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martes, 1 de mayo de 2012
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÖN DE PESTIVIRUS DE ALPACAS DE LA RM Chile 2006
Aislamiento e identificación de pestivirus obtenidos de alpacas (Lama pacos) y
llamas (Lama glama) de la Región Metropolitana, Chile#
Isolation and identification of pestiviruses in alpacas (Lama pacos) and llamas (Lama glama)
introduced to the Región Metropolitana, Chile
M O Celedón*, J Osorio, J Pizarro
Arch. Med. Vet. 38, Nº 3, 2006
correo electrónico oceledon@uchile.cl
casilla 2, correo 15, Santiago, Chile.
Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Santiago, Chile.
SUMMARY
The natural habitat for more than 90% of the domestic South American camelids (SAC) in Chile, alpaca (Lama pacos) and llama (Lama glama),
is located between 11° and 21° South latitude at 3,800 and 5,000 ms of altitude. Lately, alpacas and llamas have been introduced to other geographic
parts of the country where they are in contact with domestic ruminants, making likely infection with BVDV, present in cattle, goats and sheep. The
BVDV includes two species, BVDV genotype I (BVDV I) and BVDV genotype II (BVDV II), which along with the border disease virus (BDV) and
classical swine fever virus (CSFV) conforms the Pestivirus genus of the Flaviviridae family. This study evaluates the hypothesis that SAC introduced
to the Metropolitan Region (MR) of Chile are infected with pestiviruses. In order to perform viral isolation, samples were taken from 80 SAC (42
live alpacas, 35 live llamas, 2 dead llamas and 1 aborted foetus of llama), coming from 4 flocks suspected to be infected with pestivirus. The samples
were inoculated in primary culture of bovine foetus lung cells (free of BVDV), passing each sample 5 times, and were then analyzed by direct
immunofluorescence and indirect immunoperoxidase techniques to detect the presence of pestivirus antigens. For molecular characterization, a
fragment of the 5’-untranslated region (5’-UTR) of RNA of the isolates was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
and treated with restriction enzymes Pst I, Bgl I and Xho I in order to identify species of viruses. The results show that 18 SAC (10 alpacas and 8
llamas from the 4 studied flocks), were infected with pestivirus. All isolates were non cytopathogenic. BVDV I was isolated from 6 alpacas while
BVDV II was isolated from 4 alpacas and 8 llamas . The viral samples were obtained from 8 healthy alpacas, 2 alpacas with abortion, 5 healthy
llamas, 2 llamas with abortion and 1 dead llama without clinical history. It is concluded that alpacas and llamas from the MR of Chile are infected
with BVDV I and BVDV II.
Palabras clave: Camélidos, sudamericanos, DVB, pestivirus.
Key words: South American camelids, pestiviruses, bovine viral diarrhoea virus.
INTRODUCCION
El género Pestivirus, perteneciente a la familia
Flaviviridae, incluye al virus de la diarrea viral bovina
(VDVB), al virus de la enfermedad de la frontera (VEF)
y al virus de la peste porcina clásica (VPPC). El VDVB
infecta rumiantes domésticos, rumiantes silvestres y cerdos;
el VEF infecta ovinos, caprinos y cerdos. El VPPC
infecta cerdos (Vilcek y Belak 1996, Walz y col 1999).
El VDVB, VEF y VPPC poseen antígenos comunes
y propios, pero sólo se define un serotipo por especie
viral, pese a que los aislados virales presentan una alta
diversidad antigénica (Corapi y col 1990, Xue y col 1990,
Paton y col 1991, Paton y col 1995ª, Ridpath y col 2000).
De acuerdo a la capacidad que tiene el virus para provocar
efectos visibles en cultivos de células in vitro, se describen
dos biotipos, citopático y no citopático (Lee y
Gillespie 1957). El análisis de diferentes regiones del
genoma y en particular de la región 5’ no traducida
(5’UTR) ha permitido clasificar los Pestivirus en 4 grupos:
VDVB genotipo I (VDVB I), VDVB genotipo II
(VDVB II), VEF y VPPC (Pellerin y col 1994, Ridpath y
col 1994, Vilcek y col 1994). Actualmente se han obtenido
nuevos aislados virales a partir de animales silvestres
y el análisis de su genoma ha llevado a postular su
inclusión como nuevas especies de pestivirus (Becher y
col 1997, Becher y col 1999, Harasawa y col 2000).
El VDVB se distribuye en la población bovina mundial
y produce, principalmente, infecciones que afectan
los aparatos digestivo y respiratorio (Baker 1987). La
infección de hembras en gestación puede producir aborto,
muerte perinatal, o el nacimiento de terneros
persistentemente infectados (Brownlie 1990). En el año
1994, en Estados Unidos de Norteamérica y en Canadá
surgió una enfermedad severa con mortalidad mayor a
un 25% que se denominó “síndrome hemorrágico” o “diarrea
viral bovina aguda severa”. En todos los casos se
aisló VDVB II (Pellerin y col 1994, Ridpath y col 1994).
El VDVB II también se ha aislado de bovinos con
248
M O CELEDON Y COL
enfermedad clínica moderada o desde animales sin síntomas
de enfermedad (Ridpath 2003).
En ovinos la infección con el VDVB I o con el VDVB
II produce signos clínicos similares a los producidos por
el VEF (Giangaspero y Harasawa 2004). En otras especies,
como cabras, rumiantes exóticos y camélidos del
viejo y nuevo mundo, los signos clínicos producidos por
el VDVB son similares a los descritos para el bovino,
pero la presentación de la enfermedad es de menor
frecuencia (Loken 1995).
En Chile el VDVB está ampliamente difundido en el
ganado bovino (Reinhardt y col 1990, Celedón y col 1996,
Celedón y col 1997ª) identificándose la presencia de los
genotipos VDVB I y VDVB II (Aguilera 2001, De Calisto
2001) en el ganado nacional, aunque no se han descrito
casos de enfermedad grave. También se ha detectado el
VDVB I en ovinos y caprinos (Müller 2003) y anticuerpos
neutralizantes para el VDVB en alpacas (Lama pacos) y
llamas (Lama glama) ubicadas en la Región Metropolitana
(RM) y en contacto con ganado doméstico. Sin embargo,
no se han pesquisado animales con anticuerpos
para el VDVB en guanacos (Lama guanicoe) de la Región
de Aysén y Magallanes ni en vicuñas (Vicugna
vicugna) de la Región de Tarapacá (Celedón y col 2001).
Debido a que algunos productos obtenidos de los
camélidos sudamericanos (CSA), como la fibra, la carne
y el cuero, muestran interesantes perspectivas de mercado,
en los últimos años se ha tratado de impulsar el desarrollo
de esta ganadería, lo que ha llevado a un aumento
en la frecuencia de transporte de animales desde el altiplano
chileno a diferentes regiones del país. El cambio
de ambiente y la posibilidad de contacto con el ganado
doméstico facilita la posibilidad de que los CSA se infecten
con el VDVB pudiendo hacer cuadros clínicos de
variada gravedad y/o servir de reservorio para las especies
susceptibles. A base de lo anterior, el objetivo de
este trabajo fue aislar e identificar pestivirus desde alpacas
y llamas introducidas en la R.M.
MATERIAL Y METODOS
Muestras. De 42 alpacas y 35 llamas vivas se tomaron
muestras de sangre, una llama murió al día siguiente de
haberse tomado la muestra. De 2 llamas adultas muertas
y de 1 feto de llama abortado se tomaron muestras de
tejidos (bazo, ganglios linfáticos, hígado, pulmón o riñón).
Todas las muestras provenían de animales entre
4 y 10 años, ubicados en 4 rebaños (A, B, C y D) de
4 comunas diferentes de la R.M. Para el rebaño A se contaba
con el antecedente de la existencia de una alpaca y
una oveja con anticuerpos para pestivirus y que las alpacas
estaban separadas de corrales de bovinos, ovinos y
caprinos por no más de tres metros; todos los animales
del predio presentaban apariencia de estar sanos. El rebaño
B estaba constituido por 200 alpacas, llamas y algunas
ovejas; se tenía el antecedente que en un período
de 9 meses había ocurrido un episodio de enfermedad
respiratoria, digestiva y abortos. De 41 hembras preñadas
26 abortaron muriendo 8 y, además, murió una hembra
que parió un mortinato (Miranda 2000); por análisis
serológico, de 32 hembras sobrevivientes, en 7 se detectaron
anticuerpos para pestivirus (Celedón y col 2001).
El rebaño C constituido por 45 llamas; en un período de
4 meses las llamas sufrieron fiebre, 6 abortaron y 5 de
ellas murieron, a la necropsia los intestinos se observaron
enrojecidos. No se detectaron animales serorreaccionantes
a pestivirus. En el rebaño D, 3 de 11 llamas presentaban
anticuerpos para pestivirus (Celedón y col
2001); 2 se encontraron muertas, sin antecedentes previos
de estar enfermas.
De la muestra de sangre sin coagular se extrajeron
plasma y leucocitos, mediante un gradiente de densidad
de Ficoll Hipaque® (densidad 1,077). De la sangre coagulada
se extrajo suero. Los fragmentos de tejidos fueron
procesados separadamente para la obtención de
inóculos. El plasma, los leucocitos, el suero y los inóculos
se conservaron a –40°C hasta ser sometidos al aislamiento
viral.
Aislamiento viral. Las células y el suero equino, previos
a ser usados en el aislamiento viral, fueron verificados
de estar libres de infección con el VDVB, por prueba de
inmunofluorescencia directa (IFD) que emplea un conjugado
fluorescente policlonal para el VDVB∗, y por prueba
de inmunoperoxidasa indirecta (IPI) que emplea un
“kit” comercial que contiene una mezcla de 4 anticuerpos
monoclonales para el VDVB#. En el aislamiento viral se
empleó el procedimiento recomendado por la OIE (2000),
con algunas modificaciones. Las muestras se inocularon
en volumen de 200 ul sobre monocapas de cultivos primarios
constituidos por, aproximadamente, 400.000 células
de pulmón fetal bovino, en su quinto pasaje, con
24 horas de crecimiento en MEM• adicionado de un 10%
de suero equino♦. Luego de incubar por 60 minutos a
37°C se agregó MEM con un 2% de suero equino. Las
células inoculadas y sin inocular (a modo de control celular)
se incubaron a 37°C por un período de 5 días efectuándose
observaciones microscópicas diarias para
controlar viabilidad celular, toxicidad de las muestras,
efecto citopático y contaminación bacteriana o fúngica.
Al quinto día se lisaron mediante 3 ciclos de congelación
y descongelación. Los cultivos celulares inoculados
con las muestras de suero, plasma y/o linfocitos
procedentes de un mismo animal, después del primer
pasaje se reunieron en una alícuota para volver a inocularse
sobre una nueva monocapa celular; las cosechas
* Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Cat. Nº PA 0205-08.
# Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Cat. Nº PA 0258.
• Medio Esencial Mínimo Eagle, GIBCO BRL Cat. Nº 41500-067.
♦ HyClone Cat. Nº SH 3007403.
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CAMELIDOS SUDAMERICANOS, DVB, PESTIVIRUS
constituidas por muestras de tejidos se continuaron
inoculando en forma separada. El proceso se repitió
5 veces.
Identificación antigénica de los aislados virales. Para
pesquisar la presencia de antígenos de pestivirus se aplicaron
las pruebas, antes descritas, de IFD en células crecidas
en laminillas dispuestas en tubo y de IPI en células
crecidas en microplacas.
Identificación genómica de los pestivirus aislados. Los
aislados virales obtenidos a partir de los camélidos, e
identificados como pestivirus por las pruebas de IFD e
IPI, se identificaron genómicamente por RT-PCR y posterior
análisis con enzimas de restricción. Para ello se
extrajo el ARN total de monocapas de células infectadas
con el virus, utilizando Trizol LS, según instrucciones
del proveedor (Invitrogen, USA). El ARN obtenido se
resuspendió en agua destilada libre de ADNasas y
ARNasas y se guardó a –20°C hasta el momento de
realizar la PCR.
La transcripción inversa del ARN y la posterior amplificación
por PCR (RT-PCR) de la región 5' UTR del
genoma de los pestivirus se realizó de acuerdo a las condiciones
optimizadas en el laboratorio de Virología de la
Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad
de Chile. Los partidores utilizados para la RTPCR
fueron 326: 5’-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-
3’ y 324: 5'-ATGCCCTTAGTAGGATAGCA-3 con ubicación
395-375 y 108-128 en el genoma de la cepa NADL
del VDVB, respectivamente (Vilcek y col 1994).
La transcripción inversa se realizó en un volumen de
10 ul, bajo las siguientes condiciones: Tris HCl 20 mM;
KCl 50 mM; ditiotreitol 5 mM; 10 pmoles de partidor
326; MgCl2 8 mM; dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0,5 mM
de cada uno; Thermoscript transcriptasa inversa (GIBCO,
USA) 1U; inhibidor de ribonucleasa Rnasa OUT
(GIBCO-BRL) 2U. La reacción se realizó por 45 minutos
a 55°C y luego se incubó 5 minutos a 90°C para
inactivar la enzima.
La PCR se realizó en un volumen de 25 ul, de acuerdo
a las siguientes condiciones: Tris HCl 20 mM, KCl
50 mM; MgCl2 2 mM; ditiotreitol 2 mM; dATP; dCTP,
dGTP, dTTP, 0,2 mM de cada uno; 2U de inhibidor de
ribonucleasa Rnasa OUT (GIBCO-BRL); partidor 324
10 pmoles; Taq polimerasa 2,5U (GIBCO) y 10 ul de la
reacción de transripción inversa. La PCR se realizó de
acuerdo al siguiente programa: desnaturación inicial a
94°C por 2 minutos, seguido de 40 ciclos de alineaciónelongación-
desnaturación del ADN a 55°C por 30 segundos,
72°C por 3 minutos y 94°C por 30 segundos.
Para el último ciclo el tiempo de extensión fue de
10 minutos. La reacción de amplificación se realizó en
un termociclador con placa difusora de calor (PTC –100.
MJ Research Inc).
Como control negativo de la reacción de RT-PCR se
utilizó el ARN total extraído a partir de monocapas de
células de pulmón fetal bovino no inoculadas con muestras
y libres de pestivirus. Como control positivo se utilizó
el ARN total extraído de monocapas de células de
pulmón fetal bovino, infectadas con la cepa NADL del
VDVB.
El fragmento de ADN amplificado se visualizó por
electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5% en tris
borato EDTA (TBE) y posterior tinción con nitrato de
plata (Espejo y Escanilla 1993). La electroforesis se
llevó a cabo a 150 Volt por 1 hora.
El fragmento amplificado del ADN se determinó por
la detección, en el gel, de una banda de 288 pb.
Genotipificación de los aislados de pestivirus. La determinación
de los genotipos de los aislados de
pestivirus obtenidos a partir de los CSA se realizó a
través del análisis de los patrones de fragmentos de
ADN, obtenidos luego de cortar el ADN sintetizado por
la RT-PCR, con las enzimas de restricción (ER) Bgl I,
Xho I y Pst I (RFLP) (cuadro 1) (Vilcek y col 1994,
Paton y col 1995b, Harpin y col 1995). Para ello, 50 ng
del fragmento de ADN amplificado se incubaron con
5U de cada una de las enzimas de restricción por 3-4
horas a 37°C. Luego, los fragmentos de ADN se separaron
por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15%
en TBE (150 volt durante 105 minutos) y se tiñeron
con nitrato de plata (Espejo y Escanilla 1993). La identificación
de los distintos tipos de pestivirus se realizó
según lo mostrado en el cuadro 1 (Vilcek y col 1994,
Paton y col 1995b, Harpin y col 1995).
RESULTADOS
En los 4 rebaños de CSA ubicados en la R.M. se detectó
presencia de animales infectados con pestivirus. En
el rebaño A, se aisló VDVB en la sangre de 5 de las 12
alpacas muestreadas; en el rebaño B, de las muestras de
sangre de 32 alpacas, en 5 se aisló pestivirus; en el rebaño
C de las muestras de sangre de 22 llamas, en 3 se
pesquisó pestivirus, en tanto que desde muestras de bazo,
ganglio linfático, hígado, pulmón y riñón obtenidos de
una llama adulta muerta y desde muestras de hígado y
pulmón obtenidos de un feto abortado, no se aisló
pestivirus; en el rebaño D, de las muestras de sangre de
11 llamas, en 4 se pesquisó pestivirus y en una muerta se
aisló pestivirus desde las muestras de bazo, ganglio,
pulmón y riñón (llama 1.064) (cuadro 2).
A excepción de la alpaca 10 del rebaño A, que entregó
un resultado negativo a la prueba de IFD y de la llama
796 del rebaño C, en que no fue posible precisar el diagnóstico
por la prueba de IFD, las muestras de los 16
camélidos restantes fueron diagnosticadas como positivas
por los dos procedimientos empleados (IFD, IPI),
sólo hubo diferencias en la cantidad de células que
250
M O CELEDON Y COL
demostraron presencia de antígenos de pestivirus y también
en la intensidad de la coloración, con respecto a una
misma prueba (cuadro 1)
En ninguno de los cultivos celulares inoculados, luego
de 5 pasajes de las muestras, se detectó presencia de
efecto citopático en las monocapas celulares, considerándose
a todos los aislados de pestivirus como virus no
citopáticos.
En todos los virus aislados se pudo amplificar por
RT-PCR la región 5’ UTR del genoma viral, confirmando
su identificación como pestivirus. Ninguno de los fragmentos
de ADN obtenidos por la RT-PCR fue digerido
simultáneamente por las enzimas de restricción Pst I, Bgl
I y Xho I, lo que indica que no habrían aislados del VPPC.
Fragmentos de ADN obtenidos por la RT-PCR a partir
de 6 aislados de pestivirus obtenidos desde alpacas, fueron
digeridos por las enzimas Pst I y Xho I, lo que identificó
a estos pestivirus como virus del genotipo I del
VDVB (VDVB-I). Por otra parte, fragmentos de ADN
obtenidos de 4 alpacas y de 8 llamas fueron digeridos
por la enzima‘Xho I y no fueron digeridos por la enzima
Pst I, identificándolos como virus del genotipo II del
VDVB (VDVB-II) (cuadro 1). No se observaron fragmentos
de ADN digeridos únicamente por la enzima
Pst I, lo que indica que ninguno de los pestivirus aquí
obtenidos corresponde a un VEF.
DISCUSION
Al aislar e identificar VDVB en CSA naturalmente
infectados, se confirma la infección por pestivirus en los
CSA de Chile, preliminarmente detectada a través de la
identificación de animales con anticuerpos que neutralizan
al VDVB (Celedón y col 2001).
El alto porcentaje de aislamientos se atribuye a que
se realizó un muestreo dirigido a rebaños de CSA donde
se sospechaba de la presencia del virus, dado por la detección
de animales serorreaccionantes al VDVB, por
antecedentes de la existencia de CSA enfermos con una
patología atribuible a pestivirus, y por estar en contacto
con ganado bovino, ovino o caprino susceptible de estar
infectado con pestivirus. En segundo término, se inoculó,
por separado, en diferentes monocapas de células,
diferentes inóculos procedentes de un mismo animal, y
en tercer lugar se aumentó el número de pasajes de la
muestra en los cultivos celulares, de 3 (que es lo recomendado
por los estándares) a 5, a base de experiencias
previas en el laboratorio, donde se ha observado que
muestras que resultan negativas al tercer pasaje se hacen
positivas al aumentar el número de pasajes a 5.
Si bien con este estudio no es posible conocer el origen
de la infección en estos CSA, es probable que lo sea
por el contacto con bovinos, lo que se sustenta en que no
se detectó presencia de anticuerpos para el VDVB en
vicuñas de la Región de Tarapacá y en guanacos de la
Región de Aysén y Magallanes (Celedón y col 2001),
Cuadro 1. Patrones de digestión de VPPC∗, VDVB I•, VDVB
II♦ y VEF# con las ER° Pst I, Bgl I y Xho I.
Digestion patterns of classical swine fever virus, bovine
viral diarrhea virus genotype I, bovine viral diarrhea virus genotype II
and border disease virus with the restriction endonucleases Pst I , Bgl I
and Xho I.
ER VPPC VDVB I VDVB II VEF
F
Pst I + + - +
Bg1 I + - - -
Xho I + + + -
+: Digestión del ADN con la enzima
- : Ausencia de digestión con la enzima.
(Vilcek y col 1994, Paton y col 1995 b, Harpin y col 1995).
∗ virus peste porcina clásica
• virus diarrea viral bovina genotipo I
♦ virus diarrea viral bovina genotipo II
# virus enfermedad de la frontera
° enzimas de restricción
Cuadro 2. Genotipos de los aislados del virus diarrea viral bovina
obtenidos de alpacas y llamas de la Región Metropolitana.
Genotypes of bovine viral diarrhea virus isolates obtained
from alpacas and llamas of the Región Metropolitana.
Rebaño Animal IFD(a) IPI(b) Genotipo
A Al 2:
Al 7:
Al 10:
Al 12:
Al 27:
+
++
-++
+
+++
+++
++
++
II
I
II
II
II
B Al 285:
Al 286: (c)
Al 288: (c)
Al 345:
Al 350:
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
IIIII
C Ll 791: (c)
Ll 794: (c)
Ll 796:
++
+++
ND
+++
++
+
II
II
II
D Ll 620: SNI
Ll 621: SNI
Ll 622: SNI
Ll 626: SNI
Ll 1064: SNI
+++
+++
+++
++
++
+++
+++
++
II
II
II
II
II
(a)Inmunofl uorescencia directa; (b)Inmunoperoxidasa indirecta; (c)con
aborto; Al alpaca; Ll llama; hembra; macho; + menos del 25%
de las células con reacción; ++ de 25 a 50% de las células con reacción;
+++ sobre el 50% de las células con reacción; ND no determinado;
SNI sexo no identifi cado.
lugares donde el ganado bovino es escaso o no existe y
el ganado ovino se maneja en forma extensiva. Otro antecedente
es que los aislados resultaron ser no citopáticos
y de genotipo I y II, lo que corresponde a las características
de los VDVB obtenidos de bovinos de diferentes
regiones del país (Meléndez y Celedón 1995, Celedón y
251
CAMELIDOS SUDAMERICANOS, DVB, PESTIVIRUS
col 1997b, Celedón y col 1998, Aguilera 2001, De Calisto
2001) y, en parte, diferente a los pestivirus obtenidos de
ovinos y caprinos en que sólo han resultado ser VDVB I,
con una proporción similar de aislados citopáticos y no
citopáticos (Müller 2003); y, por último, se describe que
el ganado bovino es la fuente de infección más probable
para los CSA (Wentz y col 2003).
La literatura señala que los pestivirus no serían
patógenos importantes para los CSA, dado que la inoculación
experimental de llamas, con aislados de VDVB,
no produjo enfermedad y la respuesta de anticuerpos
seroneutralizantes fue pobre (Wentz y col 2003). Además,
los únicos antecedentes clínicos existentes señalan
que el VDVB se ha aislado desde llamas con descarga
nasal excesiva y con diarrea (Evermann y col 1993,
Mattson 1994). Sin embargo, en este estudio, a excepción
del rebaño A, que fue el único en que no se registraban
antecedentes de enfermedad clínica al momento de
tomar las muestras, en los otros tres había fuertes sospechas
de la participación de un pestivirus. Se suma a lo
anterior el hecho de que nunca se detectó efecto citopático
en los cultivos celulares, haciendo poco probable la participación
de otros virus en los cuadros clínicos, tales
como virus herpes, virus parainfluenza o adenovirus, entre
otros, que son virus que producen efecto citopático en
los cultivos celulares.
En definitiva, se concluye que las alpacas y llamas
introducidas a la R.M. están infectadas con VDVB I y
VDVB II, desconociéndose el lugar y fuente de la infección,
pero sospechándose del rol de los bovinos en la
transmisión del virus. Además, se sospecha fuertemente
del VDVB como agente responsable de los graves
cuadros clínicos observados en estas especies.
Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren a
futuro estudiar el impacto de la infección con cepas nacionales
de pestivirus en la salud de los CSA y, además,
evaluar el probable rol de los CSA como especies
reservorio del virus, tanto para rumiantes domésticos
como silvestres.
RESUMEN
El ambiente natural para más del 90% de las alpacas (Lama pacos)
y llamas (Lama glama), camélidos sudamericanos (CSA) domésticos
de Chile, se ubica entre los 11° y 21° latitud sur a 3.800 y 5.000 m de
altitud. En el último tiempo las alpacas y las llamas han sido
introducidas en otros lugares geográficos del país, donde toman
contacto con rumiantes domésticos, facilitándose la infección con el
virus diarrea viral bovina (VDVB) que está presente en bovinos, ovinos
y caprinos de Chile. El VDVB incluye a dos especies, VDVB genotipo
I y VDVB genotipo II, que junto con el virus de la enfermedad de la
frontera (VEF) y el virus de la peste porcina clásica (PPC) conforman
el género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Este estudio evalúa la
hipótesis que los CSA introducidos en la Región Metropolitana (R.M.)
de Chile están infectados con pestivirus. Para hacer el aislamiento viral
se tomaron muestras de 80 CSA de la RM, 42 alpacas y 35 llamas
vivas, 2 llamas muertas y un feto abortado provenientes de 4 rebaños
sospechosos de estar infectados con pestivirus. Las muestras fueron
inoculadas en cultivos celulares primarios de pulmón fetal bovino (libre
de VDVB), subcultivando por 5 veces cada muestra. Para detectar
antígenos de pestivirus, las células con las muestras fueron analizadas
por prueba de inmunofluorescencia directa y de inmunoperoxidasa
indirecta. Para la caracterización molecular, una fracción del fragmento
no traducido del genoma viral (5’UTR) de los aislados fue amplificado
por RT-PCR y posteriormente, para identificar las especies virales,
fue tratado con las enzimas de restricción Bgl I, Pst I y Xho I. Los
resultados muestran que 18 CSA, 10 de alpacas y 8 de llamas de los 4
rebaños estudiados estaban infectadas con pestivirus. Todos los aislados
fueron no citopáticos. En 6 alpacas se aisló VDVB I y en 4 alpacas y
8 llamas se aisló VDVB II. El virus fue obtenido desde 8 alpacas sanas,
2 alpacas con aborto, 5 llamas sanas, 2 llamas con aborto y una llama
muerta sin antecedentes de enfermedad clínica. Se concluye que alpacas
y llamas ubicadas en 4 rebaños de la R.M. se encuentran infectados
con el VDVB genotipo I y con el VDVB genotipo II.
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