martes, 3 de abril de 2012

AISLAMIENTO DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS ENZOÓTICA BOVINA EN CHILE Gustavo Montes et al 1991

  • Aislamiento y caracterización parcial del virus de la leucosis enzoótica bovina en Chile
Gustavo Montes O., Gladys Villouta C. , Susana Valdez C. , Mario Cornejo A.
Departamento de Patología Animal; Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias; Universidad de Chile 
 Av Cs Vet 6(1)  1991

Resumen

El virus de la leucemia bovina fue aislado desde bovinos naturalmente infectados, en un predio de la Región Metropolitana. Los linfocitos obtenidos de dos bovinos infectados fueron capaces de inducir sincicios específicos en cocultivos con células de bazo, timo y riñón fetal ovino.
El VLB fue obtenido desde sobrenadantes de cultivos de linfocitos, en tiempos cortos, de las vacas infectadas y con linfocitosis persistente. Este sobrenadante fue concentrado por ultracentrifuga­ción, detectando al VLB por inducción de sincicios en riñón fetal ovino y titulando la glicoproteína (gp51) por inmunodifusión doble en gel de agar.
Este aislado (cepa MVC-131-88) resultó ser sen­sible a la acción de la temperatura disminuyendo su capacidad de inducir sincicios (30%) cuando se conservó a -70ºC por 10 días, y en un 25% cuando se preservó a 4ºC por 45 días. La capacidad infec­ciosa de la suspensión no se destruyó totalmente si se la sometía a 56ºC por 15 min. El tratamiento con éter y luz ultravioleta eliminaron totalmente la ca­pacidad de inducir sincicios del aislado.
El aislado obtenido además de replicarse en los cultivos de riñón fetal ovino, fue capaz de liberarse a los sobrenadantes y mantenerse en a lo menos 5 subcultivos. Estos resultados indican que las carac­terísticas del aislado (cepa MVC-131-88) son com­patibles con las del virus leucemia bovina.
Palabras claves: Virus leucemia bovina, Virología.
Abstract
Bovine leukemia virus (BLV) was isolated, for the first time in Chile, from a naturally infected dairy herd. Viral diagnosis of the isolated (MVC-131-88) was based on the detection of specific syncytia (SIA) on tissue culture of fetal lamb spleen (FLS), kidney and thymus (FLT). The highest sensitivity was observed when cell sheet of 60-70% confluente were inoculated with peripherical lymphocytes or cell-free preparation of BLV, obtained from culture fuids of lymphocytes, naturally infected.
Treatment of cell sheet with a diethylamine-ethyl-dextran prior to BLV inoculation increase syncytia-inductora activity. Cell free BLV preparation decrease in syncytiainducing ability (30%) when was storaged to -70°C or when was heated (56°C, 15 min). Refrigeration (4°C, 45 ds) keep up this ability. Ether treatment, ultraviolet light irrada­tion, destroy the synytia-inducing activity of the isolated. BLV-antigen was detected by agar-gel immunodiffusion in the syncytia-positive monolayer inductor culture. These results indícate that characteristics of MVC-131-88 isolated are compatible with VLB-Ape virus.
Key words: Bovine leukemia virus, Virology.

Palabras Claves

Introducción

La leucosis enzootica bovina (LEB) es una neopla­sia maligna linfoproliferativa, inducida por el virus de la leucosis bovina (VLB), el cual infecta los linfocitos B y determina la generación de anticuer­pos contra la glicoproteína de la envoltura (gp51) y las proteínas del 'core' viral (P24), por parte del animal infectado.
La población de los linfocitos B sanguíneos que se detecta posterior a la infección con el VLB es policlonal respecto al sitio de integración del provi­rus (Burny y col., 1985).
En el tiempo variable después de la infección, menos de un 10% de los animales desarrollan tumo­res, por proliferación monoclonal de los linfocitos B (Rosenthal y col., 1988). En estos animales los linfocitos B circulantes pueden contener hasta tres copias de ADN proviral (Olson y Straub, 1984). El VLB además posee la capacidad de inducir policariocitosis temprana y tardía en cultivos celu­lares de varias especies (Guillemain y col., 1984). Se han descrito diferencias genómicas entre cepas virales, obtenidas desde distintas áreas geográficas (Kettman y col., 1984).
En Chile, desde la primera descripción clínica de la enfermedad (Schulz y col., 1962) se han efectua­do algunos estudios serológicos prevalenciales que indican variaciones regionales pudiendo encontrar­se zonas endémicas a la infección. Por otra parte Reinhardt y col. (1988), han analizado la produc­ción láctea de un rebaño afectado con el virus. Se ha estudiado además, la persistencia de anticuerpos calostrales anti VLB bajo las condiciones de ma­nejo de un predio de la región central del país. (Villouta y col., 1990). A nivel estatal el Ministerio de Agricultura está aplicando un programa de certi­ficación de predios de libres de LEB (Naranjo, J. 1988).
El VLB fue aislado en nuestros laboratorios di­rectamente en cultivos primarios fetales ovinos, inoculándolos con linfocitos provenientes de ani­males seropositivos y naturalmente infectados (Montes y col., 1988).
En este trabajo se entregan antecedentes sobre el comportamiento de este aislado viral en cultivos celulares fetales ovinos y sus variaciones al ser sometido a agentes físicos y químicos.
 Trabajo financiado por proyecto FONDECYT 0537-88

Material y métodos

Fuente del VLB
El aislado viral se obtuvo de linfocitos de dos bovi­nos hembras mestizos Hólstein-Friesian, de 4-8 años de edad, clínicamente sanos y seronegativos a rinotraqueítis infecciosa y parainfluenza-3 de acuerdo a las técnicas descritas por Berrios y col. (1985 a, b.). Estos animales presentaban en forma permanente anticuerpos anti gp51 del VLB detecta­do por la técnica de inmunodifusión doble en gel de agar (IDGA) (Iffa-Merieux) y que además cursaban con linfocitosis persistente.
Para ello se obtuvo sangre heparinizada (Lique­mine, 10 Ul/ml, Roche, Suiza) desde donde se separaron los linfocitos por la técnica descrita por Morein y col. (1979), modificada por Villouta y col. (1984).
Linfocitos infectados se suspendieron en medio esencial mínimo (MEM, Gibco, USA), suero fetal bovino (10%) (SFB, Flow, USA) y antibióticos obteniendo una concentración final de 2 x 106 / ml; los que fueron incubados a 37ºC por 72 hrs, de acuerdo a lo descrito por Diglio y Ferrer (1976).  Al cabo de este plazo se preclarificaron los sobrenadares a 10.000 x G por 15 min y se concentraron por centrifugación a 100.000 x G por 90 min.
El concentrado obtenido se suspendió en MEM y se conservó el cuotas de 300 μl a 4ºC, hasta el momento de su uso, quedando en una concentra­ción final equivalente a 1 x 107 linfocitos/ 100 μl, de acuerdo a lo descrito por Diglio y Ferrer (1976); en este trabajo se utilizó el concentrado de un solo animal, al que se le denominó cepa VLB-MVC­131-88.
Se utilizó como fuente de VLB, linfocitos obte­nidos de estos animales, los que se cultivaron con monoestrato de timo (TFO), bazo (BFO) y riñón (RFO) fetal ovino de acuerdo a lo descrito por Itohara y Takatori (1982). Como control no infecta­do se utilizaron linfocitos de dos animales perma­nentemente seronegativos a la infección de acuerdo a IDGA.
Cultivos celulares
El comportamiento del VLB 'in vitro' se estudió en cultivos primarios de células de TFO, BFO y RFO establecidos de acuerdo a las técnicas de Van der Maaten y col. (1974), utilizando como control de inóculo la línea celular CC8 1, cedida gentilmente por Eduardo Esteban (UNCPB, Tandil, Argentina). Replicación del VLB en Cultivos Celulares
Replicación del VLB Cultivos Celulares
Los cultivos se efectuaron en tubos Leigthon sembrados con 1 a 4 x 105 células/ml. Al cabo de 24 hrs los monoestratos (60-70% de confluencia) fueron tratados con DEAE-Dextrán (25 μ/ml/60 min.) (Sigma, USA) inoculándolos con linfocitos (0,5 a 50 x 104/ml) e incubándolos por 24 a 72 hrs., lavando los cultivos a este tiempo y, reponiendo el medio. A los 7 días se retiraban los cubre objetos se teñían y se efectuaba el recuento de sincicios de acuerdo a lo señalado por Montes y col. (1988).
Los aislados obtenidos de los sobrenadantes de los cultivos de linfocitos (cepa MVC-131-88), fue­ron inoculados en RFO (Diglio y Ferrer, 1976) y la replicación viral se visualizó por el recuento de sincicios.
Detección de Antígenos Virales
La presencia de antígeno gP51 se determinó por AGID tanto en los concentrados de los sobrenadan­tes de cultivos de linfocitos como en los sobrena­dante de cultivos de RFO inoculados con la cepa MVC-131-88, utilizando como referencia sueros positivos del laboratorio y del juego de reactivos (Iffa-Merieux) de acuerdo a lo descrito por Nougay­rede y col. (1981).
Comportamiento de la cepa MCV-131-88 Frente a Agentes Físicos y Químicos
Alícuotas (300 μl) del aislado viral se sometieron a diferentes tratamientos térmicos (56ºC, por 15 min; -70ºC, por 10 días; 4ºC, por 45 días). Otras ampo­llas (300 μl) fueron irradiadas con luz UV (100 microwatts por cm en plano horizontal, a 56 cm de distancia y con 1 mm de altura). Otras alícuotas se mezclaron con éter (1:2) en agitación por 60 min y a 20ºC. Luego de evaporar el éter la suspensión se centrifugó (800 x G, 90 min) y se reconstituyó al volumen inicial (Diglio y Ferrer, 1976).
Las alícuotas de los diferentes tratamientos, co­mo sus controles, fueron diluidas con MEM (en logaritmo base 2) y se inocularon en triplicado a monoestratos de RFO (2 x 105/ml) tratados o no con DEAE-Dextrán, observándose el efecto a tra­vés de la formación de sincicios.
Los sincicios formados se cuantificaron como Unidades Formadoras de Sincicios (UFS/ml); titu­lándose la capacidad de inducción de acuerdo a los criterios establecidos por Cunningham (1976).

Resultados y discusión

El VLB obtenido de linfocitos de vacas naturalmen­te infectadas fue capaz de infectar BFO, TFO y RFO determinando la formación de sincicios (Figs. 1 y 2). El aislado (cepa MVC-131-88) indujo poli­cariocitosis temprana en la línea celular CC8 1. Todos los cocultivos inoculados con linfocitos de bovinos serológicamente infectados con el VLB presentaron sincicios en grado variable en cuanto a su cantidad, tamaño y número de núcleos. Además, la mayoría de ellos presentó vacuolas citoplasmáti­cas y en ocasiones fragmentación de núcleo, varia­ciones descritas previamente por Diglio y Ferrer (1976) y Ferrer y col. (1981).
Figura 1. Células de bazo fetal ovino inoculadas con linfocitos de bovino con linfocitosis persistente y seropositivos a la infección con el VLB. (x40).
Figura 2. Cultivo de células de timo fetal ovino, inoculadas con linfocitos de bovino seropositivo a la infección con el VLB y linfocitosis persistente (x40).
El aislado viral, obtenido del sobrenadante del cultivo de linfocitos, a tiempos cortos, fue capaz de inducir sincicios en cultivos de RFO (Fig. 3) con características similares a las descritas previamen­te. Al mismo tiempo se replicó en los subcultivos, siendo posible recuperarlo desde los sobrenadantes.
Figura 3. Cultivo de células de riñón fetal ovino inoculadas con cepa MVC-131-88. Se observan numerosos sincicios con números variables de núcleo (x40).
En los cocultivos, se observó que la capacidad de inducir sincicios del VLB estaba relacionada con la concentración de linfocitos que se cocultivaban y el pasaje celular que se utilizaba, lo que concuerda con lo señalado por Chung y col. (1984). Después de diferentes ensayos, la técnica de inducción de sincicios se entandarizó sembrando 2 x 105 células/ ml (tercer a séptimo pasaje). Los monoestratos for­mados a las 24 hrs fueron tratados con DEAE­Dextrán (25 μg/ml/60 min) y luego inoculados con los linfocitos (1 x 106/ml) por 48 hrs. Después de lavados, se repuso el medio adicionado de SFB y antibiótico y los sincicios se contaron al cabo de 7 días.
En el Cuadro 1 se entrega un ensayo tipo efectua­do entre el 3º y 4º pasaje del cultivo primario de BFO, TFO y RFO, pudiendo observarse una gran variabilidad en el número de sincicios formados como también en la persistencia de la infección de estos subcultivos. En este sistema no es posible estimar el grado de replicación viral (concentración viral) en base al número de sincicios, ya que como lo sostienen Graves y Ferrer (1976), no existiría relación entre ellos. Sin embargo, las células de RFO presentaron una mayor cantidad y persistencia de sincicios además de un mayor número de núcleos por sincicio.
CUADRO 1 NÚMERO Y PERSISTENCIA DE SINCICIOS EN CULTIVOS DE CÉLULAS FETALES OVINAS INOCULADOS CON LINFOCITOS INFECTADOS CON EL VIRUS LEUCEMIA BOVINA
---
BFO
TFO
RFO
Pasaje Inoculado
Subcultivos

369*
231
277

368
647
3.098

1.894
1.294
3.211

3.003
878
2.402

1.247
1.571
1.270
*Promedio de sincicios de tres ensayos en duplicado. BFO: Cultivo de células de bazo fetal ovino; TFO: timo fetal ovino; RFO: riñón fetal ovino. Células fetales sembradas en concentración de 2 x 105/ml, e inoculadas con 1 x 106 linfocitos/ml.
El aislado viral, obtenido de los sobrenadantes de dos subcultivos de RFO inoculados con la cepa MVC-131-88, dio un título de 8 por IDGA frente al suero homólogo y de 4 en las bandas de precipita­ción de identidad correspondiente al antígeno gP51 del suero de referencia comercial. El sobrenadante concentrado e inoculado a nuevos cultivos de RFO fue capaz de inducir sincicios, obteniéndose en tres ensayos en triplicado un título promedio de 0,88 x 102 UFS/ml.
Al utilizar un polication (DEAE-Dextran) el títu­lo infeccioso de la cepa se incrementaba de 1,77 X 102 UFS/ml a 3,53 X 102/ml, lo que podría ser atribuido en parte a un aumento en la capacidad de penetración viral posterior al tratamiento, como lo sugieren Itohara y Takatori (1982).
La cepa estudiada resultó ser sensible a los trata­mientos térmicos (56ºC por 15 min; -70ºC por 10 días; 4ºC por 45 días) (Cuadro 2), observándose que en las condiciones de estos experimentos el VLB no perdió totalmente su capacidad infectante para los cultivos celulares, lo que podría ser expli­cado, parcialmente por la alta concentración viral (3,53 x 102 UFS/ml) utilizada.
La disminución de la capacidad infecciosa poste­rior al congelamiento a -70ºC fue similar a lo obser­vado por Itohara y Takatori (1982); sin embargo, estos resultados discrepan de lo reportado por Diglio y Ferrer (1976) quienes no lograron recuperar la capacidad infecciosa del VLB después de un ciclo de congelación a -70ºC. Estas discrepancias es posible atribuirlas a diferencias entre subpoblacio­nes del VLB, en su sensibilidad la temperatura, como lo señalan Itahora y Takatori (1982).
CUADRO 2 COMPORTAMIENTO DE LA CEPA VLB-MVC-131-88 EN SU CAPACIDAD DE INDUCIR SINCICIO EN CÉLULAS DE RIÑÓN FETAL OVINO AL SOMETERLA A DIFERENTES TEMPERATURAS.
Tratamiento
Control
Postratamiento
Inactivación Viral (%)
56°C 15 min
3,53X 102*
1,99X 102
43,6
-70°C 10 días
3,08x102
2,12 X 102
31,1
4°C 45 días
3,53x102
2,63 X 102
25,4
*UFS/ml Unidades formadoras de sincicios en cultivos celulares tratados con DEAE-D 25 μg/ml/60 min.
La preservación de la capacidad infecciosa (in­ducción de sincicios) de la cepa estudiada si se mantenía a 4ºC, por 45 días refleja un comporta­miento similar a lo descrito para otros virus con envoltura.
La cepa MVC-131-88 al ser tratada con éter e irradiación UV, perdió totalmente su capacidad in­fecciosa, lo que puede ser explicado por la destruc­ción de los componentes lipídicos en el caso del éter y por la alteración de su material genómico, dada la alta sensibilidad que poseen los ácidos nucleicos y polinucleótidos al ser expuestos a radiaciones no ionizante (Diglio y Ferrer, 1976).
Estos antecedentes y lo descrito previamente (Montes y col., 1988), nos permiten afirmar que el aislado viral MVC-131-88 se comporta como el virus de la leucosis enzoótica bovina, habiéndose establecido además que las células de RFO permi­ten la replicación y liberación de la cepa MVC-131­88 al medio de cultivo.

Referencias

BERRÍOS, P., M.A. CELEDÓN, F. CORTÉS, M. LUENGO. 1985. Aislamiento del virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina en un brote de abortos en la zona sur de Chile. Arch. Med. Vet. 17: 49-52.
BERRÍOS, P., M.A. CELEDÓN, M. DUCHENS, L. LORCA. 1985. Aislamiento del virus parainfluenza-3 de bovinos con sinto­matología respiratoria. Monograf. Med. Vet. 7: 61-62.
BURNY, A., C. BRUCK, Y. CLEUTER, D. COUEZ, J. DESCHAMPS, D. GREGORIE, J. GHYSDAEL, R. Kettmann, M. MAMME­RICKX, G. MARBAIX, D. PORTETELLE. 1985. Bovine leuke­mia virus and enzootic bovine leukosis. Onderstepoort J. Vet. Res. 52: 133-144.
CUNNINGHAM, Ch. 1976. Virus propagation assay. Academic. Press. Inc. London.
CHUNG, Y., B. HARROWER, J. EVERSON. 1984. Establishment of enzootic bovine leukosis virus producing cells lines using a Queensland isolate of the virus, Austral. Vet. J. 61: 306-307.
DIGLIO, C., J. FERRER. 1976. Induction of syncitya by the bovine C-type leukemia virus. Can. Res. 36: 1056-1067.
FERRER, J., C. CABRADILLA. 1978. The phenomenon of polyka­riocytosis induced by BLV in mixed cultures: Specifcity, mechanism and aplication to the diagnosis of BLV infection in cattle. Ann. Rech. Vet. 9: 721-728.
FERRER, J., C. CABRADILLA, P. GUPTA. 1981. Use of a feline cell line in the sincytya infectivity assay for the detection of bovine leukemia virus infection in cattle. Am. J. Vet. Res. 429-14.
GRAVES, D., J. FERRER. 1976. 'In vitro'. Transmission and propagation of the bovine leukemia virus in monolayer cell cultures. Cancer Res. 36: 4152-4159.
GUILLEMAIN, B., R. MAMOUN, T. ASTEIR, J. DUPLAN. 1984. Specificity and mechanisms of early polykariocytosis indu­ced by different isolates of the bovine leukemia virus. Fifth Int. Symp. Bovine Leukosis. CEE, Luxembourg, 117-139.
ITOHARA, S., I. TAKATORI. 1982. Syncytia infectivity assay of bovine leukemia virus. Anim. Health. 22: 147-153.
KETTMAN, R., D. COUEZ, F. CRESPEAU, J. DESCHAMPS, M. MAMMERICKX, C. OLSON, L. ONUMA, A. PARODI, M. VAN DER MAATEN, A. BURNY. 1984. Bovine leukemia provirus is not integrated in a narrow domain of the host DNA. Fifth Int. Symp. Bovine Leukosis, CEE, Luxembourg, 18-28.
MONTES, G., G. VILLOUTA, P. BERRIOS, M. CELEDÓN, M. COR­NEJO. 1988. Detección del virus de la leucosis enzoótica bovina. Av. Cs. Vet. 3: 57-59.
MOREIN, B., U. HELLSTROM, L. AXELSSON, C. JOHANSSON, S. HAMMARSTROM. 1979. Helix Pomatia A hemagglutinin, a surface marker for bovine Tlymphocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 1: 27-36.
NARANJO. J. 1988. Sistema de certificación de predios libres de leucosis bovina. Santiago, Chile, Servicio Agrícola y Gana­dero. 14 pp.
NOUGAYREDE, P., J., PELLER, C. QUEMENTEL, J. BOISSEAU. 198 1. Enzootic bovine leukosis preparation of an antigen for the agar gel immunodifussion test, statistical comparation with other antigenes. Vet. Microbiology 6: 247-257.
REINHARDT, G., V. HOCHSTEIN-MINTZEL, S. RIEDEMANN, H. LEAL, M. NIEDDA. 1988. Estudio serológico de la leucosis enzoótica bovina en un predio de la provincia de Valdivia y su relación con parámetros productivos y reproductivos, J. Vet. Med. B. 35: 178-185.
ROSENTHAL, S., D. LIEBSCHER, R. KETTMANN, Chr. POHLMANN, G. NYAKATURA, U. NOTZEL, B. DRESCHER, J. WINKLER, V. HAHN, A. BURNY. 1988. Preliminary structural of analysis of BLV-plasmid recombinants. Gene 13: 233-238.
SCHULZ, L., R. OJEDA, R. GRUBLER. 1962. La leucosis de los bivinos y su importancia en el país. Rev. Soc. Med. Vet., Chile 12: 17-18.
VAN DER MAATEN, M., J. MILLER, A. BOOTHE. 1974. Replica­ting type-C virus particles in monolayer cell cultures of tissues from cattle with lymphosarcoma. J. Nat. Cancer. Inst. 52: 491-497.
VILLOUTA, G., M. JARA, J. CORREA, M. LAGUNAS. 1984. Pobla­ciones linfocitarias en sangre periférica de bovinos normales y con leucosis linfática enzoótica bovina. Zentralbl. Vet. B. 31: 241-247.
VILLOUTA, G., P. SEGOVIA, G. MONTES, Y. DURÁN. 1990. Duráción y títulos de anticuerpos calostrales antivirus leuce­mia bovina y transmisión natural de la infección en terneras de un predio de la Región Metropolitana, Chile. Av. Cs. Vet. 5: 114-118.

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