DETERMINACIÓN DE TÍTULOS DE ANTICUERPOS DE DOS VACUNAS COMERCIALES CONTRA INFLUENZA EQUINA, MEDIANTE LA TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN. Alejandra Carolina Jiménez Núñez 2010

DETERMINACIÓN DE TÍTULOS DE ANTICUERPOS DE DOS VACUNAS COMERCIALES CONTRA INFLUENZA EQUINA, MEDIANTE LA TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE MÉDICO VETERINARIO ALEJANDRA CAROLINA JIMÉNEZ NUÑEZ RESUMEN La Influenza Equina es una enfermedad de origen respiratorio, de denuncia obligatoria que afecta las vías superiores del caballo; es una enfermedad de aparición repentina, que provoca brotes de gran magnitud ya que tiene una alta morbilidad, de casi un 100%. El primer brote en Chile se presentó en 1963 y desde ahí ha seguido las grandes pandemias ocurridas en el continente americano. En nuestro país las actividades hípicas deportivas se desarrollan durante todo el año, lo que implica que existe un riesgo de infección constante, por el frecuente traslado de equinos, tanto dentro como fuera del Chile. Para evitar el contagio masivo, se utiliza vacunación, ya que es la vía más sostenible y segura utilizada para enfermedades infectocontagiosas. Por esto en el siguiente estudio se determinaron los títulos de anticuerpos de dos vacunas comerciales contra Influenza Equina, una de origen extranjero y una nacional, mediante el método Micrométrico de Inhibición de la Hemoaglutinación, con muestras de sangre obtenidas de dos grupos de 10 caballos cada uno, del Club Hípico de Santiago, vacunados hace 3 meses. El conteo de títulos de anticuerpos arrojó como resultado bajos títulos de anticuerpos para ambas vacunas, dando a relucir que a los tres meses post vacuna no están inmunológicamente protegidos contra la enfermedad 1. INDICE 1- Índice…………………………………………………………………………...1-2 2- Introducción…………………………………………………………………....3-4 3- Revisión bibliográfica………………………………………………………...5-15 4- Objetivos 4.1 Objetivo general………………………………………………...……16 4.2 Objetivo específicos ……………………………....………….…....16 5- Materiales y Métodos ..……………………………………….………….......17-18 6- Resultados y Discusión………….……………………………...…………..19-28 6.1. Tabla Nº 1- Títulos de anticuerpos para Influenza equina según dos vacunas comerciales………………………………………….…………19-20 6.2. Gráfico 1: Títulos de anticuerpos obtenidos con Vacuna 1(Americana) en cada uno de los diez ejemplares………………………….……….21 6.3. Gráfico 2: Títulos de anticuerpos obtenidos con la Vacuna 2 (Chilena) en cada uno de los diez ejemplares .. ………………………………....22 6.4. Gráfico 3 y 4: Frecuencia de presentación de cada título de anticuerpo de Vacuna 1……………………………………………………………....23 6.5. Gráfico 5 y 6: Frecuencia de presentación de cada título de anticuerpo de Vacuna 2………………………………………………………………24 7- Conclusión…………………………………………………………………...29 8- Bibliografía…………………………………………….……………………30-34 9- Anexo…………………………………………………………….................35-36 9.1. Informe de Análisis……………………………………...……….35 9.2. Esquema del Virus de la Influenza Equina………….…….…..36 9.3. Placa micrométrica utilizada para la determinación de títulos de anticuerpos…………………………………………………….………36 2. INTRODUCCIÓN Las enfermedades del Aparato Respiratorio son las segundas en importancia, después de las del Aparato Músculo Esquelético en la limitación del rendimiento deportivo del caballo. Dentro de éstas, las infecciosas son de gran importancia económica, especialmente, las de origen viral; debido a su alta morbilidad afectando a un gran número de animales, llegando a producir brotes de gran magnitud. Por esto su prevención es de gran importancia y debe ser abordada bajo estrictos conocimientos sobre enfermedades infecciosas que se refieren básicamente a su diagnóstico e inmunización. En el caso de los caballos, una de las enfermedades virales respiratorias más importantes por su alta morbilidad es la Influenza Equina, que afecta a un gran número de ejemplares y se dispersa rápidamente abarcando un radio amplio de contagio. Debido a esto, se puede ocasionar importantes pérdidas económicas en un hipódromo, ya sea por el costo del tratamiento o cese de las prácticas deportivas. El primer brote en Chile fue descrito el año 1963. Luego han seguido a las grandes pandemias ocurridas en el continente Americano y algunos de estos brotes, se produjeron luego de la entrada de caballos aparentemente sanos desde Argentina. Éstos fueron diagnosticados mediante la técnica de laboratorio llamada Inhibición de la Hemoaglutinación, obteniéndose entonces altos títulos de anticuerpo coincidentes con la enfermedad. Debido a que ésta es una enfermedad altamente contagiosa, su prevención y control son fundamentales a través de la Inmunización. En el caso de la Influenza Equina se utilizan vacunas bivalentes, que contienen los dos subtipos del virus, para así crear inmunidad y disminuir la posibilidad de contagio. Actualmente en Chile se ocupan vacunas nacionales e importadas, las cuales tienen diferencias de precio notables. El presente estudio pretende determinar los títulos de anticuerpos de dos vacunas comerciales contra el virus de la Influenza, mediante la Técnica de Inhibición de la Hemoaglutinación. 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La Influenza Equina es una enfermedad infectocontagiosa de origen viral que afecta las vías respiratorias superiores del equino y se caracteriza por ser de aparición repentina y epizoótica. La Influenza Equina fue descubierta en la antigüedad, ya que fue descrita hace varios siglos por veterinarios árabes en Yemen. La enfermedad Clínica fue registrada en 1754. El primer virus de la Influenza Equina fue aislado en Checoslovaquia en 1956 durante una epizootia ocurrida en Europa del Este y se denominó A1 Praga. El segundo subtipo viral fue aislado en Miami en 1963 y se conoce como A2 Miami (Berríos y Celedon, 1992.). Es una enfermedad altamente contagiosa, de baja mortalidad (menor al 1%), pero de alta morbilidad aproximadamente 100% (Rolle y Mayer, 1984), de denuncia obligatoria y aparición brusca, presentándose en grandes brotes epizoóticos. Tiene una amplia distribución geográfica, presentándose brotes en Norte y Sur América, Europa, India, África, China y Japón donde se efectuó el último seguimiento de la OIE el 01/04/2009, sin encontrar nuevos focos. Por esto, la Oficina Internacional de Epizootias, OIE, recomienda que la importación de equinos sea de áreas libres de Influenza, exigiendo que los caballos vengan vacunados y con un refuerzo booster dado dos a ocho semanas previo al viaje (OIE, 2005). La Influenza Equina es una enfermedad de denuncia obligatoria y de notificación internacional a la OIE. En Chile se ha presentado en forma esporádica y en algunas ocasiones ha mostrado un carácter de epizoótico (Méndez y col. 2006). En Chile, el primer brote de Influenza Equina fue descrito en 1963. Los brotes han seguido a las grandes pandemias ocurridas en el continente Americano y algunos de estos brotes, se produjeron luego de la entrada de caballos aparentemente sanos desde Argentina (Berrios y Celedón, 1992). La Influenza Equina es producida por un virus de la Familia Orthomyxoviridae, estos virus están constituidos por un genoma formado por ocho segmentos de ARN de simple cadena y polaridad negativa; cada uno de estos segmentos, se encuentra unido a nucleoproteínas, dentro de la nucleocápside también se localizan las tres polimerasas virales (PB1, PB2, PA) y dos proteínas no estructurales (NS1 y NS2) que actúan como reguladoras de la trascripción, a su vez, la nucleocápside se encuentra recubierta por una envoltura lipídica que está tapizada por las proteínas de matriz y membrana. La superficie externa de estos virus, está cubierta por dos glicoproteínas con forma de Espículas: neuranimidasa y hemoaglutinina (Sguazza, 2006), siendo esta última la más abundante y es el principal antígeno contra el cual se producen anticuerpos neutralizantes del hospedador (Hidalgo y col, 1999). La HA, permite la adsorción viral a receptores celulares que contienen ácido siálico, siendo incorporado a la célula en una vesícula endoplasmática por endocitosis. La acidificación de la vesícula cambia la conformación de la HA e induce la fusión del manto viral con la membrana endocítica, liberando al citoplasma el complejo ARN - nucleoproteína (NP) - polimerasas (PA-PB1-PB2), el cual es transportado al núcleo. Allí se transcriben los 8 ARN mensajeros que originarán proteínas estructurales y no estructurales (NS1, NS2). Los nuevos viriones se ensamblan en la superficie celular y se liberan por yemación. En esta etapa, la neuraminidasa juega el papel fundamental de separar el ácido siálico de las glicoproteínas viral y celular, permitiendo la liberación del virus y evitando su aglutinación en la mucosa. En este proceso algunas células mueren por efecto del virus o de la respuesta inmune celular; otras permiten varios ciclos replicativos virales. Los diferentes subtipos de virus influenza se originan por los cambios en los antígenos de superficie H y/o N. Estas variaciones antigénicas ocurren por recombinaciones genéticas o por mutaciones puntuales, fenómenos frecuentes en estos virus debido a la fragmentación del ARN y a la baja fidelidad de la replicación viral (Luchsinger, 2009). La partícula viral posee tres componentes antigénicos, uno de ellos es la nucleoproteína, cuyas diferencias antigénicas permiten clasificarlos en tres grandes tipos (A, B y C). Los virus del tipo A son los únicos que a su vez se pueden subdividir en diferentes subtipos de acuerdo a la composición de las otras dos proteínas antigénicas: H y N. Los virus del tipo B y C son patógenos predominantemente humanos aunque también han sido aislados a partir de mamíferos marinos y cerdos respectivamente y solamente producen infecciones respiratorias muy leves (Sguazza, 2006). Presenta 2 subtipos: A equi 1 Paraga y A equi 2 Miami, que no presentan reacción antigénica cruzada, actualmente se denominan H7N7 y H3N8, ambos se han presentado en Chile. El subtipo H7N7 no se ha detectado en el mundo desde 1980. Sin embargo, en 1996 se reportó la detección de 53,9% de positivos contra el subtipo A/equino-1 en equinos no vacunados provenientes de tres regiones de Croacia, planteándose además que su circulación en la población equina es subclínica (Berrios, 2005). H3N8, por otra parte, se ha demostrado que circulan en grandes partes del mundo con exclusión de Nueva Zelandia e Islandia. Estudios recientes del subtipo H3N8 del virus de la gripe equina han demostrado que estas cepas se han ido distanciando en dos linajes evolutivos, el significado funcional de esta dicotomía filogenética ha sido examinado en dos estudios de antigenicidad del virus, que emplean a un suero policlonal y el otro que emplean anticuerpos monoclonales para estudiar la hemaglutinina (HA) de proteínas de los virus (Oxburgh y Klingeborn, 1999). El virus tiene capacidad de mutar por medio de dos tipos de cambios antigénicos. Uno produce modificaciones menores y graduales dentro del subtipo (“Drift” o deriva antigénica), con participación de la respuesta inmune. El otro genera cambios mayores bruscos (“Shift” o recombinación de alta frecuencia) a causa de recombinación genética durante una infección mixta (Pinotti y col, 2002). A pesar de su gran circulación entre los equinos, ambos subtipos mostraron relativa estabilidad antigénica en comparación con el alto grado de variabilidad serológica mostrado por los virus humanos en el mismo período de tiempo (Donatelli y col., 1991). En Chile, en el brote de Influenza Equina ocurrido en 1985 y causado por el subtipo H3N8, se comprobó la existencia de anticuerpos contra el subtipo H7N7 en animales no vacunados contra la IE y que habían presentado una enfermedad respiratoria muy suave en los últimos meses de ese año, la que había pasado casi desapercibida (Berríos, 2005) Clásicamente, la IE se propaga a través de aerosoles, ya que un caballo infectado con el virus, al toser o estornudar puede expulsar el virus a varios metros de distancia. Hay pruebas que sugieren que cuando hay una concentración de caballos enfermos en un solo lugar, podría generar una nube de virus que podría viajar kilómetros de distancia, favorecida por el viento. Virus de la gripe equina también tiene un desagradable truco: En el período previo al desarrollo de la enfermedad, conocido como “el periodo de incubación”, los caballos se observan aparentemente sanos, pero pueden eliminar el virus, y propagan enfermedad en silencio (Forrest, 2007). La enfermedad clínica se inicia con fiebre de 38.5 a 41ºC, el signo dominante es tos seca que puede persistir durante una a tres semanas. Se aprecian abundantes lágrimas, decaimiento. La inamovilidad, cansancio, rigidez para echarse o levantarse con síntomas muy comunes. La mucosa respiratoria se presenta congestiva, pudiendo detectarse Faringitis, Laringitis y Traqueítis. Ocasionalmente se detecta Bronconeumonía y Miocarditis. Los ganglios linfáticos del cuello pueden estar aumentados de volumen. El animal con Influenza también presenta dolores musculares y está decaído e inapetente. La recuperación ocurre entre 7 y 10 días. La tos puede persistir durante 2 y 3 semanas. Las complicaciones de la IE comprenden: neumonía bacteriana secundaria, pleuresía, bronquitis crónica, y enfermedad pulmonar crónica obstructiva (Poleo, 2008). La recuperación completa de los animales ocurre en 2 a 3 semanas (Hidalgo y Col, 1999), siempre y cuando no existan infecciones secundarias, de lo contrario la recuperación tarda más en concretarse, provocando grandes pérdidas. Los signos clínicos asociados al subtipo H7N7 son menos severos que los producidos por el subtipo H3N8 (Hidalgo y col, 1999), además hace largo tiempo no se ha encontrado un brote producido por este subtipo. El diagnóstico serológico tradicional se realiza por la prueba de inhibición de hemoaglutinación, en la cual los anticuerpos, presentes en el suero del animal infectado, inhibirán la capacidad del virus de aglutinar glóbulos rojos de pollo (Hidalgo y col, 1999). Para entender mejor la Hemoaglutinación se basa en algunos antígenos virales que tienen la capacidad para aglutinar eritrocitos de diversas especies, sin embargo, la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente evitan la aglutinación de los eritrocitos por tales antígenos; cuando esto ocurre se evidencia la presencia de anticuerpos. Para cuantificarlos se hacen diversas diluciones del suero con el fin de hacer una titulación y determinar el nivel de anticuerpos del paciente (Crespo, 2003). El Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación es utilizada por muchos laboratorios de diagnóstico y vigilancia para la detección de anticuerpos contra el virus de la gripe (Boliar y col, 2006). Esta prueba fue descrita por Hirts en 1942 y luego modificada por Salk en 1944. Se realiza en placas de microtitulación, mezclándose en una cantidad estandarizada de antígeno con antisuero diluidos en forma seriada; posteriormente se añaden eritrocitos para determinar la unión específica del anticuerpo a la molécula. Es una técnica extremadamente confiable, pero es requisito indispensable que los antisueros de referencia se separen basándose en las cepas vacunales, que son las cepas que circulan anualmente (Oropesa, 2003). Es bien sabido que la Prueba de Inhibición de la Hemaglutinación es afectada por los inhibidores inespecíficos presentes en el suero equino, Para esto hay varios tratamientos para eliminar estos inhibidores, como el caolín (Boliar y col, 2006) Ante la existencia de una enfermedad infecciosa en una población, el objetivo inicial es su control y posteriormente, su erradicación. Para lograr tal fin es indispensable establecer la causa, el origen, la transmisión del agente infeccioso, teniendo en cuenta las especies involucradas, vías de eliminación, resistencia en el ambiente, vectores, puertas de entrada, etc., intentando interrumpir esta cadena epidemiológica en su eslabón más vulnerable, o que más nos convenga desde el punto de vista de efectividad, practicidad o economía. (Caro y Gutiérrez, 1999). Por esto, las prácticas sanitarias de separación, eliminación, control de ingreso, además del uso de tratamientos y medidas profilácticas específicas, como la vacunación entre otras, han contribuido en reducir e incluso hacer desaparecer algunas enfermedades infecciosas, sea a niveles locales, de áreas, países, continentes e incluso mundial (Pinochet y Abalos, 1989.) Deben establecerse regímenes de desinfección regular y aislamiento de los animales infectados y períodos de cuarentena adecuados antes y después de la movilización de equinos. Sin embargo, como consecuencia de la variación antigénica de las cepas de virus de influenza, que ocurren a través de los años, deben incorporarse a la vacuna cepas de aislamiento reciente, para el control efectivo de esta enfermedad (Hidalgo y col 1999). Un estudio en el cual un grupo de caballos fueron vacunados dos veces al año, fueron expuestos al virus, demostrando que en ellos la tasa de morbilidad fue un 19%, lo que concluye que es beneficioso para los recintos deportivos (Sugita y col, 2008) El uso de vacunas contra la Influenza Equina se ha ido incentivando por las graves pérdidas económicas que esta enfermedad ha producido en la Hípica Mundial. En 1977 en nuestro país, la vacuna no se usaba. Cabe señalar que al tenerse conocimiento de la presencia de Influenza Equina en Argentina, algunos animales fueron vacunados presentando síntomas clínicos más suaves. En 1985 y 1992 la enfermedad fue menos grave que en 1977, probablemente debido al uso de vacunas; sin embargo, hay que señalar que su aplicación no ha alcanzado la intensidad que las pérdidas económicas ameritan. Al respecto es indicativo el hecho que en 1992, la enfermedad no se presentó en el Hipódromo Chile de Santiago, plantel que vacunaba regularmente (Berrios, 1995). Cabe mencionar que dicha vacuna no previene completamente la enfermedad, ya que en el caso de exposición al virus un número de éstos enferman, pero su sintomatología es leve y en algunos casos pasa de forma desapercibida, lo cual también es un problema ya que los enfermos subclínicos la diseminan de forma oculta, este es un gran debate en los países libres de Influenza Equina. (Newton y col, 2006) La vacunación por sí sola no tiene como resultado la erradicación de la enfermedad, por esto las medidas estrictas de bioseguridad y controles de circulación son sumamente necesarias (Crook y Ada, 2007), sin embargo es importante destacar que el virus muta año a año, por eso es importante controlar las gripes extrajeras, además de tener una explicación a las variantes y esto considerarlo para que se incluyan en nuevas vacunas (Imagawa y col, 1999). En Chile, están registradas y autorizadas tres vacunas bivalentes contra Influenza Equina, las cuales tienen altos niveles inmunitarios a fin de prevenir la infección viral (Méndez y col, 2006), y se recomienda que estas vacunas contengan un virus de la familia A/eq/South Africa/4/2003 (H3N8) (linaje americano) y un virus de la familia A/eq/Newmarket/2/93 (H3N8) (linaje europeo) (OIE,. 2005) Esta vacuna es inactivada, es decir está formada por el o los microorganismos completos, pero inactivados por algún método físico o químico, éstas presentan gran estabilidad y seguridad, pero dan una respuesta inmunitaria menos que las vacunas atenuadas (Sánchez, 2004) Estas vacunas deben entregar al animal vacunado una resistencia específica frente a la enfermedad, la resistencia producida por la vacuna debe ser lo más larga en el tiempo, No debe producir efectos colaterales indeseables, debe cumplir una serie de exigencias inherentes al producto mismo. (Pinochet y Abalos, 1989.) La reacción post vaccinal hace que la inmunidad del animal cree anticuerpos protectivos contra el virus de la Influenza Equina, los cuales van disminuyendo desde los 3 meses post vacunación en adelante. En Argentina durante años se exigió vacunación anual, pero las últimas investigaciones indican que la protección que ofrecen muchas vacunas disminuye al cabo de unos meses. Esto significa que, cuando está por terminar el año de vacunación, los caballos pueden volver a infectarse, aunque no muestren síntomas de la enfermedad. Estos casos son particularmente peligrosos porque pueden diseminar el virus e iniciar una epidemia (Quinlivan y col, 2005) Se han propuesto diversos protocolos de vacunación:  Howard en 1971, proponía un calendario de vacunación contra la Influenza Equina, que se iniciaba con dos dosis, como vacunación base, aplicadas con un intervalo de 3 meses; en el caso de animales mayores sin antecedentes de vacunación, este intervalo debería ser solamente de 2 semanas. En equinos menores de 2 años la revacunación debe 13 hacerse dos veces al año, bastando una sola dosis en animales mayores.  Bürki en 1977, preconizaba vacunar a potrillos mayores de 3 meses, los que presentan un sistema maduro, a la vez que carecen de anticuerpos maternos (Oirschot y col., 1991). Esta primera vacunación consistía en la aplicación de dos dosis con un intervalo de 9 semanas. La revacunación en equinos jóvenes, hasta 2 años de edad, sería en base semianual (dos veces al año), en julio y enero del Hemisferio Norte, debido principalmente a que la mayoría de los brotes de influenza equina en Europa Central, habían ocurrido entre febrero y junio, y entre agosto y octubre.  Según Liu (1986) es recomendable aplicar una Dosis de Refuerzo ("Booster") repetida con 2 a 3 meses de intervalo, seguido por vacunaciones anuales o semianuales. La primera vacunación se hacía a los 3 meses de edad, considerando la presencia de anticuerpos maternales; sin embargo, Liu y col. (1985) demuestran que los anticuerpos maternos persisten en el animal joven durante 2 a 4 semanas, considerándose como títulos de anticuerpos IHA de valor protectivo mínimo entre 16 y 32. Según estos autores pareciera que un 50% de los potrillos hijos de madres vacunadas un mes antes de la parición, estarían protegidos durante los dos primeros meses de vida.  Intervet (2008) primera vacunación a los 4 meses de edad o mayores, segunda vacunación 4 semanas después de la primera vacunación, tercera vacunación 6 meses después de la primera vacunación y luego revacunación anual (detalle de producto Intervet http://www.intervet.com.co/products/equilis__equenza_t/020_detalle_de_producto.asp). Y muchos más, pero cada recinto utiliza el protocolo que rige el país, de acuerdo a las medidas de control y prevención que la autoridad sanitaria describa. En el caso de la Influenza Equina la respuesta inmunitaria post vacunal es rápida, obteniéndose cantidades de anticuerpos protectivos antes de la semana después de la vacunación, los que alcanzan un máximo aproximadamente entre uno y dos meses después, para descender a valores mínimos entre los dos y tres meses después de la vacunación (Berríos, 1995). Tras la primera vacunación, se puede encontrar alguna reacción local en algunos animales, que puede ser provocada en el caso que la aguja pase a llevar algún vaso, por esto la vacunación es segura para su uso bajo condiciones de campo normales (Heldens y col, 2002). En nuestro país las actividades hípicas deportivas se desarrollan durante todo el año, lo que implica que el riesgo de infección es constante, por el frecuente traslado de equinos tanto dentro como fuera del país. Esto exige que los equinos estén protegidos en forma permanente contra la IE, (Keller y col, 1990) Para la entrada de equinos en Chile se exige: Que el país o zona de procedencia esté libre oficialmente de Influenza Equina; antes del embarque los animales deben ser sometidos a un periodo de aislamiento durante 30 días como mínimo, en el lugar de origen; que sean negativos a las pruebas diagnósticas y los animales deben ser vacunados con vacuna bivalente inactivada entre 6 meses a 30 días previos al embarque ; deben venir amparados con el certificado sanitario oficial otorgado al momento del embarque por la autoridad sanitaria competente del país de procedencia que acredita el cumplimiento de las exigencias sanitarias y se ajuste al modelo aprobado. A la llegada de los animales serán sometidos a una cuarentena en la Estación Cuarentenaria Pecuaria del SAG. Es importante mencionar en cuanto a los títulos que podrían conside-rarse protectivos frente a una infección de campo con virus de la IE, no existe uniformidad de criterios. Según Jaeger y Barth (1971), títulos de 20 o mayores serían protectivos. No obstante, otros autores señalan que títulos IHA protectivos estarían dados por valores de 40 (Dannacher y col., 1977). Además que la inmunidad óptima no se presenta hasta 7 ó 14 días después de la segunda vacunación. 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general Determinación de títulos de anticuerpos de dos vacunas comerciales contra influenza equina, mediante la técnica de inhibición de la hemaglutinación. . 4.2 Objetivos específicos - Determinar la respuesta inmunológica obtenida de caballos vacunados con dos tipos de vacunas comerciales contra influenza equina, mediante la obtención de títulos de anticuerpos. 5. MATERIALES Y MÉTODOS Para este estudio se utilizaron 20 caballos Fina Sangre de Carreras, entre 3 y 5 años de edad, clínicamente sanos, alojados en pesebreras del Club Hípico de Santiago, y que fueron vacunados dentro del plan normal de vacunación contra Influenza Equina de esta entidad hípica, es decir, todos vacunados hace tres meses con 2 vacunas de distinta procedencia; una nacional y otra americana. Todos los ejemplares fueron sometidos a un examen clínico donde se controló la temperatura corporal, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, tiempo llenado capilar y reflejo tusígeno negativo. Estos ejemplares fueron escogidos al azar y separados en dos grupos según la vacuna que habían recibido tres meses atrás de acuerdo al plan de vacunación de esta entidad hípica.  Grupo Nº 1 constituido por 10 ejemplares que habían recibido tres meses atrás una vacuna comercial importada Americana: Vacuna subunitaria bivalente para la inmunización activa contra la Influenza y el Tétanos en equinos. Contenía las subunidades proteicas del virus de la influenza equina A equi subtipo 1 (Praga 56); A equi subtipo 2 (Newmarket 1/93) y A equi subtipo 2 (Newmarket 2/93) más toxoide tetánico inactivado;  Grupo Nº 2 constituido por 10 ejemplares que habían recibido tres meses atrás una vacuna comercial. Vacuna viral Anti-Influenza Equina, elaborada con serotipos A equi 1 y A equi 2, cultivados en embrión de pollo, inactivados químicamente y absorbidos en hidróxido de aluminio. Las vacunas utilizadas se encontraban autorizadas y registradas por el SAG, ambas caracterizadas por sus laboratorios por su inocuidad, por una rápida inducción y por una alta respuesta inmunitaria. Las muestras se recolectaron en tubos con silicona, por punción desde la vena yugular izquierda de cada ejemplar. Estas muestras se tomaron en la mañana, entre las 8:00 y 9:00 horas, previo a que el ejemplar realice su ejercicio matinal. Una vez recolectadas, se enviaron al laboratorio de virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile en un cooler, para ser procesadas y sometidas a la técnica de inhibición de la hemoaglutinación para la determinación de los títulos de anticuerpos, donde cada suero se evaluó individualmente mediante la técnica de micrométodo recomendada para los virus de influenza humana, para lo cual los sueros fueron diluidos previamente al 1/10 en PBS, luego se realizaron diluciones seriadas al doble en PBS en volúmenes de 0,025 ml, a las que se adicionó 0,025 ml de una suspensión de antígeno conteniendo 4 UHA de virus. La mezcla suero-virus se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se adicionó 0,05 ml de glóbulos rojos al 0,5%. Paralelamente a la prueba se controlaron las UHA del antígeno, hemaglutinación inespecífica del suero y sedimentación de los glóbulos rojos. Las pruebas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La lectura del título IHA se expresa como el valor recíproco de la dilución más alta del suero capaz de inhibir completamente la hemaglutinación de 4 UHA del virus empleado en la prueba. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos a través de las muestras de sangre mediante la Técnica de Inhibición de la Hemoaglutinación, con los dos subtipos de virus, en este caso se utilizó el virus A/equi/Santiago 77 H7N7 y el virus A/equi/Santiago85 H3N8, con un valor recíproco de la dilución que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral. Los resultados obtenidos en el Laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Por tratarse de un estudio descriptivo se analizaron los resultados en base a parámetros como la moda y frecuencia de presentación de los títulos de anticuerpos. Están expresados en la siguiente tabla: 6.1. Tabla Nº 1- Títulos de anticuerpos, con un valor recíproco de la dilución que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral para Influenza equina según dos vacunas comerciales. VACUNA1 GRUPO A H7N7 H3N8 1 1:32 1: 8 2 1:32 1: 8 3 1:32 1:32 4 1:64 1:64 5 1: 8 1:8 6 1: 8 1: 8 7 1:8 1: 8 8 1:32 1: 8 9 1:16 1: 8 10 1:8 1: 8 20 VACUNA 2 GRUPO B H7N7 H3N8 11 1:16 1: 8 12 1:8 1: 8 13 11:6 1:16 14 1:16 1: 8 15 1:8 1: 8 16 1:8 1:64 17 1:8 1:16 18 1:8 1:16 19 1:8 1:32 20 1:8 1: 8 El presente corresponde a un estudio de tipo descriptivo, los resultados están expresados con el valor de mayor frecuencia en la distribución de datos, expresados gráficamente: 6.2. Gráfico 1: Títulos de anticuerpos obtenidos con vacuna 1, Americana, con un valor recíproco de la dilución que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral, en cada uno de los diez ejemplares (Grupo A), donde el eje “y” representa a los títulos de anticuerpos y el eje “x” es cada uno de los equinos (1-10): 6.3. Gráfico 2: Títulos de anticuerpos obtenidos con la vacuna 2, Chilena, con un valor recíproco de la dilución que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral, en cada uno de los diez ejemplares (Grupo B) donde el eje “y” representa a los títulos de anticuerpos y el eje “x” es cada uno de los equinos (1-10): 6.4. Gráfico 3 y 4: Frecuencia de presentación de cada título de anticuerpo con Vacuna 1 (Grupo A), representado gráficamente Grafico 3 Grafico 4 6.5. Gráfico 5 y 6: Frecuencia de presentación de cada título de anticuerpo con Vacuna 2 (Grupo B), representado gráficamente Grafico 5 Grafico 6 En los gráfico 3, 4 ,5 y 6 tienen como medida un valor recíproco de la dilución que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral Evaluando cualitativamente los resultados, se aprecia que la moda para ambas vacunas está dada por títulos bajos (1:8 y 1:16). Se puede observar en el Gráfico Nº 3 y 4, que el 40% de los ejemplares muestreados presentaban títulos de anticuerpos contra H7N7 de 1:32 y de 1:8, mientras que para H3N8, el 80% de los ejemplares presentaban títulos de 1:8. Esto indica que este grupo de animales tiene una correcta protección frente al virus H7N7 con la vacuna 1 a los tres meses post vacuna, según Dannache y col (1977) Sin embargo, el último brote de influenza que se presentó en el país en el año 2006 (Mendez y col., 2006), la cepa actuante fue la H3N8. Los títulos que dio esta vacuna para esta cepa son muy bajos y no protectivos. Como se aprecia en los Gráficos Nº 5 y 6, para la vacuna nacional, un alto porcentaje de los caballos presentaban bajos títulos de anticuerpos para ambas cepas del virus. Los títulos para el serotipo H7N7 para esta vacuna fueron sólo de 1:8 y 1:16, por lo tanto, según Dannacher y col (1977), no protegen frente a un brote de Influenza equina. Los títulos obtenidos para el serotipo H3N8 fueron igualmente bajos. Se puede concluir que después de tres meses de ser vacunados estos caballos presentan títulos de anticuerpo bajos, lo que lleva a una inmunidad baja para dicha enfermedad, por lo tanto, están en alto riesgo de contraer la enfermedad en caso que entre el virus a nuestro país. La baja cantidad de títulos de anticuerpos demostrados en este estudio nos lleva a la discusión a un cambio en el plan de vacunación utilizado o a conseguir otra vacuna que entregue mejores títulos protectivos. Esto es de cuidado ya que aun existen brotes esporádicos de la enfermedad en países donde se practica la vacunación, esto se debe a que la vacuna no tuvo buena cobertura o a que nuevas cepas surgen y se introducen (Crook y Ada, 2007). El virus influenza presenta variaciones antigénicas constantemente y de diversa importancia, conocidas como variaciones menores (drif) y mayores (shift). Las variaciones menores afectan a la hemaglutinina y conducen a la aparición de nuevas cepas; se producen por mutaciones espontáneas de genes que codifican la hemaglutinina y dan lugar a la aparición de nuevos brotes epidémicos. Las variaciones mayores son conocidas como cambios totales del antígeno H, del N o de los dos, lo que da lugar a la aparición de pandemias (Juanes y Arraosla, 2002). Se sabe, por lo mencionado anteriormente, que la vacuna no tiene por si sola la capacidad de erradicar a la enfermedad, pero sí reduce la susceptibilidad de los caballos en riesgo, además que reduce la severidad de los signos clínicos; esto último también se puede tomar como el lado negativo de esta vacuna, ya que puede enmascarar la enfermedad, produciendo el contagio de otros caballos; éste es un gran tema de discusión en países como Australia, en el cual solo se ha producido un brote y Nueva Zelanda que es un país libre de la enfermedad, según Imagawa y col (1999). Para esto se utilizan los estudios epidemiológicos basados en la presencia de títulos de anticuerpos, además éste aporta a identificar si el plan de vacunación utilizado es el adecuado para la población, de no ser así (como el presente), optar por otro plan, para obtener los mayores beneficios de esta vacuna. Este es un punto muy importante a considerar, ya que en Chile se pueden identificar tres tipos de huéspedes distintos: Los no inmunes, que son aquellos que nunca se han vacunado, ni enfermado; los inmunizados completamente, que son animales con correcto plan de vacunación o que han enfermado durante el último año, ya que la infección natural puede proveer de protección clínica por lo menos un año (Hannant y col. 1988) y por ultimo los parcialmente inmunes, que son aquellos con un plan de vacunación pobre; estos últimos son los mas importante epizoóticamente, ya que pueden enmascarar la enfermedad. En cuanto a la muestra y resultados obtenidos en este estudio, con la técnica antes descrita, al obtener bajos títulos de anticuerpos refleja que la población en cuestión es altamente susceptible a epizootias, con alta morbilidad que se traduce en enormes pérdidas económicas, por esto se debería aplicar otro plan de vacunación, así se incrementaría la cobertura inmunológica poblacional; a pesar que aumentarían la mantención de cada ejemplar drásticamente, ya que a la vez es una inversión en el caso de que se produzca algún brote, más aun cuando en estos momentos se están realizando competencia a nivel mundial, donde la entrada y salida de caballos es alta, aumentando el riesgo de contagio tanto en Chile, como en otros países, a pesar de que exista un gran control por las entidades sanitarias adoptada en cada país, en este caso el SAG, como cuarentenas, restricciones de ingreso y egreso del país; es prácticamente imposible asegurar que la infección no llegara en algún momento a nuestro país. Con las vacunas disponibles contra influenza equina, se alcanza niveles requeridos de anticuerpos para una solida protección solo por breves períodos de tiempo, ya que a los 3 meses post vacuna los títulos de anticuerpos son bajos. Esta situación hace que la población sea altamente susceptible a la posibilidad de epizootias de muy alta morbilidad. Por esto, los estudios son de gran importancia, ya que basados en los títulos de anticuerpos de la población de caballos FSC, se puede proponer un nuevo plan de vacunación, que nos proporcione inmunidad constantemente contra esta enfermedad que produce tantas pérdidas económicas cuando se instala en un recinto deportivo ecuestre. La mejor protección se producirá cuando exista una vacuna que tenga estrecha relación entre el virus de campo y la cepa utilizada para crear dicha vacuna, ya que se ha comprobado que las vacunas utilizadas han sido muy efectivas para la infección con H7N7, pero no en infecciones por H3N8, porque como esta última muta levemente, las vacunas se han quedado atrasadas ya que el virus que contienen son irrelevantes como consecuencia de la deriva antigénica. Sin embargo la evolución de la vacuna contra La Influenza Equina no ha terminado, ni terminará, por los cambios menores que presenta el virus que trae consigo la necesidad de revacunar. Sería muy interesante encontrar un antígeno estable, para que así la vacuna dure varios años y al momento de realizar este tipos de estudios encontrar títulos altos; puesto que hoy en día las fronteras, océanos y continentes dejaron de constituir un obstáculo para la entrada del virus. El seguimiento de los brotes por parte de las entidades sanitarias del país es primordial, para identificar el virus que está infectando a la población, estudiar la variabilidad antigénica de este virus, si es que la tuvo (lo que es un gran aporte a la investigación y creación de nuevas vacunas) y obviamente impedir la diseminación masiva de este; mediante aislamiento, tratamiento y disminución de contagio. Por lo mismo este estudio puede ayudar a los organismos, a la industria y a los propietarios, a tener una visión más clara en cuanto a las medidas de seguridad y educación sanitaria que deben instaurar en los recintos deportivos. Un buen programa de vacunación es parte esencial de la crianza y mantención de equinos en estos recintos. 7. CONCLUSIÓN Los títulos de anticuerpos contra Influenza Equina determinados en estos caballos FSC después de tres meses de ser vacunados fueron bajos para ambas vacunas comerciales. 8. BIBLIOGRAFÍA  BERRIOS E., PATRICIO; CELEDÓN V., MARÍA O. 1992. 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