patogenicidad. Dentro de estas se señala la utilización de la Salmonella como vacunas bacterianas vivas atenuadas y los vectores virales vivos como los Pox-virus (vaccinia), herpesvirus y adenovirus como modelos promisorios en medicina veterinaria.
Vectores bacterianos: Dentro de estos podemos señalar:
Bacterias gram - : Salmonella thyphimurium
Bacterias Gram. +: BCG
Una cepa bacteriana atenuada ideal debe tener ventajas como:
  • .Virulenta y muy inmunogénica.
  • Protección con una sola dosis.
  • En el caso de un patógeno entérico debe retener su capacidad de colonizar el Intestino y TLAI sin causar enfermedad.
  • Dos o más mutaciones que aseguren la no reversión.
  • El sistema debe asegurar la expresión de los genes clonados en el individuo. Inmunizado.
  • Cultivarse, mantenerse y administrarse con facilidad.
Salmonella typhimurium: Es el modelo de bacterias más usado como vector debido a que existe un modelo murino .y a que la genética de Salmonella es ampliamente conocida , Se ha seleccionado este sistema para la expresión de antígenos foráneos por diferentes aspectos importantes en la inducción de una respuesta inmune como:
•El ag llega al tejido linfoide asociado al intestino (TLAI) y placas de Peyer ( IgA)
• Puede colonizar el intestino persistiendo y proliferando en el TLAI así como a bazo e hígado.
• Puede atenuarse sin afectar la colonización
• Vasta información de factores de colonización y virulencia.
Para el uso de Salmonella typhimurium como vector se han desarrollado diferentes mutantes atenuadas, siendo los más importantes:
Biosíntesis liposacáridos: gal E.
Biosíntesis de ácidos aromáticos: Aro
Biosíntesis de purinas: pur
Regulación de AMP cíclico: cya
Síntesis de ácido fosfórico: crp
Dentro de estos, los mutantes Aro son los más utilizados por ser la vía más segura de atenuación ya que reducen el riesgo de adquirir eventos de recombinación con la flora normal .y poder ser administrados por la vía oral y parenteral induciendo fuerte actividad humoral y respuesta mediada por células
Con respecto a
la utilización del BCG como vector debe considerarse que es una cepa atenuada que se utiliza para la protección contra la tuberculosis humana., puede administrarse a cualquier edad, con pocas complicaciones además de tener propiedades adyuvante y protección con una sola dosis.
Vectores virales vivos atenuados: Los virus poseen características que los hacen interesantes para su uso como vectores, entro de estas se deben destacar:
-Sólo contiene los antígenos de interés.
- Muchos virus expresan antígenos intracelularmente.
- El antígeno se presenta al sistema inmune de manera análoga a los patógenos.
- Existen regiones relacionadas con la patogenicidad como el gen TK o E1 que pueden utilizarse para realizar las delecciones genéticas.
Los virus en su uso como vector deben poseer un balance adecuando en sus características de inmunogenicidad e inocuidad.
Dentro de los virus más usados como vectores se destacan los poxvirus. Por las ventajas que representan están siendo explotados como vectores de genes foráneos particularmente los avipoxvirus que unen a estas características la de ser hospedero- restringido por lo que no se replican cuando son introducidos en células de mamíferos aunque pueden actuar como vectores de expresión de genes de éstas especies.
Otras familias de virus utilizados son los herpes virus, adenovirus y retrovirus. Señalaremos algunas de las características de estos grupos virales que los hacen elegibles a la hora de considerar el diseño de un vector vacunal.
Poxvirus:
  • Son Virus grandes y envueltos ( 180-300 kb)
  • Doble cadena de ADN. El genoma no presenta intrones y no existe solapamiento de genes.
  • Replicación citoplasmática
  • Transportan en sus viriones las enzimas necesarias para la replicación de ADN y la expresión de las proteínas con la mínima participación de la maquinaria celular
Dentro de los poxvirus más utilizados como vectores tenemos:
Ortopoxvirus: Vaccinia.
Avipoxvirus:
Virus de la viruela aviar.
Virus de la viruela en canarios
Virus de la viruela en palomas
Raccoonpoxvirus
Capripoxvirus
Suipoxvirus
En el desarrollo de un poxvirus como vector deben considerarse los siguientes elementos moleculares:
•Origen de replicación en bacterias y gen marcador.
• Promotores originales de poxvirus o sintéticos, con regiones para expresión temprana y tardía.
• Gen de interés clonado bajo promotor de poxvirus con su ATG y sin intrones.
• Señal de terminación de la transcripción
• Gen reportero para selección de recombinantes
• Región no esencial del genoma que flanquee los elementos anteriores.
Como ventajas de este grupo viral como vector podemos señalar su replicación citoplasmática, portar los factores de la transcripción, replicación y traducción dentro de su genoma. Además pueden perder gran cantidad de regiones no esenciales y aceptar gran cantidad de información heteróloga (25kb). A su vez permiten la realización de modificaciones postrasduccionales y el tráfico intracelular de proteínas.
Con relación a la inducción de la respuesta inmune existen otras ventajas en el grupo de los poxvirus como el hecho de que inducen respuesta citotóxica celular mediada por linfocitos CD8+.
El virus Vaccinia (modelo de este grupo viral Fig.2) ha presentado estabilidad en las preparaciones, bajo costo, administración fácil e inducción de inmunidad por largo tiempo y la capacidad de incorporar múltiples genes foráneos. Sin embargo ha presentado algunas desventajas lo que ha limitado su uso como vector en formulaciones vacunales ya que demostró la aparición de casos de encefalitis con desmielinización e infección progresiva con el virus o que está relacionado con la edad, estado inmunológico de los vacunados y las cepas utilizadas. Debido a estas complicaciones los trabajos actuales se han dirigido a vectores con rango de hospederos más restringidos como los avipoxvirus.
Herpesvirus
Se caracterizan por ser virus grandes, envueltos, DNA de doble cadena y ser infecciosos Después de la infección con un herpesvirus los genomas migran a los núcleos donde pueden: mantenerse como episomas o integrarse al ciclo de replicación celular y ocasionar la muerte de la célula.
Como ejemplos de vacunas experimentales que han utilizado este tipo de vector tenemos :
Virus de la Pseudorabia porcina expresando la glicoproteína E1 del virus de la PPC.
• IBR expresando epitopos de la VP1 del virus de la Fiebre aftosa.
Adenovirus:
Este grupo viral se distingue por ser virus muy difundidos en la naturaleza, no envueltos, genoma de ADN de doble cadena, lineal y una talla de 30-40 kb. Los adenovirus entran a la célula por endocitosis mediada por receptores. Su DNA es infeccioso y la replicación ocurre sin integración al genoma hospedero
Las ventajas de su uso como vector están dadas por que son:
- Fácil de crecer y obtener altos títulos en cultivos de tejidos.
- Pueden realizarse delecciones en la región E3.
-Son Importantes para inducir inmunidad mucosal.
-Su uso puede estar dirigido a ser vectores de vacunas multivalentes y en vacunas orales para prevenir enfermedades respiratorias.
Se han desarrollado algunos modelos experimentales de vacunas a partir del uso de adenovirus como Hepatitis b, Glicoproteína de la rabia y contra el HIV.
Históricamente las vacunas vivas son generalmente consideradas excelentes inmunógenos porque simulan la infección natural. Sin embargo generalmente la atenuación convencional es generalmente irrealizable. Por lo que las posibilidades que ofrece la atenuación molecular, resulta una importante herramienta, ya que es posible identificar genes de virulencia e inducir mutaciones o delectar genes completos en dependencia del patógeno. La posibilidad de realizar mutaciones múltiples o delecciones conlleva a la generación de vacunas mas seguras que las atenuaciones convencionales, reduciendo los peligros de reversión de la virulencia.
Otra ventaja de este tipo de vacuna es la posibilidad de utilizar vías de inmunización semejantes a las rutas naturales de infección como las mucosas, induciendo no solo inmunidad sistémica sino también inmunidad mucosal.
Vacunas por péptidos sintéticos: La posibilidad de sintetizar péptidos sintéticos en el laboratorio abrió la posibilidad de utilizar los mismos como vacunas
Las premisas para el uso de los péptidos sintéticos como vacunas estuvieron sentadas en que los anticuerpos generados por inmunizaciones con péptidos sintéticos eran capaces de reconocer proteínas nativas y que las células citotóxicas reconocen fragmentos proteolíticos de proteínas presentadas en la superficie de las células por el complejo MHC.
Al principio los esfuerzos se dirigieron hacia la inducción de respuestas B, la razón de esto consistió en que se pensó que un péptido sintético diseñado podía ser utilizado como generador de anticuerpos contra proteínas nativas precedentes. Otra razón fue que para muchos patógenos, por ejemplo la malaria, una transferencia pasiva de anticuerpos monoclonales podía generar protección en animales de laboratorio. A esto se unió la facilidad de poder monitorear respuestas humorales.
Se utilizan diferentes métodos para la identificación de epitopos específicos a partir de péptidos sintéticos. El método más comúnmente usado se basa en el uso de anticuerpos generados contra las proteínas intactas para lo cual es necesaria la utilización de un gran número de péptidos. Con pocas excepciones los epitopos identificados por este método son epitopos continuos que representan un fragmento lineal de la proteína.
Gran número de péptidos son necesarios para la identificación de epitopos continuos y se utilizan algunos métodos para su generación. Uno de los métodos más utilizados es el pepscan y la generación de librerías de péptidos en bacteriofagos. Una de las desventajas de estos métodos es el screening de un número de muestras.
Otra dificultad es la característica de los péptidos sintéticos de ser pobres antigénicamente por lo que se han usado adyuvantes como sales de alúmina (aunque se reconoce que es un adyuvante débil para la inducción de respuestas B y no recomendado para la inducción de respuestas Th). También han sido utilizados liposomas y adyuvantes oleosos.
Se recomienda que en péptidos menores de 15 aminoácidos se utilicen proteínas carriers para aumentar su poder como inmunógeno. También se han usado liposomas, eritrocitos y otras partículas inertes.
Mucho tiempo después del descubrimiento de que la respuesta inmune era producto del sinergismo entre diferentes poblaciones de células y la función de células timo-dependiente - helper o células ayudantes - , fue demostrado que las células Th no reconocen a las proteínas nativas solo después de un procesamiento o degradación parcial en fragmentos para su presentación al complejo de histocompatibilidad MHC II , siendo esta la base de los estudios de inducción de respuestas T por péptidos sintéticos.
En la actualidad de han realizado numerosos estudios acerca de este aspectos, los cuales han reconocido la presencia de epitopos inductores de respuestas Th en péptidos sintéticos.
La combinación de epitopos B y T en peptidos sintéticos químicamente definidos ha inducido altos títulos de anticuerpos y generado respuesta específica.
Usando péptidos sintéticos con epitopos Th patógeno- específico en combinación con epitopos B y unidos los péptidos a proteínas carriers se han encontrado respuestas B y T específicas contra los patógenos en cuestión. En tal sentido merece la pena destacar los trabajos referidos a Plasmodium berghei ..
Se ha demostrado la importancia de la repuesta CTL o de citotoxicidad en la protección contra diferentes patógenos los cuales están dados por determinados epitopos.
El aislamiento e identificación de péptidos presentados a las moléculas MHC I ha permitido la identificación de epitopos CTL, brindando importantes informaciones acerca de la interacción entre estos péptidos y las moléculas MHC I.
Desafortunadamente los péptidos sintéticos contentivos de epitopos CTL son pobres inmunógenos cuando se inoculan directamente y no se obtienen respuestas CTL importantes. Sin embargo se ha logrado a través de la combinación de estos con adyuvantes, liposomas, ISCOMS o por conjugación con proteínas carriers.
Sin duda la respuesta CTL es uno de los componentes más importantes y decisivos de la respuesta inmune por lo que continúan los esfuerzos a lograr las mismas a través de epitopos sintéticos y los trabajos se dirigen hacia la combinación de epitopos CTL con otros que induzcan respuestas protectivas Th o B .
A manera de conclusión debemos señalar que los péptidos sintéticos es una importante estrategia de obtención de vacunas novedosas por su seguridad y facilidades económicas, sin embargo los estudios se dirigen en la actualidad hacia los siguientes aspectos:
  • Los mecanismos celulares que son responsables de la protección contra los diferentes patógenos.
  • Cuales epitopos son reconocidos durante la respuesta inmune.
  • Cómo pueden estos epitopos ser administrados y presentados como inmunógenos como Targets a los diferentes componentes del sistema inmune.
Cómo puede ser monitoreada la respuesta inmune dentro de las estrategias
Sin embargo, existen muy pocas vacunas sintéticas disponibles en el mercado, lo que puede estar dado porque las mismas deben estar basadas en un mayor conocimiento de la respuesta inmune de los patógenos específicos y lograr la representación de epitopos B y T en ellos de manera que se induzcan respuestas humorales y celulares que incluya repuestas T citotóxicas así como el uso de poderosos adyuvantes y proteínas carriers.
Además de estas vacunas hoy asistimos al nacimiento de los que ya se conoce como las vacunas de tercera generación, las denominadas Vacunas de ADN o inmunizaciones de ADN y los sistemas de expresión de antígenos protectivos en plantas, marcan las nuevas generaciones de vacunas.

Vacunas de DNA.

Las premisas que demostraran la posibilidad de uso del DNA como elemento desencadenador de una respuesta inmune estuvieron se basan en los siguientes trabajos:
•1990: (grupo de Felgner (Wolff y cols) internalizan en músculos plásmidos no replicativos y que codifican para determinados genes: expresión de proteínas
• 1992 (Tang y cols) partículas de ADN unidas a oro inducen respuesta inmune contra las proteínas.
• 1993 (Ulmer y cols) Prueba definitiva de eficacia protectora: fuerte respuesta inmune tanto humoral como celular.
Se parte de un nuevo concepto en la generación de las mismas puesto que no utilizan microorganismos totales ni subunidades antigénicas, sino se utilizan vectores plasmídicos con genes que codifican para la proteína que deseamos expresar, logrando la expresión de la misma en el tejido del animal inmunizado rememorando lo que sucede en las infecciones naturales por los patógenos. Para la medicina veterinaria estas vacunas introducen ventajas muy promisorias como la inducción de fuertes respuestas B y T, repuestas citotóxicas, tienen un menor costo relativo, no necesitarían cadenas de fríos para su transportación y se plantea la inducción de inmunidad pasiva en muchos casos. Se habla de una tecnología de una gran robustez tecnológica y aunque aún se encuentra en etapas tempranas de investigación ya se han obtenido resultados promisorios en diferentes modelos.
Los vectores a utilizar en la generación de este tipo de construcción genética deben tener los siguientes elementos
•Origen de replicación de E. coli.
• Gen de resistencia a antibióticos.
• Polilinker para inserción de genes foráneos.
• Promotor eucariota (CMV)
Señales de poliadenilación y terminación de la transcripción para expresión en células eucariotas.
Sin embargo se ha señalado que estos vectores deben tener minimizadas las secuencias no esenciales para lo cual se han generado los denominados vectores minimalísiticos como el vector MIDGE desarrollado por la compañía alemana MOLOGEN S.A
Estas vacunas pueden ser administradas por diferentes vías de inoculación como:
Intramuscular, intradérmica, Gene- gum, liposomas, transdérmica y la utilización de la Bactofección (utilización de bacterias atenuadas como carriers de plásmidos de expresión eucariota).
Como ventajas para este tipo de vacuna se han descrito las siguientes:
• Induce fuertes respuestas celulares, humorales y respuestas citotóxicas.
• El antígeno se presenta de manera similar a la infección natural.
• Inmunidad de larga vida.
• Se señalan las propiedades del ADN como adyuvante.
• Vacunas económicas.
•Genes que codifican para diferentes antígenos pueden ser introducidos simultáneamente.
• Es posible dirigir la respuesta inmune por coexpresión de citoquinas.
• No necesitan condiciones de refrigeración.
• La persistencia de plásmidos puede desarrollar inmunidad en animales jóvenes por anticuerpos pasivos.
. • Posible uso de combinación de vacunas (primer- bost).
Se debe señalar que aún se trabaja por esclarecer algunos aspectos relacionados con su seguridad como es el potencial de integración genómica, potencial para la inducción de tolerancia inmunológica y autoinmunidad y el potencial de inducción de anticuerpos anti- ADN. Se plantea que algunos controles de seguridad pueden ser similares a las vacunas recombinantes, puesto que es una nueva forma de presentación antigénica, nuevos aspectos deben ser considerados (Traavik, 2007)
Traavik, 2007 señala algunos de los principales riesgos e inconvenientes de estas vacunas que constituyen preocupaciones por los especialistas como:
- Dudas en si la replicación es realmente deficientes
- Recombinaciones relacionadas con virus endógenos u otros virus circulantes
  • Inmunidad anti- vector

Vacunas verdes

En la actualidad se trabaja en las denominadas vacunas verdes, que conjugan las tecnologías de transformaciones genéticas en las plantas con la expresión de proteínas antigénicas de interés, aunque aún no se ha estudiado en su totalidad las respuestas inmune que estas podrían inducir, se habla de su futuro en inmunizaciones orales.
Las plantas se presentan como sistemas atractivos para la producción de proteínas terapéuticas debido a sus beneficios económicos y cualitativos, reduciendo los riesgos en la salud derivadas de contaminaciones de patógenos así como incrementando los rendimientos dada la posibilidad de su expresión en semillas y otros órganos de reserva.
En este sentido debe agregarse que los sistemas de cultivo, cosecha, conservación y procesamiento de cultivos transgénicos existen y solo se necesitarían inversiones mínimas para la producción comercial de un biofarmaceútico.
Las plantas son potencialmente una fuente de productos recombinantes ya que el costo de producción aproximado de una proteína recombinante en plantas puede ser de 10 a 50 veces menores que la producción de la misma proteína en una fermentación en E. coli.
Muchas proteínas terapéuticas recombinantes se producen en sistemas de expresión en células de mamíferos, la ventaja de estos sistemas es que los mismos son correctamente sintetizados y procesados, sin embargo los rendimientos obtenidos son bajos además de requerirse medios costosos contentivos de suero fetal bovino. Por otro lado los cultivos a diferentes escalas son difíciles si tenemos en cuenta que existen muchos factores que influyen en los medios como pH, oxígeno disuelto en el medio y metabolitos que es necesario controlar rigurosamente ya que cualquier variación puede afectar la expresión de las proteínas y la pureza de los mismos.
Los sistemas de expresión en bacterias y hongos son sistemas más robustos aunque no son factibles de usar para la obtención de proteínas que necesiten sistemas de modificaciones postransduccionales. En este sentido se ha señalado por diferentes autores que las diferencias de modificaciones y usage de codón entre los sistemas de plantas y las células de mamíferos son mínimos en comparación con los que existen entre las células de mamíferos y los microorganismos, de ahí que las plantas pueden constituir una vía de elección con relación a los sistemas basados en células procariotas.
Otra de las complejidades que se derivan de los sistemas en células y microorganismos lo constituye sin dudas la purificación de proteínas los cuales constituyen sistemas costosos. Las plantas pueden almacenar las proteínas producidas en el endospermo de las semillas desde donde pueden ser fácilmente extraídas. Se han puesto a punto algunos sistemas que posibilitan abaratar los costos de las purificaciones como la fusión con oleosinas. En este mismo sentido se plantea que los costos de extracción pueden ser cubiertos como parte de la extracción de materiales convencionales como por ejemplo los costos de extracción de albúmina bovina expresada en papas pudiera ser cubierta como producción paralela de almidón.
En el caso de vacunas orales no se necesitarían estos sistemas de extracción lo que constituye una ventaja significativa para su uso en la profilaxis de algunas enfermedades donde se necesite inmunidad a nivel de tracto digestivo.
A todas estas ventajas debe agregarse que las plantas no son hospederos para microorganismos patógenos al hombre y los animales, de ahí que las contaminaciones sean menores.
Se han desarrollado dos sistemas de transformación para producir proteínas recombinantes en plantas.
El primero comprende la transformación en plantas usando Agrobacterium mediante la transformación genética, el bombardeo de partículas y otras técnicas estandar de transformación genética. El modelo más usado en la actualidad es el de Nicotiana tabacum, aunque se han desarrollado otros como tomate, papas, plátanos, frijoles negros, arroz, trigo, maíz y soya.
La segunda estrategia consiste en infectar plantas no transgénicas con virus recombinantes que expresen los transgenes durante su replicación en el hospedero. Los sistemas más usados son el tabaco con el virus del mosaico del tabaco (TMV) y Cowpea con el virus del mosaico de Cowpea (CPMV). Usando este sistema, los rendimientos son similares que los obtenidos con las plantas transformadas aunque en ocasiones estos pueden ser superiores. Esta segunda estrategia se considera más útil en la producción de vacunas donde se pretende estimular la inmunidad mucosal a nivel de tracto digestivo.
El sistema de plantas transgénicas presenta una expresión multigeneracional estable, existen promotores asequibles para la expresión en tejidos y otros órganos específicos con inducción de la expresión de las proteínas y conlleva un tiempo de producción relativamente largo, en cambio en los vectores virales los genes insertados pueden perderse en el tiempo, se expresan primariamente en tejidos foliares de 2-4 semanas post-inoculación y la producción y escalado es rápida.
Para la expresión de proteínas de interés farmacéutico en plantas transgénicas se ha utilizado el promotor CaMV 35S, sin embargo este puede generar pobres rendimientos. Se han utilizado además otros sistemas en semillas como el promotor GT3.
La trascripción de la transgénesis de las Ig ha sido controlada bajo el promotor B4 de las leguminosas. Como las Ig en el citoplasma pueden interferir con otras funciones de las células es preferible que se secreten al apoplasma o que sean transportadas al retículo endotelial donde pueden acumularse hasta el 1 al 5% de las proteínas solubles totales o TSP.
Estos sistemas han sido probados en investigaciones y en condiciones controladas debido a las facilidades en la transformación genéticas además de estar bien caracterizados y ser fáciles de trabajar, sin embargo a mayores escalas esto no pudiera suceder así ya que algunos factores pudieran interferir en su aplicabilidad a mayor escala por ejemplo los sistemas de purificación de proteínas recombinantes en plantas pudieran ser ineficientes y casos debido a la necesidad de remover un gran número de metabolitos como la nicotina.
Otro aspecto a tener en cuenta es que como las semillas constituyen un bajo porcentaje del peso de las plantas deben ser utilizados los tejidos vegetales los cuales como es conocido están formados por un gran % de agua por lo que deben usarse sistemas de proteólisis con baja eficiencia y un incremento en los costos de producción. Por esta razón el costo de producción de proteínas biofarmaceúticas en el tabaco es tan costos como los métodos tradicionales.
Hasta el momento los cultivos que ofrecen mayores posibilidades de ser usados para la producción de vacunas y otras proteínas de interés biofarmaceútico pueden ser los granos y las semillas oleosas como el maíz, trigo, soya ya que las proteínas almacenadas en las semillas pueden ser desecadas pudiéndose guardar intactos una gran cantidad de productos
La compañía Sembiosys de Alberta, Canadá señalan el uso de la tecnología de oleosina, la cual ofrece ventajas en el recobrado de estos productos como el menor costo de recobrado de las mismas. Esta tecnología consiste en en el hecho de que las semillas oleosas contienen triglicéridos en los compartimentos denominados cuerpos oleosos. Estos organelos están unidos por una media unidad de membrana la cual está formada por proteínas oleosinas lipofílicas. Los cuerpos oleosos pueden ser separados fácilmente de otros componentes de la semilla, se ha encontrado además que los oleosinas pueden ser fusionados con otras proteínas de las semillas a nivel genético y poder acumularse esta en las semillas. Usando el principio de flotación las proteínas fusionadas pueden ser purificadas de las semillas. Esta compañía ha señalado una variedad del uso de esta tecnología en la farmacéutica y en la industria de los cosméticos.
Estos elementos hacen a las semillas como un sistema eficiente de almacenaje, distribución y administración de biofarmacéuticos como las vacunas.
Se ha desarrollado además una tecnología de encapsulación de almidón para la producción de proteínas recombinantes. Esta tecnología se basa en el proceso natural de la biosíntesis en plantas. La sintetasa de los gránulos de almidón (GBSS) son constituyentes naturales de los mismos. Esta proteína está exclusivamente dentro de los gránulos en cantidades de hasta 50% de las proteínas totales de los mismos. Se han identificado los dominios de la GBSS del maíz. Por fusión del gen candidato con el dominio de la GBSS, se ha demostrado el acumulo de la proteína exclusivamente en los gránulos de almidón. Estos experimentos se han realizado utilizando la proteína verde fluorescente (GFP) y se ha determinado la presencia de la misma en el endospermo del maíz. Esto puede introducir ventajas en la producción, aislamiento y utilización de las proteínas recombinantes y pueden estar dirigidos a productos para la agricultura, enzimas industriales, alimentos, farmacéuticos entre otros.

  1. Uno de los focos hacia donde se dirigen en la actualidad los trabajos de investigación de obtención de proteínas en plantas son las vacunas tanto para el hombre como los animales, debido a lo promisorio del desarrollo de vacunas orales.
Por ultimo señalamos las oportunidades y riesgos de las vacunas comestibles generadas en plantas (Traavick, 2007).
Oportunidades de las vacunas comestibles
_ Producción simple y barata
  • Grandes dosis de vacunas en formas encapsuladas
  • Estables, pueden ser almacenadas a temperatura ambiente durante largo tiempo
  • No necesitan personal y equipamiento especializados
_ Administración oral e inmunidad a nivel de mucosas
  • Vacunas multivalentes
  • Respuestas CTL
Seguridad y riesgos
  • Tolerancia , parálisis del sistema inmune
  • Aberraciones en la trascripción , traducción y procesamiento de antígenos (productos transgénicos )
  • Alergias y otras reacciones inmunológicas no deseadas
  • Toxicidad y anti-nutrientes
  • Cambios en los procesos de regulación genéticas de los productos
  • Todos los riesgos potenciales relacionados con plantas transgénicas

Vaccinología inversa

No podemos dejar de mencionar el nuevo impacto de la Bioinfomática en el desarrollo de nuevos productos vacunales.
Con el desarrollo de la bioinformática ha surgido la denominada Vaccinología inversa que comienza con la predicción de los antígenos in silico, proceso que termina en la determinación de una lista de nuevos candidatos vacunales (Mora et al, 2003).
Adyuvantes y liberacion antigenica
Liberación por pulsos de antígenos: Existe en la actualidad una tendencia a incorporar los antígenos a polímeros que liberan estos lentamente o en dosis por pulsos.
Las ventajas que este tipo de liberación antigénica puede generar son las siguientes:
  • Pueden implantarse por vías subcutánea.
  • Administración de dosis múltiples.
  • Puede coadyuvar a dominar el bloqueo de los anticuerpos maternos.
  • Puede proteger a los antígenos de la administración oral.
Como principal desventaja se señala que el antígeno debe mantenerse estable durante y después de su incorporación en el polímero.
Los adyuvantes
Los adyuvantes son tema de interés desde el inicio de la vaccinología.
Recientemente esta temática ha recibido mayor atención por el auge de nuevas vacunas (a partir de epitopes, subunidades) que son débiles desde el punto de vista de su inmunogenicidad. El desarrollo de la biotecnología y la Ingeniería Genética así como el conocimiento creciente de los elementos regulatorios de la respuesta inmune, han permitido favorecer el logro de la respuesta deseada.
Una de las definiciones clásicas de adyuvante los define como "sustancia que usada en combinación con el antígeno vacunal supera los niveles de inmunidad alcanzados con el empleo de la vacuna sola."
Para Allyson y Byars 1990 " es un agente que aumenta la inmunidad específica a un antígeno, un vehículo una sustancia usada para liberar el antígeno, y una formulación adyuvante la combinación de adyuvante y el vehículo apropiado".
Según Cox y Coulter 1992 "una sustancia o procedimiento que provoque un incremento específico en la inmunogenicidad del componente vacunal".
Una respuesta inmune deseada varía dependiendo del agente microbiano y debe ser favorecida por el adyuvante. Lo que se sustenta en los elementos esenciales de la inmunidad a diferentes agentes infecciosos: bacterias, virus, y parásitos y debe tenerse en cuenta al momento del diseño de una vacuna en particular.
En esta valoración es necesario hacer referencia a los adyuvantes mas conocidos
Aluminio y Sales del Calcio
El aluminio y las sales del calcio son adyuvantes relativamente débiles que principalmente inducen respuesta tipo Th2 y poca o casi ninguna inmunidad a mediación celular los que los hace no adecuados para los microorganismos en los que la inmunidad celular es imprescindible para la protección. Las sales de calcio raramente se utilizan pero las sales de aluminio son ampliamente utilizadas en las vacunas de uso veterinario y la cantidad de aluminio varía con la vacuna
Se consideran adyuvantes seguros. Los efectos adversos serios son poco frecuentes aunque pueden ocurrir reacciones alérgicas y granulomas.
  1. Adyuvantes oleosos
En general las emulsiones de aceite son adyuvantes más fuertes que el aluminio, en el sentido que inducen tanto respuesta Th1 como Th2, pero a costa de incrementar las reacciones en el sitio de inyección y los granulomas. En la actualidad se emplean otras opciones que no resulten tóxicas.
Liposomas Los liposomas son vesículas de colesterol y fosfolípidos que parecen membranas de la célula. Estos adyuvantes pueden incorporar antígenos dentro del lumen o en la membrana. Ellos pueden inducir inmunidad humoral y, en algunos casos, actividad CTL. Los liposomas se han usado durante años como vehículos para dosificar y son seguros. Se les ha añadido inmunomoduladores para aumentar la eficacia de los mismos pero también pueden aumentar los efectos adversos.
Nanoparticulas y Micropartículas
Las Nanoparticulas y Microparticulas son partículas sólidas diminutas hechas de polímeros biodegradables, sobre todo el cianoacrylatos y poly(lactide-co-glycolide)copolymeros. Las Nanoparticulas difieren de las Micropartículas sólo en su tamaño. Los polimeros que se usan en estos adyuvantes también son usados como material de sutura, protesis o portadores de drogas y se piensa que no son toxicos. En estudios preliminares, ningún efecto adverso serio ha sido observado. Tienen la habilidad de formar un depósito a largo plazo que puede eliminar el antígeno durante varios meses. Las mezclas de Micropartículas de eliminación -rápida y eliminación -lenta teóricamente deben proporcionar ambos tipos de inmunización: primaria y de refuerzo en una sola inyección. En ratas, una dosis de toxoide tetánico con un adyuvante de micropartículas logró una inmunidad comparable a 3 dosis con sales de aluminio.
Adyuvantes de Micropartículas pueden proteger a los antígenos incorporados contra las condiciones difíciles tales como el pH bajo, las sales biliares y enzimas. Por esta razón, ellos pueden ser particularmente interesantes para vacunas orales e intranasales. Los Problemas técnicos en su fabricación pueden ser una desventaja porque el proceso de encapsulación puede alterar los antígenos y puede disminuir su habilidad de estimular el sistema inmune.
Se está probando las Nanoparticulas y las Microparticulas en animales de compañía incluso los caballos así como en peces, ganado bovino y cerdos.
Saponinas Las Saponinas son adyuvantes extraídos del árbol Quillaia saponaria. El extracto crudo de este árbol se llama saponina. Quil A y Spikoside®a Son mezclas parcialmente purificadas y QS21 y ISCOPREP 703®a son fracciones definidas. Quil A se usa ampliamente en medicina veterinaria y se ha usado en vacunas para el ganado bovino, cerdos, caballos, perros, y gatos que incluyen virus de la influenza equina, parvo virus canino. Las Saponinas inducen fuertes respuestas Th1 y Th2 y CTL. . Son seguras, pero la seguridad depende de la ruta de administración, especies, y la saponina especifica. Inyecciones Intravenosas de fragmentos menos purificados puede producir toxicidad, probablemente debido a hemólisis. Inyecciones de Quil A se toleran bien en ovejas y ganado, se reporta alguna toxicidad en gatos
ISCOM Los Complejos inmune-estimulantes (ISCOM) son estructuras en forma de jaula que contienen saponinas, colesterol, y fosfolípidos. En vacunas veterinarias, la saponina es a veces QuilA. Los ISCOM pueden inducir respuestas Th1 y CTL así como Th2 pueden ser adyuvantes eficaces en gatos, perros, ganado bovino, caballos, cerdos, ovejas, pavos, conejos y ratones. Estos se han usado con más de 20 patógenos virales, bacterianos, y parasitarios, con buenos resultados.
Bloques de copolimeros No-iónicos
Los bloques de copolimeros No-iónicos son adyuvantes sintéticos compuestos de bloques hidrófobicos de polyoxypropyleno (POp ) flanqueados por bloques
de polyoxyethyleno (POE). Los bloques copolimeros no iónicos se consideran como adyuvantes, pueden reforzar la inmunidad humoral de varios antígenos virales, bacterianos y parasitarios y pueden inducir CTL.
Productos bacterianos y sus derivados
Históricamente, las preparaciones de cultivos completos de bacterias muertas por calor se usaron como adyuvantes crudos. El ejemplo más famoso es el uso de micobacterias en FCA. Más recientemente, Siwicki y colaboradores encontraron que preparaciones liofilizadas de Propionibacterium avium KP-40 muertas por calor podrían reforzar la respuesta de anticuerpos a un anfígeno co-administrado. Para el uso en vacunas modernas, tales preparaciones bacterianas deben refinarse y menudo desintoxicarse.
El Muramil dipeptido (MDP) es el componente activo de un peptidoglycano immunomodulador de Mycobacteria. El MDP tiene efectos adversos como fiebre, artritis, y uveítis, Se han preparado derivado menos tóxico. Los derivados hidrofílicos como el threonyl MDP, murabutide, nor-MDP, N-acetylglucosaminyl-MDP inducen principalmente respuesta tipo Th2. Los derivados de Lipofilicos. MTP-PE tienden a inducir reacciones tipo Th1.
Las toxinas bacterianas también pueden actuar como adyuvantes. Se han probado la toxina de cólera y la exo-toxina lábil al calor de E. coli (LT). Estas 2 toxinas son adyuvantes mucosales prometedores en algunos modelos animales. Ellas parecen inducir respuestas humorales fuertes así como LTC. Para el uso en mucosas, ambas, la LT y las toxinas de cólera deben ser mutadas a formas menos tóxicas.
Las citoquinas como adyuvante
Las citoquinas son uno de los principales mediadores-efectores de la respuesta inmune capaces de regular un amplio espectro de funciones biológicas que incluye respuesta inmune e inflamatoria, reparación tisular, respuesta injerto huésped y la hematopoiesis, por lo que pueden ser usadas para "dirigir" la respuesta inmune, de aquí su potencialidad como adyuvantes.
Como se señaló anteriormente la definición de los patrones Th1 (relacionado con inmunidad a mediación celular) y Th2 (relacionado con inmunidad humoral) representó un avance indudable en la posibilidad de "orientar" la respuesta inmune.
De acuerdo a los aspectos señalados en la tabla 1 con relación a la inmunidad a microbios se desprende que la respuesta Th1 es la deseada para todas aquellas infecciones microbianas intracelulares. El efecto beneficioso de la respuesta Th1 con la secreción de IFN e IL2 se ha probado para prácticamente todos los patógenos intracelulares M.tuberculosis. M.leprae, L.monocytogenes, Ricketsia sp. Chlamydia sp. L.neumophila así como Plasmodium sp, Leishmania sp, Toxoplasma gondii, Trypansoma cruzi.
En Anaplasmosis bovina se plantea que el IFN  bovino es uno de los elementos responsables de la respuesta protectora.
La IL12 promueve respuesta protectora endógena. Durante la infección IL12 estimula la producción de IFN por las células NK las que contribuyen en las defensas tempranas durante infecciones bacterianas, parasíticas y virales. La IL12 facilita el desarrollo de clones de linfocitos Th1. En contraste una regulación negativa de IL12 en la fase aguda de una infección puede ser el evento clave en el establecimiento de una infección crónica.
Existen varios problemas permanecen antes de que las citocinas puedan incorporarse rutinariamente en las vacunas. Estas proteínas son a menudo específicas para cada especie y sólo un número limitado de citocinas han sido clonadas en las especies de importancia veterinaria. Además, los modelos de ratones no siempre reflejan lo que puede ocurrir a las especies de importancia veterinaria. Por ejemplo, la IL-10 en ratones puede cambiar el equilibrio de las respuestas Th1 y Th2, pero en ganado la IL-10 no tiene el mismo efecto. Algunas citocinas pueden no ser suficientemente estables para las vacunas. La toxicidad también es una preocupación. La mayoría del citocinas sólo se produce en cantidades pequeñas durante la respuesta inmune y principalmente actúan localmente. Si grandes cantidades entran en la circulación sistémica existe el peligro potencial de que se provoque un shock severo y muerte.
Se puede encontrar una dosis optima para algunas citocinas, evitando dosis pequeñas inefectivas o grandes dosis toxicas o aún inmunosupresoras. Para otras citocinas, la dosis eficaz puede ser similar a la dosis tóxica. Para superar algunas de estas dificultades, se están desarrollando los derivados menos tóxicos de IL-1 y IL-6. Una vía alternativa para disminuir toxicidad es usar los inductores de citocinas.
Finalmente no resulta obvio reiterar que es esencial el esclarecimiento de la inmunopatología de la enfermedad para la correcta selección de una citoquina como adyuvante.

Adyuvantes para las Vacunas Mucosales

Las vacunas Mucosales pueden tener ventajas significativas por encima de las vacunas sistémicas. Los beneficios pueden incluir los efectos adversos disminuidos, administración más fácil e inducción de inmunidad en el punto natural de entrada para un patógeno. La acción del adyuvante puede ser un factor importante en el éxito de estas vacunas. Los adyuvantes deben poder superar las condiciones adversas, particularmente en el tracto gastrointestinal. La combinación óptima del adyuvante-antígeno debe inducir anticuerpos en superficies de mucosas así como las respuestas inmunes sistémicas.
Los candidatos para ser adyuvantes para las vacunas mucosales incluyen liposomas, micropartículas y nanoparticulas, citocinas, ISCOM, lípidos monofosforilados A, CpG, y toxinas ADP-ribosylating detoxicadas .ADP-RIBOSILATING desintoxicadas. Las Microparticulas y las nanoparticulas son particularmente interesantes porque ellas pueden ser las únicas capaces de proteger antígenos contra el pH bajo, las sales biliares, y enzimas del tracto digestivo.
Otras tendencias en la obtención de adyuvantes. Los motivos CpG: su impacto en la respuesta inmune
El descubrimiento por Tokunaga 1984 y otros investigadores en el que demostró que el ADN bacteriano y no el de vertebrados activa las células NK, e induce IFN así como regresión en modelos de tumores murinos, y que solo el ADN bacteriano, activa las células B y la secreción de inmunoglobulinas, constituyeron las bases de un conjunto de investigaciones que culminaron con la definición del papel de los motivos CpG en la inmunidad, así como la posibilidad de su empleo con fines terapéuticos y/o profilácticos.

¿Qué son los motivos CpG?

Los motivos CpG son secuencias específicas de ADN que contienen los dinucleótidos citosina-guanina de forma no metilada. Estos dinucleótidos poseen una fuerte actividad de estimulación de la respuesta inmune. En células B murinas y humanas inducen proliferación, la aparición de señales coestimulatorias y la producción de inmunoglobulinas; las células dendríticas secretan una amplia gama de citoquinas, interferones y quimocinas, e incrementan la expresión de señales coestimulatorias.
Los macrófagos, las células dendríticas y los linfocitos B son células presentadoras de antígenos y constituyen los principales linajes celulares involucrados en mediar y coordinar la inmunidad innata. Los macrófagos y las células dendríticas desarrollan un tipo primitivo de receptor que detecta patrones moleculares que están presentes en los microbios, pero no en los vertebrados.
Estos receptores de los patrones moleculares (PRR en inglés) se unen a moléculas comunes en los microbios, pero no en los tejidos del hospedero. Por lo que la presencia de los patrones moleculares de los microbios y su unión a los receptores representan una señal que provoca una rápida inducción de la inmunidad innata.
Se ha demostrado que uno de los sistemas de reconocimiento se basa en sutiles diferencias estructurales entre el ADN de los hospederos y el de los patógenos invasores. El ADN de los microorganismos contiene los motivos CpG estructuralmente diferente del de los hospederos y estos directamente activan las células del sistema inmune como monocitos, macrófagos y células NK.
Se encontraron además tres resultados de gran interés:
1 La actividad biológica señalada en el párrafo anterior es provocada por el ADN del BCG y el de los invertebrados y no por el ADN de vertebrados ni las plantas.

  1. La actividad depende de secuencias de bases particulares que tienen dinucleótidos ricos en Citocina y Guanina CG in a senless manner.
  2. Se logró definir que, al menos en parte , la actividad inmunoestimuladora del BCG Bacilo Calmette Guerin se debe a las secuencias genómicas del ADN rica en los dinucleótidos CG.
Otras evidencias con relación a los CpG son que los procariotes presentan más secuencias CpG que los vertebrados además en los procariotes los CpG son no metilados a diferencia de los presentes en los vertebrados que si son metilados. Lo que sugiere según Krieg 2001 que el sistema inmune desarrolló un mecanismo de defensa basado en el reconocimiento de la diferencia entre dinucleótidos CpG metilados y los no metilados. Como confirmación de esta hipótesis, se encontró que cuando se metila el CpG bacteriano se elimina el efecto mitogénico, lo que confirma que el CpG no metilado es el que provoca la estimulación.
La inmunización a nivel mucosal con CpG se ha empleado frente a antígenos virales y bacterianos: Antígeno completo del virus influenza para uso intranasal y oral,Antígeno de superficie de la hepatitis B para uso intra nasal , oral y rectal en los bacterianos se senala :Toxoide tetánico para uso intranasal, oral y recta , Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) para uso intranasal
En orangutanes bajo respondedores se encontró que la adición de CpG en la vacuna de hepatitis provoca seroconversión y altos títulos de anticuerpos.
Finalmente se hace necesario señalar algunos de los efectos adversos y riesgos de los adyuvantes.

Efectos adversos y Riesgos Potenciales de los Adyuvantes

Los efectos adversos de los adyuvantes están influenciados por las interacciones de los adyuvantes específicos y el antígeno y pueden ser fiebre, artritis, uveítis, anorexia y letargia. Teóricamente, los adyuvantes también pueden aumentar la probabilidad de reacciones auto inmune. Dosis excesivas de IL-2, una citocina propuesta como adyuvante, se ha asociado a las enfermedades auto-immunes. Se han detectado Auto- anticuerpos después de la vacunación con las vacunas contra distemper canino, rabia, y parvo virus, y una asociación temporal también se ha sospechado entre la anemia hemolítica autoimmune y vacunaciones en perros. Los Adyuvantes también pueden tener efectos adversos específicos relacionados a su naturaleza química. Por ejemplo, algunos adyuvantes de saponina pueden producir hemólisis si se inyectan IV.
Los adyuvantes causan reacciones locales como inflamación, granulomas o abscesos estériles. En perros, las vacunas más frecuentemente asociadas con reacciones locales son rabias o combinaciones del distemper; en gatos, las vacunas de la rabia se relacionan a menudo con reacciones locales no-neoplasticas. Sin embargo la mayoría de estas reacciones son pasajeras.
Por estas razones se hacen muchas consideraciones: Primero, la inflamación severa puede entrampar los antígenos en el sitio de la inyección y puede evitar que sean reconocidos por el sistema inmune. Segundo, algunos adyuvantes pueden dar como resultado perdidas por producir decomisos en canales de los animales destinados para la alimentación humana. Ciertas vacunas que contienen aluminio, por ejemplo, pueden causar grandes granulomas en ovejas.
Los Granulomas están asociados particularmente con adyuvantes y pueden tomar semanas o meses para disolverse.
No existe un adyuvante ideal razones que van desde la biología del microorganismo hasta aspectos tecnológicos, parámetros de calidad del producto final, reacciones adversas así lo justifican. Para seleccionar un adyuvante para una vacuna, debe entenderse que el adyuvante mejor no siempre es el mismo para todos los antígenos y situaciones. El adyuvante óptimo depende de las especies animales, patógenos específicos, el antígeno de la vacuna, ruta de inmunización, y el tipo de inmunidad que se necesita
El conjunto de elementos señalados permiten prever la posibilidad más cercana a partir del conocimiento acumulado acerca de la interacción microorganismo –hospedero de obtener vacunas más cercanas a nuestras necesidades en medicina veterinaria. No obstante quedan muchos elementos que deben considerase para lograr este objetivo como son los riesgos en la producción de las mismas.

Análisis de riesgo en la producción de vacunas veterinarias como parte de las medidas de Bioseguridad

El surgimiento de nuevas generaciones de vacunas ha motivado la instrumentación de medidas de bioseguridad y la necesidad de realizar estudios de evaluaciones de los riesgos que acometemos en la obtención y producción de un biológico no solo dirigido a la preservación de la salud humana y animal sino también a la protección del medio ambiente.
El análisis del riesgo asociado a las vacunas veterinarias debe basarse en los principios de garantía de la calidad, que incluye el control de la calidad durante la producción de las mismas. En tal sentido, se han sido introducidos nuevos conceptos de análisis de riesgos que van desde las etapas de experimentación hasta el desarrollo de una vacuna veterinaria.
Este análisis parte del uso de un modelo multifactorial que incluye los riesgos para la salud animal , la salud pública humana y para el ambiente .Los modelos propuestos realizan una valoración cualitativa del riesgo a partir del estudio profundo del patógeno en cuestión , incluyen recomendaciones de como manejar el riesgo en la producción de los diferentes biológicos y analiza los denominados riesgos de comunicación , estos últimos toman particular importancia cuándo se trata de nuevas generaciones de vacunas.
Para valorar dicho riesgo resulta imprescindible conocer los detalles epidemiológicos de las enfermedades que estos ocasionan, diferentes características de los mismos como infectividad al humano, estabilidad en el ambiente, habilidad para contagiar por diferentes vías, susceptibilidad a agentes físicos y químicos y posibles tratamientos.
En tal sentido, nuevos conceptos de análisis de riesgos han sido introducidos por la APHIS (Animal and Plant Inspection Service) de EU (Gay. 1999) desde las etapas de experimentación para el desarrollo de una vacuna veterinaria. Este análisis parte del uso de un modelo multifactorial que incluye los riesgos para la salud animal, la salud pública humana y para el ambiente. Estos modelos propuestos realizan una valoración cualitativa del riesgo a partir del estudio profundo del patógeno en cuestión, incluyen recomendaciones de como manejar el riesgo en la producción de los diferentes biológicos y analiza los denominados riesgos de comunicación, estos últimos toman particular importancia cuándo se trata de nuevas generaciones de vacunas.
  1. Modelo de análisis de riesgo propuesto en el CFR 103.3: Se ha definido el riesgo como "la probabilidad de que un evento adverso ocurra y las consecuencias que se derivan de la ocurrencia de dicho evento , el documento regulador 9CFR (Title 9, Code of Federal Regulations) propone un modelo de análisis de riesgo para la producción de un biológico veterinario desde sus etapas de investigación que permite la identificación de todos los peligros desde las etapas tempranas del diseño de la producción de un biológico, además de que provee de métodos para identificar y ensayar sistemas de seguridad potencial , a esto se agrega que los resultados que se obtengan se presentan de una manera útil para manejar las decisiones .En tal sentido, los primero que es imprescindible realizar es la clasificación de los microorganismos vacunales. Para estos empeños los análisis se deben basar en datos empíricos específicos e información científica establecida, existiendo una clasificación propuesta por APHIS la cual clasifica a los microorganismos vacunales en 4 grupos:

Vacunas vivas convencionales.

Semillas maestras de vacunas por subunidades.
  • Vacunas por deleción de genes.
  • Vacunas de vectores recombinantes.
Esta clasificación ayudará a la industria a identificar las características de seguridad necesarias a implementar desde las etapas experimentales. La caracterización de estos agentes vacunales se enfocará desde el punto de vista microbiológico, molecular y biológico. Sin embargo atendiendo a que estos estudios resultan particularmente complejos, los organismos reguladores deben aplicar esta modelo con criterios científicos que permitan hacer un verdadero análisis de la magnitud del riesgo biológico al que se enfrentan.
Para valorar dicho riesgo resulta imprescindible conocer los detalles epidemiológicos de las enfermedades que estos ocasionan, diferentes características de los mismos como infectividad al humano, estabilidad en el ambiente, habilidad para contagiar por diferentes vías, susceptibilidad a agentes físicos y químicos y posibles tratamientos.
Dentro de las consideraciones que son necesarias tener en cuenta para evaluar el riesgo están:
  • Conocimiento de las enfermedades en el humano, dosis infectivas y severidad de la enfermedad.
  • Volumen de los cultivos con los cuales se va a trabajar.
  • Historia de los aislamiento o cepas que se van a utilizar, incluido el pase en que se encuentre.
  • Posibilidad de formar aerosoles.
  • Precauciones especiales en la manipulación y conservación.
Evaluación del riesgo.
A partir del concepto de riesgo anteriormente citado, se considera riesgo la probabilidad de que un evento adverso ocurra y las consecuencias que se producirán si este evento llega a ocurrir. Un evento adverso entonces se define como un peligro seguro a los animales, a la salud pública o al ambiente.
El modelo propuesto por APHIS incluye no solo la identificación de los peligros sino también la evaluación de los escapes y la caracterización de los riesgos de seguridad para animales, salud pública y ambiente. La evaluación de este riesgo es usada para determinar cuales riesgos se asocian con el propósito específico de la prueba o del posible escape de una vacuna veterinaria desde la contención y para caracterizar el grado de incertidumbre asociada al propósito definitivo,
Identificación del peligro.
Precisamente el primer paso en la evaluación del riesgo es identificar el peligro a animales, salud pública y/o al ambiente. En este paso la evaluación de riesgo predetermina cuales peligros potenciales pueden existir Para estandarizar este proceso se han fijado una serie de parámetros o índices que ayudan a no centrar solo el análisis en las características del microorganismo vacunal o el riesgo de escape sino otros índices alternativos se necesitan en el análisis y que deben considerarse cuando el análisis se realiza con diferentes propósitos.
Clasificación de los microorganismos.
A partir de estos conceptos de riesgos , según la resolución 42/99 que trata de la Lista Oficial de Agentes Biológicos que afectan al hombre , los animales y las plantas . Esta lista oficial se organiza teniendo en cuenta el riesgo individual que enfrenta el trabajador de laboratorio y el peligro que representa para la comunidad y el medio ambiente, la naturaleza propia del agente por su patogenicidad y virulencia reconocida , si es endémica o no en el país, el modo de transmisión , la disponibilidad de medidas profilácticas , la existencia de tratamiento eficaz y las consecuencias socioeconómicas los microorganismos que afectan a los animales se clasifican en :
Grupo 1: tienen un escaso riesgo individual y comunitario, siendo muy poco probable que causen enfermedades en trabajadores o animales saludables.
Grupo 2: tienen escaso riesgo de difusión y sus consecuencias socio económico y sanitario no son graves.
Grupo 3: Son aquellos microorganismos que:
  • Causan enfermedades transmisibles importantes desde el punto de vista socio económico y sanitario.
  • Pueden existir limitaciones para el comercio internacional de animales y/o sus productos.
  • Pueden o no estar en el país, bien sea con poca diseminación o bajo control.
  • Presenta riesgo individual elevado y moderado riesgo comunitario para el medio ambiente.
Grupo 4: Son aquellos microorganismos que:
  • Son exóticos para el país y representan un elevado riesgo para el personal debido a su rápida difusión.
  • Tienen grave incidencia económica y sanitaria.
  • Existen restricciones en el comercio internacional con relación a su uso.

Programas de seguridad

Cada instalación debe tener una política de seguridad coherente, códigos de seguridad y programas que soporten su implementación, siendo responsable de la misma la dirección de la misma.
La responsabilidad para la implementación de la misma es el oficial de Bioseguridad y la responsabilidad para que esto se cumpla cotidianamente es de los individuos que ejecutan el trabajo.
Además de esto debe existir un Comité de Bioseguridad. En las instituciones dedicadas a producción de biológicos.
Análisis de riesgo en vacunas a partir de microorganismos genéticamente modificados.
A pesar que la Biotecnología ha constituido una promesa para aliviar las enfermedades a través del desarrollo de medios diagnósticos y de vacunas, han sido muchas las preocupaciones planteadas sobre su seguridad. De esto han sido blanco fundamental las vacunas donde la recombinación de microorganismos halla sido utilizada.
El trabajo inicial en el desarrollo de sistemas de la expresión de proteínas recombinantes se realizó en la bacteria Escherichia coli, en la actualidad se utilizan otros sistemas procariotas y sistemas de expresión eucariota. Estos sistemas incluyen levaduras y cultivos de células de mamíferos o insectos, que en muchos casos se han empleado en la producción comercial de proteínas recombinantes.
Las ventajas y limitaciones de estos sistemas son conocidos y la selección de uno u otro dependerá de varios factores relacionados con la proteína a expresar y su uso final, medios y capacidades de producción así como de un análisis costo beneficio.
Existen conjeturas acerca si deben existir tratamientos diferentes para microorganismos manipulados genéticamente.
Con los microorganismos en general el riesgo de enfermedad depende de su patogenicidad o sea su capacidad de infectar y causar enfermedad. Generalmente la patogenicidad no es una característica simple sino una complicada interrelación de un conjunto de factores asociados con la entrada y persistencia en el hospedero.
Existen consideraciones que plantean que con un microorganismo genéticamente modificado debe ser similares a las de un microorganismo aislado "de novo"
En una construcción genética existen tres elementos que deben considerarse para valorar el riesgo:
  • Hospedero: Particularmente debe valorarse su capacidad de sobrevivir en el ambiente por accidentes de escape.
  • Vector: Debe considerarse por su potencial patógeno como por su posibilidad de transferir información genética horizontal.
  • Inserto: Componente que requiere la evaluación más cuidadosa, ya que el hospedero y el vector usualmente han sido bien caracterizados y adecuadamente evaluados
En el caso de un virus recombinante la posibilidad de escape debe considerarse de una manera similar a como se hace cuando se trabaja con cualquier virus.
Las diferentes agencias reguladoras clasifican las vacunas biotecnológicas según su riesgo en los siguientes grupos:
ESTADOS UNIDOS
USDA,APHIS,CVB
CANADA
CFIA.AH.VBS
Clase I:
  • Vacunas inactivadas
( subunitarias)
Clase I:
  • Vacunas subunitarias.
  • Vacunas OGM (con inserción o deleción génica , sin DNA foráneo)
Clase II:
  • Vacunas gen delecionadas (con o sin inserciones marcadas)
Clase II:
  • Vacunas vector vivo
  • Vacunas OGM (con inserción o deleción génica con DNA foráneo
Clase III :
  • Vacunas vector vivo
  • Vacunas de DNA
  • Vacunas verdes
 

Otras consideraciones:

- El escalado industrial no es más peligroso que el uso de estos microorganismos en le laboratorio, el riesgo se aumenta con el aumento de volumen.
- La gran mayoría de trabajos con microorganismos modificados genéticamente utilizan microorganismos de bajo riesgo intrínseco, sin embargo algunos aspectos del proceso o del producto, pueden dictar el nivel de contención requerido, tomando en consideración el riesgo potencial para el ambiente.
- Con el cepario no existen regulaciones especiales
Vacunas por vectores vivos:
Los riesgos se valoran por la generación de virus recombiantes y sus posibles escapes al medio. Se consideran como vacunas vivas y por tanto se establecen los riesgos de acuerdo a esta condición. La posibilidad de lanzar un gen al entorno y las probabilidades de recombinaciones deben ser consideradas.
Vacunas de DNA:
Los últimos años han marcado el desarrollo de un nuevo concepto en vacunas: las inmunizaciones de DNA.
Sin embargo, el estado del arte de esta temática aún no ha esclarecido algunas incógnitas en sus investigaciones como: integración al genoma de las células, generación de anticuerpos anti DNA, reacciones de tolerancias, etc.
Su desarrollo y certificación debe verse similar a la de cualquier nuevo producto biológico y debe valorarse muy estrechamente con las autoridades regulatorias que tienen una gran responsabilidad en estos sistemas.
Existen potenciales ventajas en las denominadas vacunas de DNA, sin embargo como nueva tecnología al fin deben tomarse nuevos puntos por las agencias regulatorias.
Teóricamente la introducción de un DNA foráneo puede causar eventos de transformación como la formación de tumores celulares por la inserción de oncogenes activos, activación insercionales de pro-oncogenes en las células hospederas o por desactivación insercional de genes represores, todas estas investigaciones son aspectos en las que se trabaja y que deben seguirse por los organismos reguladores. Otros aspectos son la naturaleza de la respuesta inmune que se genera y la expresión de largo término.
Aunque existen algunas regulaciones particulares que ya se comienzan a publicar aún no existe una guía particular en el control de estas vacunas. En estos momentos se toman los aspectos de las guías generales para la producción de biológicos recombinantes como las publicadas por la FDA y la Comunidad Europea.
Hasta el presente es difícil identificar puntos de regulación que tengan una real implicación en la seguridad y eficacia de las vacunas de DNA porque no se conocen completamente todos los fenómenos que pueden ocurrir en estas inmunizaciones pero estas son seguidas muy de cerca por los diferentes organismos reguladores.

A manera de conclusiones.

Todas estas tendencias, algunas de las cuales llevan hasta 10 a 15 años de expuestas y sustentadas, marcan las investigaciones en la temática, sin embargo estas son casi una excepción en la producción industrial y su comercialización en el mercado de los biológicos veterinarios, como si existiera una disociación entre la política científica y la producción industrial.
Muchas son las razones que pudieran existir, como:
  • Una primaria y en el aspecto de la medicina Veterinaria de producción es fundamental la eficacia en el campo, cualquier vacuna de alto valor tecnológico agregado, solo será viable si su efectividad preventiva supera ampliamente a las de uso tradicional y sus variaciones.
  • El segundo valor fundamental que se entrelaza con todos los demás es el costo, este debe ser en el orden de los existentes ya en el mercado. Se insiste en el bajo costo que pudieran tener los productos derivados de la ingeniería genética, sin embargo estos análisis en muchos caso no toman en cuenta la inversión previa en investigaciones o en el pago de patentes.
  • Los valores anexos como son la de poder marcar el animal protegido para poder distinguirlo del enfermo a través de determinados marcadores , de extraordinario valor epidemiológico , la mayor seguridad de elaboración , menor inocuidad , mayor y mejor seguimiento del proceso , menos instalaciones y la posibilidad de prescindir del frío , no parecen ser en el presente factores determinantes en la decisión de entrar o no en la producción de vacunas más radicales en cuanto a la tecnología .
  • Otra dificultad que se presenta en las vacunas de nuevas generaciones se encuentra en las pruebas para su aplicación en los huéspedes naturales, las cuales requieren condiciones extraordinarias como aislamiento, análisis, desechos, etc.
Corresponde a los biotecnólogos establecer claramente los impactos de la ciencia como base para una ulterior expansión productiva, de los proyectos concretos y que engloban los dos presupuestos básicos que incluyen eficacia y costos.
Este escenario solo presenta un camino posible hacia el futuro, la biotecnología en la profilaxis veterinaria está en pleno uso y desarrollo, algunos de sus hallazgos ya se utilizan y los más radícales aparecerán en un breve intervalo de tiempo. Los productores y los biotecnólogos deberán conceptuar cual es el camino para lograr que la industria de los biológicos veterinarios sea una realidad.

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Glosario

  • Activador policlonal. Sustancias que estimulan la división de forma no específica.
  • ADCC Actividad citotóxica -dependiente de anticuerpos.
  • BCG: Bacilo Calmette- Guerin utilizado para la inmunización contra la tuberculosis, presenta propiedades como adyuvante.
  • C3 convertasa.
  • Células NK Constituyen uno de los componentes de la inmunidad natural que ayudan a controlar las células infectadas por virus y las células cancerosas sin una exposición previa al antígeno.
  • Células presentadoras de antígenos. Células capaces de procesar el antígeno y presentarlo ya procesado sobre su superficie en asociación con el Complejo Principal de Histocompatibilidad I y II
  • Citoquinas o citocinas Moléculas de bajo peso molecular secretadas por los linfocitos T y otras células del sistema inmune que intervienen en la comunicación entre las células.
  • Complejo Principal de Histocompatibilidad I y II (MHC I y II) Región de genes que codifican proteínas que medían el rechazo de trasplantes presentan alta variabilidad, participan en la presentación del antígeno a los linfocitos T. Las moléculas clase I participan en la presentación a los linfocitos T CD8 y las de clase II participan en la presentación a los linfocitos T CD4.
  • CTL Actividad citotóxica de los linfocitos TCD8
  • Diapedésis Proceso por el cual las células blancas salen de la circulación
  • DTH
  • Fragmento Fc Fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, después de la digestión con papaína. En esta región no radica el sitio de unión con el antígeno pero es responsable de muchas de las funciones biológicas de las inmunoglobulinas.
  • GM CSF Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos
  • IFN Interferón, interfiere con la multiplicación viral, estimula la actividad de los macrófagos, aumenta la actividad citotóxica de las células NK y las células T.
  • IL1 Interleucina 1, factor iniciador de la respuesta inmune y de la respuesta inflamatoria.
  • IL2 Interleucina 2, induce la proliferación de las células B y T, aumenta la citotoxicidad de linfocitos T y células NK.
  • IL6 Interleucina 6, induce la diferenciación final y el switch de clases de los linfocitos B interactúa con IL1 y el TNF en la reacción de fase aguda.
  • Inmunogénico. Capaz de provocar la respuesta inmune.
  • ISCOMS: Iscom son partículas sólidas generadas por la mezcla de un antígeno con un detergente biocompatible y el adyuvante Quil-A, lo que da lugar a estructuras muy pequeñas (35 nm). Únicamente se pueden utilizar con antígenos que puedan mezclarse con lípidos y con el Quil-A, normalmente proteínas
  • Linfocitos T/ Subpoblación de linfocitos T que difieren de los T  por las cadenas proteicas de sus receptores para el antígeno, residen fundamentalmente a nivel de las mucosas.
  • Linfocitos Th (T helper) Responden al antígeno por la secreción de citoquinas que favorecen la activación de los linfocitos B o los T
  • Linfocitos Th1 Subpoblaciones de linfocitos T helper que secretan citoquinas que promueven la inmunidad a mediación celular.
  • Linfocitos Th2 Subpoblaciones de linfocitos T helper que secretan citoquinas que promueven la inmunidad humoral.
  • Lnfocitos T citotóxicos. Subpoblación de linfocitos T que responden al antígeno presentado en la superficie celular por la destrucción de la célula que produce el antígeno
  • LPS Lipopolisacárido de la pared de bacterias Gram -.
  • MIDGE: Un nuevo tipo de vector de expresion minimalistico e inmunologicamente
  • Opsonización. Proceso en que la célula o partícula se cubre con anticuerpos o complemento y se favorece la fagocitosis.
  • PPC: Peste Porcina clásica.
  • Respuesta de fase aguda. Respuesta no específica a la infección o inflamación caracterizada por la aparición de proteínas de fase aguda.
  • Respuesta granulomatosa.
  • Señales coestimulatorias. Señales recibidas por los linfocitos T y B además de las transmitidas por la unión con el antígeno. Junto al antígeno son imprescindible para la activación de los linfocitos.
  • Sistema Mononuclear fagocítico.
  • Switch de las cadenas pesadas. Cambio de la clase de anticuerpo producido por el linfocito B en respuesta a un antígeno específico.
  • TLAI: tejido linfoide asociado al intestino
  • TCR Receptor para el antígeno en la célula T.
  • TK : Gen de la Timidina Kinasa relacionado con la virulencia de algunos grupos virales.
  • TNF Factor de necrosis tumoral  , inicia los cambios inflamatorios en unión con la IL1 y la IL6, provoca la regresión de ciertos tumores, aumenta la función de los neutrófilos y estimula la proliferación de los linfocitos B y T.
  • VIH Virus de la Inmunodeficiencia humana

Trabajo Enviado Por:
Yanney Hernández Reyes
yenneyh2005[arroba]yahoo.es


Autor:
Siomara Martínez,
Miriam Pedroso Reyes,
Belkis Corona González
Grupo de Biología Molecular, División de Microbiología.
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.
Datos del autor:
País y ciudad de nacimiento: La Habana, Cuba
Estudios realizados: Médico Veterinario, PhD en Ciencias Veterinarias.
Profesión: Investigador, Biología Molecular, Profesor Adjunto, Titular
La Habana, Cuba, Febrero 2008

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