BACTERIOFAGOS EN GALLINAS C. BORIE ET AL 2011

Uso de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con Salmonella enterica serotipo Enteritidis: prevención de la colonización intestinal y reproductiva # Bacteriophage use in laying hens infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis: prevention of intestinal and reproductive colonization Arch. med. vet. vol.43 no.1 Valdivia 2011 C Borie a*, C Hauva a, J Quiroga a, V Bravo a, ML Sánchez a, MA Morales a, P Retamal a, J Retamales b, J Robeson b a Departamento de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile. b Laboratorio de Bacteriología, Instituto de Biología, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. # Proyecto Fondecyt 1080291. * Casilla 2 Correo 15 La Granja, Santiago, Chile; cborie@uchile.cl. SUMMARY Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE) remains an important enteropathogen in the poultry industry and public health. Due to the limited effectiveness of control measures, lytic bacteriophages have shown a potential use as biocontrollers of SE in birds. The aim of this study was to determine the effectiveness of prophylactic therapy with phages to control intestinal and reproductive tract colonization of SE in laying hens. 22-week old Hy-Line Brown hens free of Salmonella, were treated with a mixture of three bacteriophages (1011 PFU/dose/phage) and challenged with 2.4 x 108 CFU of SE, 24 hours post phage treatment. On day 10 post challenge, hens were euthanatized, and individual samples of cecum, ovary and oviduct, were analyzed using qualitative and quantitative bacteriology. Eggs laid during the experience were collected and processed to detect SE. The incidence of Salmonella in ceca was similar between positive control and treated groups (96.67%) and cecal bacterial counts did not present significant differences between them (P > 0.05). In reproductive tissues, phagetherapy was able to slightly reduce the SE count in the ovary (P < 0.05), but not in oviducts (P > 0.05). This lytic activity of phages observed in ovaric tissue, encourages further efforts to elucidate the real contribution of bacteriophages as SE biocontrollers in laying hens. Key words: Salmonella, prevention, bacteriophages, laying hens, poultry. RESUMEN Salmonella enterica serotipo Enteritidis (SE) continúa siendo un importante enteropatógeno para la industria avícola y para la Salud Pública. Debido a la limitada efectividad de las medidas de control, los bacteriófagos líticos han mostrado un uso potencial como biocontroladores de SE en aves. El propósito de este estudio fue determinar la efectividad de una terapia profiláctica con fagos para el control de la colonización de SE en el tracto intestinal y reproductivo de gallinas de postura. Gallinas Hy-Line Brown, de 22 semanas de edad, libres de Salmonella, fueron tratadas con una mezcla de tres bacteriófagos (1011 UFP/dosis/fago) y desafiadas con 2,4 x 108 UFC de SE, veinticuatro horas postratamiento. Al día 10 postdesafío, las gallinas se sometieron a eutanasia, obteniéndose muestras individuales de ciegos, ovario y oviducto, las cuales fueron analizadas por bacteriología cualitativa y cuantitativa. Se recolectaron los huevos puestos durante la experiencia y se procesaron para detectar SE. La proporción de Salmonella Enteritidis en los ciegos fue similar entre los grupos control positivo y tratado (96,67%) y el recuento bacteriano cecal tampoco presentó diferencias significativas (P > 0,05). En los tejidos reproductivos, la administración de fagos no disminuyó la incidencia de infección (P > 0,05), pero fue capaz de reducir levemente los recuentos de SE en ovario (P < 0,05), aunque no en oviducto (P > 0,05). La actividad lítica de los fagos demostrada en tejido ovárico, aunque escasa, sugiere realizar mayores esfuerzos para dilucidar la real contribución de los bacteriófagos como biocontroladores de SE en gallinas de postura. Palabras clave: Salmonella, prevención, bacteriófagos, gallinas de postura, aves. INTRODUCCIÓN Las infecciones por Salmonella spp corresponden a una enfermedad transmitida por alimentos, de fuerte impacto en la salud pública. En la Unión Europea, durante el año 2008, la salmonelosis fue la segunda enfermedad zoonótica más frecuente, donde S. enterica serotipo Enteritidis (SE) fue uno de los serotipos más prevalentes (EFSA 2010). Una situación similar se notificó en Estados Unidos de Norteamérica durante el año 2009 (MMWR 2010). En Chile, en el año 2006 se incrementó en un 300% el número de casos confirmados de salmonelosis (2.219 casos) respecto al año 2000, correspondiendo en el 50% de los casos al serotipo S. Enteritidis (Figueroa 2007). De la misma forma se observó un aumento en el número de hallazgos de Salmonella spp en mataderos de aves, de 37 en el año 2004 a 74 en el año 2006 (Figueroa 2007). Entre los alimentos más frecuentemente asociados se encuentran los derivados de la industria avícola, especialmente el consumo de huevos y sus derivados (Gast 2007). En Chile, entre los años 1975 y 1996, un 38,2% de los aislados alimentarios de Salmonella Enteritidis se detectaron en alimentos que contenían huevo (tortas, mayonesa), mientras que sólo un 6,4% de ellos se detectó en alimentos derivados de carne de ave (Prat y col 2001, Figueroa 2007). Para enfrentar este problema la industria avícola ha implementado varias medidas de control incluyendo vacunas, pre y probióticos, normas de bioseguridad y uso de antimicrobianos, entre otros (Gast 2007). Pese a lo anterior, la enfermedad aún está presente en el ser humano, situación agravada por la emergencia de multirresistencia tanto en las cepas aisladas de casos clínicos como de reservorios animales. Por esta razón, el estudio de bacteriófagos líticos ha concitado el interés en el control de Salmonella gracias a su habilidad para infectar sólo bacterias específicas, manteniéndose inocuos para la microflora intestinal y para células eucariotas. Estos virus o fagos, una vez que reconocen receptores específicos de la superficie bacteriana, inyectan su genoma, el cual se multiplica generando una nueva progenie viral; el ciclo termina con la lisis bacteriana y la liberación de la progenie viral al ambiente (Joerger 2003, Dabrowska y col 2005). Gracias a esta actividad lítica, ellos han sido exitosamente usados como herramienta terapeútica y profiláctica frente a patógenos tales como Listeria monocytogenes (Leverentz y col 2003), Campylobacter spp. (Atterbury y col 2003, Bigwood y col 2008), Escherichia coli (O'Flynn y col 2004) y Salmonella spp (Leverentz y col 2001, Modi y col 2001, Whichard y col 2003, Fiorentin y col 2005a, Higgins y col 2005). En el caso específico de Salmonella spp, la fagoterapia ha disminuido la incidencia y el recuento en intestino, así como también la invasión sistémica en pollos (Fiorentin y col 2005b, Toro y col 2005, Filho y col 2007). La aplicación profiláctica de bacteriófagos ha producido resultados promisorios. Así, utilizando una mezcla de tres fagos (108 Unidades Formadoras de Placas/dosis/fago) en pollos de 6 días de edad pretrata-dos con un probiótico (Broilact®) y luego de tres días, desafiados con SE (2,95 x 105 Unidades Formadoras de Colonias/dosis/ave), la incidencia de infección se redujo en 61,3% y el recuento promedio disminuyó en 0,36 log10 UFC/g en las aves que recibieron probiótico y fagos, valores que demuestran mayor eficiencia que lo obtenido cuando ambas terapias se administraron por separado (Borie y col 2009). Los estudios han sido realizados en pollos jóvenes y no existen publicaciones sobre el efecto de una fagoterapia en gallinas de postura, cuyos huevos son considerados alimentos de riesgo para la población humana. Este estudio tuvo como objetivo determinar la eficacia de una mezcla de bacteriófagos en la prevención de la colonización de SE en tejido reproductivo (ovario/oviducto) y ciegos de gallinas comerciales de postura. MATERIALES Y MÉTODOS AVES Se trabajó con gallinas comerciales de postura Hy-Line Brown de 22 semanas de edad negativas a Salmonella por cultivo y PCR de deposiciones y por prueba serológica de microaglutinación (Servicio Agrícola y Ganadero, Chile). Las aves fueron criadas y manejadas siguiendo las recomendaciones de los Comité de Bioética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y recibieron alimento sin antimicrobianos y agua ad libitum. CEPA DESAFÍO Se utilizó una cepa de SE aislada de “pool” de órganos (hígado, bazo y corazón) de una gallina reproductora. Se seleccionó, en el laboratorio, una mutante espontánea resistente a ácido nalidíxico y rifampicina (nalR rifR). AISLAMIENTO, PROPAGACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIÓFAGOS (BP) Se seleccionaron tres bacteriófagos líticos previamente caracterizados (Santander 2003, Robeson y col 2008). En breve, 1 mL de agua de alcantarillado de un plantel avícola de la V Región (zona central de Chile) fue mezclado con 10 mL de caldo Luria Bertani (LB, Difco) con rifampicina (100 µg/mL, Arlab) y con 0,5 mL de un cultivo en fase exponencial de crecimiento de SE ATCC 13076 (mutante rifampicina resistente), incubando esta mezcla en agitación a 37 ºC por 24 horas. Un mL fue centrifugado a 9.300 g por 5 minutos y el sobrenadante fue tratado con cloroformo y posteriormente sembrado en una placa con desarrollo de SE ATCC 13076 (método de la doble capa de agar). Luego de 24 horas a 37 ºC se purificaron las placas líticas existentes. Se prepararon stocks de bacteriófagos mediante propagación de los fagos purificados en caldo LB con SE ATCC 13076. Este método produjo stocks de fagos con un título > a 1012 UFP. Cada fago fue administrado vía oral forzada (intraesofágico), suspendido en agua destilada para alcanzar una multiplicidad de infección (MOI) de 103 UFP. DISEÑO EXPERIMENTAL Se trabajó con 80 aves de 18 semanas de edad, separadas en cuatro grupos: el grupo 1 constituido por 10 aves que no recibieron terapia ni infección con SE (control negativo), el grupo 2 con 30 aves que recibieron sólo SE (control positivo), el grupo 3 con 10 aves que sólo recibieron bacteriófagos y el grupo 4 con 30 gallinas que fueron tratadas con fagos e infectadas con SE. Los cuatro grupos se mantuvieron en salas experimentales separadas, atendidas por personal exclusivo para evitar contaminación entre ellos. A las 22 semanas de edad, las 10 aves del grupo 3 (sólo BP) y las 30 aves del grupo 4 (BP +SE) recibieron por vía oral forzada (intraesofágico) la mezcla de bacteriófagos (1011 UFP/dosis/fago) durante tres días consecutivos. Veinticuatro horas más tarde, las 30 aves del grupo 2 (sólo SE) y las 30 aves del grupo 4 fueron desafiadas por vía oral forzada (intraesofágico) con una Dosis Mínima Infectante (DMI) (2,4 x 108 UFC) de SE nalR rifRsuspendida en 3 mL de agua peptonada fosfatada (Oxoid). Diez días postdesafío, todos los grupos fueron sometidos a eutanasia con T61 (Shering Ploug Animal Health) (AVMA, 2001), obteniendo muestras individuales de ciegos, ovarios y oviductos para análisis de bacteriología cualitativa y cuantitativa. Adicionalmente, en los grupos 2 y 4 se procesaron todos los huevos puestos durante la experiencia (10 días) para la detección de SE, considerando un pool de 10 huevos. BACTERIOLOGÍA Cada muestra de ciego, ovario y oviducto fue pesada y colocada en una bolsa plástica estéril (Whirl Pak, Nasco®) adicionada de caldo Rapapport-Vassiliadis (RV, Difco) en razón 1:10. Una vez trituradas y homogeneizadas (un mL fue separado para bacteriología cuantitativa), las muestras se incubaron a 37 ºC por 72 horas, sembrando cada 24 horas en placas de agar XLD (Difco) adicionado de rifampicina y ácido nalidíxico (20 µg /mL de cada uno) e incubadas a 37 ºC por 24 horas. Las colonias sospechosas se confirmaron con suero anti O-Salmonella poly A-I y Vi (Difco). Las muestras negativas fueron procesadas por PCR para la detección genómica de SE, de acuerdo a metodología implementada y descrita previamente (Borie y col 2008). Los huevos se procesaron como “pool”, con un máximo de 10 unidades/”pool”/grupo. Se consideró un animal positivo cuando se detectó SE al menos en una de sus tres muestras (ciegos, ovario, oviducto). Para la bacteriología cuantitativa, un mL de las muestras suspendidas en caldo RV sin incubar fueron diluidas al décimo en agua peptonada fosfatada (Oxoid), sembrando en superficie 100 µL sobre agar XLD adicionado de ácido nalidíxico y rifampicina. Las placas se incubaron a 37 ºC por 24 horas, procediendo a contar las unidades formadoras de colonias (UFC). ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados de la bacteriología cualitativa fueron expresados como porcentaje de aves infectadas (aves positivas a SE) y las diferencias entre los grupos experimentales (2 y 4) fueron determinadas por Chi cuadrado (INFOSTAT 2004). Los recuentos (UFC) de SE en ciegos y tejidos reproductivos (ovarios/oviductos) fueron transformados a unidades logarítmicas (UFC log10) y sometidos a análisis de varianza (ANOVA); las diferencias entre las medias se evaluaron por Test de Tukey (INFOSTAT 2004). Toda muestra que fue positiva en la bacteriología cualitativa pero negativa en la cuantitativa, se le asignó valor 1; por otro lado, toda muestra negativa por bacteriología cualitativa y cuantitativa se le asignó valor 0. Un valor de P < a 0,05 fue considerado con significancia estadística. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El análisis de la bacteriología cualitativa demostró que la proporción de infección cecal y de tejidos reproductivos no fue diferente (P > 0,05) entre el grupo control positivo y el grupo que recibió la mezcla de fagos (cuadro 1). En todas las muestras cecales donde se aisló SE también se detectaron fagos, a diferencia de lo observado en ovarios y oviductos, donde escasamente se aislaron bacteriófagos (datos no mostrados). En ambos grupos experimentales (grupos 2 y 4) no se detectó SE en los huevos frescos puestos durante toda la experiencia (10 días). Todas las muestras de ciegos, ovarios, oviductos y huevos que fueron negativas por bacteriología cualitativa también lo fueron por PCR (datos nos mostrados). Cuadro 1. Aislamiento de Salmonella Enteritidis desde ciegos, ovarios y oviductos de gallinas de postura experimentalmente infectadas y pretratadas con una mezcla de bacteriófagos. Isolation of Salmonella Enteritidis from cecum, ovaries and oviducts of experimentally infected laying hens pre-treated with a mixture of bacteriophages. SE: Salmonella Enteritidis, BP: bacteriófago. Los promedios de recuentos de SE en ciegos y tejidos reproductivos se observan en la figura 1. En comparación con el grupo control positivo, las aves tratadas con bacteriófagos presentaron una leve disminución de los recuentos, diferencia que fue significativa sólo en ovarios (P < 0,05). Figura 1. Recuento promedio de Salmonella Enteritidis (SE) desde tejidos de gallinas infectadas y pretratadas con bacteriófagos (BF) (*P < 0,05). Average of Salmonella Enteritidis (SE) counts from tissues of chickens experimentally infected and pre-treated with bacteriophages (BF) (*P < 0.05). No se observaron cambios de conducta ni manifestaciones clínicas sugerentes de enfermedad digestiva en los grupos experimentales, así como tampoco lesiones macroscópicas en la necropsia. Bajo el presente diseño experimental la mezcla de bacteriófagos no disminuyó la colonización cecal de SE en las gallinas de postura, situación similar a lo observado por Sklar y Joerger 2001 en pollos tratados con diferentes concentraciones de bacteriófagos y por Higgins y col 2007 en pavos tratados con bacteriófagos asociados a un antiácido. La baja eficiencia de los fagos en gallinas de postura, comparada con los buenos resultados obtenidos previamente en pollos, podría ser explicada por el bajo pH del tracto digestivo en gallinas adultas comparadas con pollos y mamíferos (Rosales 2005, Ghise 2009). Se ha demostrado que el pH ácido reduce la actividad lítica de algunos fagos (Leverentz y col 2001, Dabrowska y col 2005), efecto que puede ser revertido por la adición de antiácidos (Smith 1987, Koo y col 2001, Higgins y col 2007). Los fagos utilizados en el presente estudio mantienen un título estable entre pH 3 y 11 (Santander 2003), por lo que no se consideró usar antiácidos. Otros factores adicionales que pudieran incidir en los resultados serían: i) Viscosidad y flora bacteriana normal que actuarían como barrera mecánica, disminuyendo la probabilidad de contacto entre bacterias y fagos (Joerger 2003). ii) motilidad intestinal que disminuiría el tiempo de contacto efectivo entre bacterias y fagos (Fiorentin y col 2005b, Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007). En este estudio los fagos se administraron 72, 48 y 24 horas antes del desafío con SE, por lo que es factible que los títulos de fagos disminuyeran antes de encontrarse con la bacteria blanco. Para evitarlo, se utilizaron elevadas dosis de fagos (1011 UFP/día) en relación a la concentración de bacterias inoculadas. iii) Resistencia bacteriana a los fagos (Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007), situación que se reduce utilizando dos o más bacteriófagos (Sklar y Joerger 2001, Fiorentin y col 2005a, Toro y col 2005), como es el caso del presente estudio. La DMI utilizada para infectar las gallinas fue similar a la señalada por otros autores para gallinas adultas (Keller y col 1995, Kinde y col 2000, Gast y col 2004a, Gast y col 2004b). Esta dosis logró una elevada tasa de colonización en ciegos (> 95%) pero escasa en ovarios y oviductos (43,3% y 23,3%, respectivamente), esto último probablemente debido a la baja invasividad de la cepa. El escaso aislamiento de SE obtenido en tejidos reproductivos contrasta con lo observado por otros investigadores, donde los porcentajes de aislamiento van de 50-70% para ovarios y 37-60% para oviductos (Gast y Beard 1990, Gast y col 2004a). La invasividad de esta cepa podría mejorarse mediante pasajes en tejidos reproductivos de gallinas (Gast y col 2003). Finalmente, se puede concluir que bajo el presente diseño experimental la administración preventiva de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con SE es menos efectiva que lo descrito previamente en pollos y que, por lo tanto, mayores estudios son necesarios para definir su potencial para disminuir el riesgo en salud pública. El modelo experimental debe ser reevaluado en cuanto a la concentración de bacteriófagos (aumento de la MOI) y a la invasividad de la cepa desafío. AGRADECIMIENTOS Esta investigación fue financiada por el proyecto Fondecyt Nº 1080291. REFERENCIAS Atterbury RJ, PL Connerton, C Dodd, CE Rees, IF Connerton. 2003. Application of host-specific bacteriophages to the surface of chicken skin leads to a reduction in recovery of Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol 69, 6302-6306. [ Links ] Atterbury RJ, MA Van Bergen, F Ortiz, MA Lovell, JA Harris, A De Boer, JA Wagenaar, VM Allen, PA Barrow. 2007. 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