- Presencia de rotavirus en cerdos lactantes con síndrome diarreico
Av. Cs. Vet 4(2). 1989
DOI: 10.5354/0716-260X.1989.4550
1 Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 2 Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 3 Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 4 Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile
Se pesquisó la presencia de rotavirus en 100 muestras de contenido intestinal de cerdos lactantes que presentaban o habían muerto con signos de síndrome diarreico agudo, provenientes de 26 predios de explotación porcina de la Región Metropolitana; utilizándose la técnica inmunoenzimática ELISA (Rotazyme II, Abbott), microscopía electrónica, electroforesis en gel de poliacrilamida (Rotagel ISP), e inoculación en cultivos celulares de riñón porcino (PK–15) y de mono (MA–104).
Mediante ELISA se detectaron antígenos rotavirales en 23 muestras; 18 muestras fueron consideradas como sospechosas y 59 negativas. En microscopía electrónica se observaron en 14 muestras partículas virales semejantes a rotavirus con morfología icosaédrica, doble cápside y un diámetro aproximado entre 60 y 70 nm. El estudio electroforético reveló la presencia de 11 bandas en cuatro muestras. En los cultivos celulares PK–15 y MA–104 no se detectó ECP atribuible a virus entéricos y rotavirus, respectivamente.
Palabras claves: Rotavirus, cerdos lactantes, diarrea.
Abstract
The presence of rotavirus was studied in 100 samples of intestinal content of pigs with history or showing signs of diarrheic syndrome, from the Metropolitan Region, Chile, by means of the ELISA test (Rotazyme 11, Abbott), electron microscopy, polyactylamide gel electrophoresis and inoculation in PK–15 and MA–104 cells.
Twenty three positive samples were detected by the ELISA test, 18 were suspicious and 59 were negatives. The electron microscopy showed in 14 samples, icosahedrical particles with rotavirus wheel–like morphology and am estimated diameter of 60 to 70 nm. Using polyacrylamide gel electrophoresis only four samples showed 11 bands characteristic pattern of rotavirus RNA. It was notfound CPE in PK–15 or MA–104 inoculated with faecal materials.
Key words: Rotavirus, piglet, diarrhea.
Introducción
En el cerdo lactante la diarrea constituye una de las mayores causas de mortalidad y disminución de peso; según Bohl (1983) este síndrome se presenta principalmente durante el período neonatal, entre los 7 y 28 días de edad, y después del destete.
En la diarrea neonatal, Escherichia coli es el patógeno más común junto al virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, coccidia y Clostridium perfringens; siendo la falta de adecuados niveles de inmunidad pasiva el principal factor predisponente. Entre los 7 y 28 días de edad, la diarrea estaría asociada a una disminución de la inmunidad pasiva, alta exposición a enteropatógenos y estrés ambiental. Después del destete, los principales agentes infecciosos involucrados son E. coli, virus de la gastroenteritis transmisible y rotavirus; considerándose que los factores predisponentes más importantes serían los ambientales y la dieta (Bohi, 1983).
Entre los virus porcinos que producen infección de los enterocitos y atrofia de las vellosidades se describen el virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, pararrotavirus, virus de la diarrea epidémica porcina, adenovirus y calicivirus (Pensaert, 1984).
Bohl y col. (1982) plantean que la infección rotaviral se desplaza constantemente entre cerdos adultos y jóvenes, especialmente donde existen grandes concentraciones de animales; aceptándose que la permanencia de los rotavirus en un criadero es favorecida por su alta resistencia en el medio ambiente.
La infección por rotavirus se caracteriza por una inflamación aguda del intestino delgado, vómitos y diarrea acompañada por una rápida pérdida de peso (10 a 15%) de los lechones y una tasa de mortalidad de hasta un 100% debido a la pérdida de agua y electrólitos, lo que provoca deshidratación, acidosis y shock (Pensaert, 1984).
Los rotavirus fueron inicialmente asociados a diarreas del cerdo, cuando Lecee y col. (1976) y Woode y col. (1976) describieron virus semejantes a reovirus en casos de diarreas acompañadas de vómitos, deshidratación y muerte. Woode y col. (1976) sugieren la denominación de rotavirus para los virus, semejantes a reovirus, encontrados en casos de gastroenteritis aguda en niños, terneros, cerdos, ratones lactantes y potrillos, a base de su morfología y comunidad antigénica.
Chasey y Lucas, en 1977, demuestran por inmunofluorescencia y microscopía electrónica la presencia de rotavirus en cerdos infectados experimentalmente.
Los rotavirus porcinos han sido clasificados, mediante seroneutralización, en los serotipos 4 (SB–2, Gottfried y SBIA) y 5 (OSU y SB–IA) (Pensaert, 1984). De acuerdo a sus electroferotipos, los rotavirus porcinos se han agrupado principalmente en Grupo B que incluye a las cepas NIRD1 y Ohio, y en el Grupo C que incluye el parárrotávirus porcino cepa Cowden.
Theil y col. (1978) describen la patogénesis del rotavirus porcino en cerdos gnotobióticos, los que luego de ser inoculados presentaban diarrea, anorexia, depresión y vómitos ocasionales; encontrándose atrofia de las vellosidades intestinales como la lesión más frecuente.
Los rotavirus han sido implicados como causa de diarrea en la mayoría de los países donde se explota el cerdo, encontrándose prevalencia entre 14 y 91 % (Reinhardt y col., 1986).
En Argentina, Innocente y col. (1983) detectaron rotavirus en casos de diarreas en cerdos por medio de la prueba de ELISA, y recientemente Ruiz y col. (1988) detectan rotavirus, mediante la prueba de rotaforesis, en 63 de 83 cerdos lactantes. Por otra parte, Mattion y col. (1988) detectan rotavirus, mediante ELISA y electroforesis en gel de poliacrilamida, en 60 de 156 muestras fecales provenientes de cerdos de 9 criaderos de Buenos Aires y Córdoba, clasificando 55 cepas en el Grupo A.
En Chile, en 1983, Rivas estudió mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, 349 muestras de heces de lechones lactantes, correspondiendo 290 a casos diarreicos y 59 a animales sanos provenientes de dos criaderos industriales de ciclo completo de la Región Metropolitana, detectando 50 muestras positivas (14,3%) y 299 negativas (85,7%). De las muestras positivas, 47 correspondían a casos de diarrea (16,2%) y 3 a animales sanos (5,1 %), estableciéndose una diferencia significativa entre ellos. Además, se determinaron 10 electroferotipos de rotavirus y 2 electroferotipos de pararrotavirus. Posteriormente en 1986, Reinhardt y col., realizaron una prospección a nivel de planteles porcinos de la zona Sur, recolectando 85 muestras fecales de lechones, 68 con síntomas de diarrea y 17 clínicamente sanos, obteniendo 10 muestras positivas correspondientes a animales. enfermos.
El objetivo de este estudio es conocer la participación de rotavirus en casos de síndrome diarreico agudo en cerdos lactantes provenientes de diferentes criaderos del área central de Chile.
 | Proyecto financiado por Ministerio de Agricultura. Fundación Fondo de Investigación Agropecuaria. |
Material y métodos
Se estudiaron 100 muestras de contenido intestinal de cerdos lactantes, mediante la técnica inmunoen zimática ELISA, microscopía electrónica, electroforesis en gel de poliacrilamida e inoculación en cultivos celulares de riñón porcino (PK–15) y de mono (MA–104). Las muestras provenían de animales que presentaban o habían muerto con signos de síndrome diarreico agudo (70 vivos y 30 muertos), pertenecientes a 26 predios de explotación porcina ubicados en la Región Metropolitana y sus alrededores, los que fueron seleccionados considerando una existencia mayor de 50 madres.
Las muestras fueron diluidas en tampón fosfato pH 7,4 y centrifugadas a 1.200 y 8.000 g durante 15 y 20 minutos, respectivamente, manteniéndose los sobrenadantes a 25°C hasta su uso (Berríos y col., 1988).
La prueba de ELISA se realizó con el 'kit' comercial Rotazyme II Abbott. Los resultados se leyeron en forma visual con una carta de colores, interpretándose como positivas las muestras con 2, 3 y 4 (+), sospechosas con 1 (+), y negativas con (±) y 0 (Abbott Lab. Diagnostic Division, 1984).
El estudio ultramicroscópico se realizó selectivamente en 22 muestras positivas, 2 sospechosas y 3 negativas en ELISA, cuyos sobrenadantes fueron centrifugados a 80.000 g durante 1 hora, resuspendiéndose el 'pellet' obtenido en 0,3 ml de agua destilada; como tinción negativa se utilizó ácido fosfotúngstico al 2% y pH 6,0 (Rubenstein y Miller, 1982). La observación se realizó con un microscopio electrónico Philips EM 300.
La electroforesis de 27 muestras, 18 positivas y 9 sospechosas en ELISA, se realizó en geles de poliacrilamida ('kit' Rotagel, Instituto de Salud Pública de Chile) (Espejo y col., 1978).
Todas las muestras, diluidas 1:10; 1:50 y 1:100, se inocularon en cultivos de células PK–15, considerándose como negativas aquellas que no presentaron un efecto citopático visible, luego de 7 días de observación en dos pasajes sucesivos; solamente 18 muestras positivas en ELISA se inocularon en células MA–104, previo tratamiento con tripsina (10 μ ) (Theil y Bohl, 1980).
Resultados
En 100 muestras de contenido intestinal de cerdos lactantes que presentaban o habían muerto con signos de síndrome diarreico agudo, analizadas mediante la prueba de ELISA, se demostró la presencia de antígenos rotavirales en 23 muestras, seis con 4 (+), ocho con 3 (+) y nueve con 2 (+); siendo 18 muestras consideradas como sospechosas (1 +) y 59 negativas.
A través de microscopía electrónica solamente se observaron partículas virales, semejantes a rotavirus, en 14 muestras, 13 con positividad de 3 y 4 (+) y una con 2 (+) en ÉLISA. Las partículas visualizadas presentan una morfología icosaédrica con doble cápside y un diámetro aproximado de 60 a 70 nm (figura 1).
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| Figura 1. Microfotografía electrónica de rotavirus porcino en heces de cerdos lactantes con síndrome diarreico (130.000 X). |
El estudio electroforético en geles de poliacrilamida, reveló la presencia de 11 bandas en cuatro muestras estudiadas (figura 2).
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| Figura 2. Electroferotipo de rotavirus porcino (Rotagel ISP). |
En los cultivos celulares PK–15 no se detectó efecto citopático en los dos pasajes seriados realizados; sin embargo, la mayoría de las muestras, al ser inoculadas en diluciones 1:10 y 1:50, causó un efecto citotóxico inespecífico. En las células MA104 no se detectó efecto citopático atribuible a rotavirus.
Discusión
La detección de rotavirus en muestras de contenido intestinal de 100 cerdos lactantes confirma la presencia de estos virus en cerdos de Chile. La positividad de un 23% es superior a los valores nacionales de 14,3% (Rivas, 1982) y 11,8% (Reinhart y col., 1986), debido probablemente a que en este estudio los animales se escogieron únicamente a base de la presentación de diarrea en el momento de obtener la muestra.
Coincidiendo con lo descrito por otros autores, rotavirus se encontró generalmente junto a otros agentes citados como participantes en los casos de diarrea del cerdo lactante, es así como en cuatro oportunidades se detectó junto a E. coli enteropatógena, en otras cuatro junto a Campylobacter coli, y en seis con ambas bacterias. Sólo en 4 cerdos lactantes se encontró rotavirus como único agente (Smith y col., 1986). Además de rotavirus, en los 100 casos de diarrea se aislaron C. coli (31), E. coli (24), virus peste porcina (8), coccidias (5), salmonella (2) y Campylobacter yeyuni (2) (Pinochet, 1986).
Por otra parte, es importante señalar que en 8 cerdos lactantes de un total de 26, se detectó la presencia del virus de la peste porcina clásica por inmunofluorescencia directa (Abalos y col., 1988).
En relación a la presencia de rotavirus en los 26 predios en estudio, éstos se encontraron en 12 de ellos, participando en 23 de los 59 brotes (Pinochet, 1986). Cabe señalar que rotavirus se encontró con mayor frecuencia en cerdos de 2 a 21 días de edad, lo que corrobora lo señalado por otros autores (Pensaert, 1984).
La observación de partículas virales semejantes a rotavirus, tanto en tamaño, 60 a 70 nm de diámetro aproximado, como en su morfología en que los capsómeros de la cápside se disponen en forma radiada, ratifica el hallazgo de rotavirus en cerdos lactantes mediante ELISA. Cabe señalar que se encontraron partículas rotavirales preferentemente en muestras con 3 y 4 (+) en ELISA, hecho descrito anteriormente (Frías y col., 1985; Berríos y col., 1987).
La presencia de 11 bandas en cuatro muestras estudiadas por electroforesis en geles de poliacrilamida, confirma la presencia de electroferotipos rotavirales en heces de cerdos lactantes.
La prueba de ELISA utilizada, de alta sensibilidad y especificidad, detectó la presencia de rotavirus en diversos grados de positividad, llamando la atención la alta proporción de sospechosos (1+) encontrados.
La inoculación de las muestras fecales en cultivos celulares PK–15, incluida en este estudio como un antecedente complementario, no ofreció resultados positivos al aislamiento viral debido posiblemente a la escasa cantidad de virus intestinales presentes en las muestras o al marcado efecto citotóxico inespecífico observado, situación que probablemente es responsable del no aislamiento de rotavirus en células MA–104.
Considerando estos hallazgos se plantea la necesidad de estudiar los serotipos de los rotavirus porcinos detectados en Chile y conocer su potencialidad patológica. Cabe señalar que hasta el momento no se han tomado medidas específicas para el control de la enfermedad en cerdos, realizándose solamente tratamientos generales o sintomáticos.
Referencias
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