BACTERIOFAGOS EN GALLINAS C. BORIE ET AL 2011

Uso de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con Salmonella enterica serotipo Enteritidis: prevención de la colonización intestinal y reproductiva # Bacteriophage use in laying hens infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis: prevention of intestinal and reproductive colonization Arch. med. vet. vol.43 no.1 Valdivia 2011 C Borie a*, C Hauva a, J Quiroga a, V Bravo a, ML Sánchez a, MA Morales a, P Retamal a, J Retamales b, J Robeson b a Departamento de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile. b Laboratorio de Bacteriología, Instituto de Biología, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. # Proyecto Fondecyt 1080291. * Casilla 2 Correo 15 La Granja, Santiago, Chile; cborie@uchile.cl. SUMMARY Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE) remains an important enteropathogen in the poultry industry and public health. Due to the limited effectiveness of control measures, lytic bacteriophages have shown a potential use as biocontrollers of SE in birds. The aim of this study was to determine the effectiveness of prophylactic therapy with phages to control intestinal and reproductive tract colonization of SE in laying hens. 22-week old Hy-Line Brown hens free of Salmonella, were treated with a mixture of three bacteriophages (1011 PFU/dose/phage) and challenged with 2.4 x 108 CFU of SE, 24 hours post phage treatment. On day 10 post challenge, hens were euthanatized, and individual samples of cecum, ovary and oviduct, were analyzed using qualitative and quantitative bacteriology. Eggs laid during the experience were collected and processed to detect SE. The incidence of Salmonella in ceca was similar between positive control and treated groups (96.67%) and cecal bacterial counts did not present significant differences between them (P > 0.05). In reproductive tissues, phagetherapy was able to slightly reduce the SE count in the ovary (P < 0.05), but not in oviducts (P > 0.05). This lytic activity of phages observed in ovaric tissue, encourages further efforts to elucidate the real contribution of bacteriophages as SE biocontrollers in laying hens. Key words: Salmonella, prevention, bacteriophages, laying hens, poultry. RESUMEN Salmonella enterica serotipo Enteritidis (SE) continúa siendo un importante enteropatógeno para la industria avícola y para la Salud Pública. Debido a la limitada efectividad de las medidas de control, los bacteriófagos líticos han mostrado un uso potencial como biocontroladores de SE en aves. El propósito de este estudio fue determinar la efectividad de una terapia profiláctica con fagos para el control de la colonización de SE en el tracto intestinal y reproductivo de gallinas de postura. Gallinas Hy-Line Brown, de 22 semanas de edad, libres de Salmonella, fueron tratadas con una mezcla de tres bacteriófagos (1011 UFP/dosis/fago) y desafiadas con 2,4 x 108 UFC de SE, veinticuatro horas postratamiento. Al día 10 postdesafío, las gallinas se sometieron a eutanasia, obteniéndose muestras individuales de ciegos, ovario y oviducto, las cuales fueron analizadas por bacteriología cualitativa y cuantitativa. Se recolectaron los huevos puestos durante la experiencia y se procesaron para detectar SE. La proporción de Salmonella Enteritidis en los ciegos fue similar entre los grupos control positivo y tratado (96,67%) y el recuento bacteriano cecal tampoco presentó diferencias significativas (P > 0,05). En los tejidos reproductivos, la administración de fagos no disminuyó la incidencia de infección (P > 0,05), pero fue capaz de reducir levemente los recuentos de SE en ovario (P < 0,05), aunque no en oviducto (P > 0,05). La actividad lítica de los fagos demostrada en tejido ovárico, aunque escasa, sugiere realizar mayores esfuerzos para dilucidar la real contribución de los bacteriófagos como biocontroladores de SE en gallinas de postura. Palabras clave: Salmonella, prevención, bacteriófagos, gallinas de postura, aves. INTRODUCCIÓN Las infecciones por Salmonella spp corresponden a una enfermedad transmitida por alimentos, de fuerte impacto en la salud pública. En la Unión Europea, durante el año 2008, la salmonelosis fue la segunda enfermedad zoonótica más frecuente, donde S. enterica serotipo Enteritidis (SE) fue uno de los serotipos más prevalentes (EFSA 2010). Una situación similar se notificó en Estados Unidos de Norteamérica durante el año 2009 (MMWR 2010). En Chile, en el año 2006 se incrementó en un 300% el número de casos confirmados de salmonelosis (2.219 casos) respecto al año 2000, correspondiendo en el 50% de los casos al serotipo S. Enteritidis (Figueroa 2007). De la misma forma se observó un aumento en el número de hallazgos de Salmonella spp en mataderos de aves, de 37 en el año 2004 a 74 en el año 2006 (Figueroa 2007). Entre los alimentos más frecuentemente asociados se encuentran los derivados de la industria avícola, especialmente el consumo de huevos y sus derivados (Gast 2007). En Chile, entre los años 1975 y 1996, un 38,2% de los aislados alimentarios de Salmonella Enteritidis se detectaron en alimentos que contenían huevo (tortas, mayonesa), mientras que sólo un 6,4% de ellos se detectó en alimentos derivados de carne de ave (Prat y col 2001, Figueroa 2007). Para enfrentar este problema la industria avícola ha implementado varias medidas de control incluyendo vacunas, pre y probióticos, normas de bioseguridad y uso de antimicrobianos, entre otros (Gast 2007). Pese a lo anterior, la enfermedad aún está presente en el ser humano, situación agravada por la emergencia de multirresistencia tanto en las cepas aisladas de casos clínicos como de reservorios animales. Por esta razón, el estudio de bacteriófagos líticos ha concitado el interés en el control de Salmonella gracias a su habilidad para infectar sólo bacterias específicas, manteniéndose inocuos para la microflora intestinal y para células eucariotas. Estos virus o fagos, una vez que reconocen receptores específicos de la superficie bacteriana, inyectan su genoma, el cual se multiplica generando una nueva progenie viral; el ciclo termina con la lisis bacteriana y la liberación de la progenie viral al ambiente (Joerger 2003, Dabrowska y col 2005). Gracias a esta actividad lítica, ellos han sido exitosamente usados como herramienta terapeútica y profiláctica frente a patógenos tales como Listeria monocytogenes (Leverentz y col 2003), Campylobacter spp. (Atterbury y col 2003, Bigwood y col 2008), Escherichia coli (O'Flynn y col 2004) y Salmonella spp (Leverentz y col 2001, Modi y col 2001, Whichard y col 2003, Fiorentin y col 2005a, Higgins y col 2005). En el caso específico de Salmonella spp, la fagoterapia ha disminuido la incidencia y el recuento en intestino, así como también la invasión sistémica en pollos (Fiorentin y col 2005b, Toro y col 2005, Filho y col 2007). La aplicación profiláctica de bacteriófagos ha producido resultados promisorios. Así, utilizando una mezcla de tres fagos (108 Unidades Formadoras de Placas/dosis/fago) en pollos de 6 días de edad pretrata-dos con un probiótico (Broilact®) y luego de tres días, desafiados con SE (2,95 x 105 Unidades Formadoras de Colonias/dosis/ave), la incidencia de infección se redujo en 61,3% y el recuento promedio disminuyó en 0,36 log10 UFC/g en las aves que recibieron probiótico y fagos, valores que demuestran mayor eficiencia que lo obtenido cuando ambas terapias se administraron por separado (Borie y col 2009). Los estudios han sido realizados en pollos jóvenes y no existen publicaciones sobre el efecto de una fagoterapia en gallinas de postura, cuyos huevos son considerados alimentos de riesgo para la población humana. Este estudio tuvo como objetivo determinar la eficacia de una mezcla de bacteriófagos en la prevención de la colonización de SE en tejido reproductivo (ovario/oviducto) y ciegos de gallinas comerciales de postura. MATERIALES Y MÉTODOS AVES Se trabajó con gallinas comerciales de postura Hy-Line Brown de 22 semanas de edad negativas a Salmonella por cultivo y PCR de deposiciones y por prueba serológica de microaglutinación (Servicio Agrícola y Ganadero, Chile). Las aves fueron criadas y manejadas siguiendo las recomendaciones de los Comité de Bioética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y recibieron alimento sin antimicrobianos y agua ad libitum. CEPA DESAFÍO Se utilizó una cepa de SE aislada de “pool” de órganos (hígado, bazo y corazón) de una gallina reproductora. Se seleccionó, en el laboratorio, una mutante espontánea resistente a ácido nalidíxico y rifampicina (nalR rifR). AISLAMIENTO, PROPAGACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIÓFAGOS (BP) Se seleccionaron tres bacteriófagos líticos previamente caracterizados (Santander 2003, Robeson y col 2008). En breve, 1 mL de agua de alcantarillado de un plantel avícola de la V Región (zona central de Chile) fue mezclado con 10 mL de caldo Luria Bertani (LB, Difco) con rifampicina (100 µg/mL, Arlab) y con 0,5 mL de un cultivo en fase exponencial de crecimiento de SE ATCC 13076 (mutante rifampicina resistente), incubando esta mezcla en agitación a 37 ºC por 24 horas. Un mL fue centrifugado a 9.300 g por 5 minutos y el sobrenadante fue tratado con cloroformo y posteriormente sembrado en una placa con desarrollo de SE ATCC 13076 (método de la doble capa de agar). Luego de 24 horas a 37 ºC se purificaron las placas líticas existentes. Se prepararon stocks de bacteriófagos mediante propagación de los fagos purificados en caldo LB con SE ATCC 13076. Este método produjo stocks de fagos con un título > a 1012 UFP. Cada fago fue administrado vía oral forzada (intraesofágico), suspendido en agua destilada para alcanzar una multiplicidad de infección (MOI) de 103 UFP. DISEÑO EXPERIMENTAL Se trabajó con 80 aves de 18 semanas de edad, separadas en cuatro grupos: el grupo 1 constituido por 10 aves que no recibieron terapia ni infección con SE (control negativo), el grupo 2 con 30 aves que recibieron sólo SE (control positivo), el grupo 3 con 10 aves que sólo recibieron bacteriófagos y el grupo 4 con 30 gallinas que fueron tratadas con fagos e infectadas con SE. Los cuatro grupos se mantuvieron en salas experimentales separadas, atendidas por personal exclusivo para evitar contaminación entre ellos. A las 22 semanas de edad, las 10 aves del grupo 3 (sólo BP) y las 30 aves del grupo 4 (BP +SE) recibieron por vía oral forzada (intraesofágico) la mezcla de bacteriófagos (1011 UFP/dosis/fago) durante tres días consecutivos. Veinticuatro horas más tarde, las 30 aves del grupo 2 (sólo SE) y las 30 aves del grupo 4 fueron desafiadas por vía oral forzada (intraesofágico) con una Dosis Mínima Infectante (DMI) (2,4 x 108 UFC) de SE nalR rifRsuspendida en 3 mL de agua peptonada fosfatada (Oxoid). Diez días postdesafío, todos los grupos fueron sometidos a eutanasia con T61 (Shering Ploug Animal Health) (AVMA, 2001), obteniendo muestras individuales de ciegos, ovarios y oviductos para análisis de bacteriología cualitativa y cuantitativa. Adicionalmente, en los grupos 2 y 4 se procesaron todos los huevos puestos durante la experiencia (10 días) para la detección de SE, considerando un pool de 10 huevos. BACTERIOLOGÍA Cada muestra de ciego, ovario y oviducto fue pesada y colocada en una bolsa plástica estéril (Whirl Pak, Nasco®) adicionada de caldo Rapapport-Vassiliadis (RV, Difco) en razón 1:10. Una vez trituradas y homogeneizadas (un mL fue separado para bacteriología cuantitativa), las muestras se incubaron a 37 ºC por 72 horas, sembrando cada 24 horas en placas de agar XLD (Difco) adicionado de rifampicina y ácido nalidíxico (20 µg /mL de cada uno) e incubadas a 37 ºC por 24 horas. Las colonias sospechosas se confirmaron con suero anti O-Salmonella poly A-I y Vi (Difco). Las muestras negativas fueron procesadas por PCR para la detección genómica de SE, de acuerdo a metodología implementada y descrita previamente (Borie y col 2008). Los huevos se procesaron como “pool”, con un máximo de 10 unidades/”pool”/grupo. Se consideró un animal positivo cuando se detectó SE al menos en una de sus tres muestras (ciegos, ovario, oviducto). Para la bacteriología cuantitativa, un mL de las muestras suspendidas en caldo RV sin incubar fueron diluidas al décimo en agua peptonada fosfatada (Oxoid), sembrando en superficie 100 µL sobre agar XLD adicionado de ácido nalidíxico y rifampicina. Las placas se incubaron a 37 ºC por 24 horas, procediendo a contar las unidades formadoras de colonias (UFC). ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados de la bacteriología cualitativa fueron expresados como porcentaje de aves infectadas (aves positivas a SE) y las diferencias entre los grupos experimentales (2 y 4) fueron determinadas por Chi cuadrado (INFOSTAT 2004). Los recuentos (UFC) de SE en ciegos y tejidos reproductivos (ovarios/oviductos) fueron transformados a unidades logarítmicas (UFC log10) y sometidos a análisis de varianza (ANOVA); las diferencias entre las medias se evaluaron por Test de Tukey (INFOSTAT 2004). Toda muestra que fue positiva en la bacteriología cualitativa pero negativa en la cuantitativa, se le asignó valor 1; por otro lado, toda muestra negativa por bacteriología cualitativa y cuantitativa se le asignó valor 0. Un valor de P < a 0,05 fue considerado con significancia estadística. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El análisis de la bacteriología cualitativa demostró que la proporción de infección cecal y de tejidos reproductivos no fue diferente (P > 0,05) entre el grupo control positivo y el grupo que recibió la mezcla de fagos (cuadro 1). En todas las muestras cecales donde se aisló SE también se detectaron fagos, a diferencia de lo observado en ovarios y oviductos, donde escasamente se aislaron bacteriófagos (datos no mostrados). En ambos grupos experimentales (grupos 2 y 4) no se detectó SE en los huevos frescos puestos durante toda la experiencia (10 días). Todas las muestras de ciegos, ovarios, oviductos y huevos que fueron negativas por bacteriología cualitativa también lo fueron por PCR (datos nos mostrados). Cuadro 1. Aislamiento de Salmonella Enteritidis desde ciegos, ovarios y oviductos de gallinas de postura experimentalmente infectadas y pretratadas con una mezcla de bacteriófagos. Isolation of Salmonella Enteritidis from cecum, ovaries and oviducts of experimentally infected laying hens pre-treated with a mixture of bacteriophages. SE: Salmonella Enteritidis, BP: bacteriófago. Los promedios de recuentos de SE en ciegos y tejidos reproductivos se observan en la figura 1. En comparación con el grupo control positivo, las aves tratadas con bacteriófagos presentaron una leve disminución de los recuentos, diferencia que fue significativa sólo en ovarios (P < 0,05). Figura 1. Recuento promedio de Salmonella Enteritidis (SE) desde tejidos de gallinas infectadas y pretratadas con bacteriófagos (BF) (*P < 0,05). Average of Salmonella Enteritidis (SE) counts from tissues of chickens experimentally infected and pre-treated with bacteriophages (BF) (*P < 0.05). No se observaron cambios de conducta ni manifestaciones clínicas sugerentes de enfermedad digestiva en los grupos experimentales, así como tampoco lesiones macroscópicas en la necropsia. Bajo el presente diseño experimental la mezcla de bacteriófagos no disminuyó la colonización cecal de SE en las gallinas de postura, situación similar a lo observado por Sklar y Joerger 2001 en pollos tratados con diferentes concentraciones de bacteriófagos y por Higgins y col 2007 en pavos tratados con bacteriófagos asociados a un antiácido. La baja eficiencia de los fagos en gallinas de postura, comparada con los buenos resultados obtenidos previamente en pollos, podría ser explicada por el bajo pH del tracto digestivo en gallinas adultas comparadas con pollos y mamíferos (Rosales 2005, Ghise 2009). Se ha demostrado que el pH ácido reduce la actividad lítica de algunos fagos (Leverentz y col 2001, Dabrowska y col 2005), efecto que puede ser revertido por la adición de antiácidos (Smith 1987, Koo y col 2001, Higgins y col 2007). Los fagos utilizados en el presente estudio mantienen un título estable entre pH 3 y 11 (Santander 2003), por lo que no se consideró usar antiácidos. Otros factores adicionales que pudieran incidir en los resultados serían: i) Viscosidad y flora bacteriana normal que actuarían como barrera mecánica, disminuyendo la probabilidad de contacto entre bacterias y fagos (Joerger 2003). ii) motilidad intestinal que disminuiría el tiempo de contacto efectivo entre bacterias y fagos (Fiorentin y col 2005b, Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007). En este estudio los fagos se administraron 72, 48 y 24 horas antes del desafío con SE, por lo que es factible que los títulos de fagos disminuyeran antes de encontrarse con la bacteria blanco. Para evitarlo, se utilizaron elevadas dosis de fagos (1011 UFP/día) en relación a la concentración de bacterias inoculadas. iii) Resistencia bacteriana a los fagos (Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007), situación que se reduce utilizando dos o más bacteriófagos (Sklar y Joerger 2001, Fiorentin y col 2005a, Toro y col 2005), como es el caso del presente estudio. La DMI utilizada para infectar las gallinas fue similar a la señalada por otros autores para gallinas adultas (Keller y col 1995, Kinde y col 2000, Gast y col 2004a, Gast y col 2004b). Esta dosis logró una elevada tasa de colonización en ciegos (> 95%) pero escasa en ovarios y oviductos (43,3% y 23,3%, respectivamente), esto último probablemente debido a la baja invasividad de la cepa. El escaso aislamiento de SE obtenido en tejidos reproductivos contrasta con lo observado por otros investigadores, donde los porcentajes de aislamiento van de 50-70% para ovarios y 37-60% para oviductos (Gast y Beard 1990, Gast y col 2004a). La invasividad de esta cepa podría mejorarse mediante pasajes en tejidos reproductivos de gallinas (Gast y col 2003). Finalmente, se puede concluir que bajo el presente diseño experimental la administración preventiva de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con SE es menos efectiva que lo descrito previamente en pollos y que, por lo tanto, mayores estudios son necesarios para definir su potencial para disminuir el riesgo en salud pública. El modelo experimental debe ser reevaluado en cuanto a la concentración de bacteriófagos (aumento de la MOI) y a la invasividad de la cepa desafío. AGRADECIMIENTOS Esta investigación fue financiada por el proyecto Fondecyt Nº 1080291. REFERENCIAS Atterbury RJ, PL Connerton, C Dodd, CE Rees, IF Connerton. 2003. Application of host-specific bacteriophages to the surface of chicken skin leads to a reduction in recovery of Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol 69, 6302-6306. [ Links ] Atterbury RJ, MA Van Bergen, F Ortiz, MA Lovell, JA Harris, A De Boer, JA Wagenaar, VM Allen, PA Barrow. 2007. Bacteriophage therapy to reduce salmonella colonization of broiler chickens. Appl Environ Microbiol 73, 4543-4549. [ Links ] AVMA, American Veterinary Medical Association. 2001. Report of the AVMA Panel on Euthanasia. J Am Vet Med Assoc 218, 669-696. [ Links ] Bigwood T, JA Hudson, C Billington, GV Carey-Smith, JA Heinemann. 2008. Phage inactivation of foodborne pathogens on cooked and raw meat. Food Microbiol 25, 400-406. [ Links ] Borie C, I Albala, P Sánchez, ML Sánchez, S Ramírez, C Navarro, MA Morales, AJ Retamales, J Robeson. 2008. Bacteriophage treatment reduces Salmonella colonization of infected chickens. Avian Dis 52, 64-67. [ Links ] Borie C, ML Sánchez, C Navarro, S Ramírez, MA Morales, J Retamales, J Robeson. 2009. Aerosol spray treatment with bacteriophages and competitive exclusion reduces Salmonella Enteritidis infection in chickens. Avian Dis 53, 250-254. [ Links ] Dabrowska K, K Switala-Jelen, A Opolski, B Weber-Dabrowska, A Gorski. 2005. Bacteriophage penetration in vertebrates. J App Microbiol 98, 7-13. [ Links ] EFSA, European Food Safety Authority. 2010. Community Summary Report and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and food-borne outbreaks in the European union in 2008. EFSA, Parma, Italy. [ Links ] Estrada M, S Márquez. 2005. Interacción de los factores ambientales con la respuesta del comportamiento productivo en pollos de engorde. Rev Col Cs Pec 18, 246-257. [ Links ] Figueroa J. 2007. Descripción y análisis de las acciones realizadas por los servicios públicos (salud animal y salud pública), frente a salmonelosis humana. Memoria de título, Escuela de Ciencias Veterinarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile. [ Links ] Filho R, J Higgins, S Higgins, G Gaona, A Wolfenden, G Téllez, B Hargis. 2007. Ability of bacteriophages isolated from different sources to reduce Salmonella enterica serovar Enteritidis in vitro and in vivo. Poultry Sci 86, 1904-1909. [ Links ] Fiorentin L, ND Vieira, W Barioni. 2005a. Use of lytic bacteriophages to reduce Salmonella Enteritidis in experimentally contaminated chicken cuts. Braz J Poul Sci 7, 255-260. [ Links ] Fiorentin L, ND Vieira, WJr Barioni. 2005b. Oral treatment with bacteriophages reduces the concentration of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contents of broilers. Avian Pathol 34, 258-263. [ Links ] Gast RK, CW Beard. 1990. Isolation of Salmonella enteritidis from internal organs of experimentally infected hens. Avian Dis 34, 991-993. [ Links ] Gast RK, J Guard-Petter, PS Holt. 2003. Effect of prior serial in vivo passage on the frequency of Salmonella enteritidis contamination in eggs from experimentally infected laying hens. Avian Dis 47, 633-639. [ Links ] Gast RK, J Guard-Bouldin, PS Holt. 2004a. Colonization of reproductive organs and internal contamination of eggs after experimental infection of laying hens with Salmonella heidelberg and Salmonella enteritidis. Avian Dis 48, 863-869. [ Links ] Gast RK, BW Mitchell, PS Holt. 2004b. Evaluation of culture media for detecting airborne Salmonella Enteritidis collected with an electrostatic sampling device from the environment of experimentally infected laying hens. Poultry Sci 83, 1106-1111. [ Links ] Gast RK. 2007. Serotype-specific and serotype-independent strategies for preharvest control of food-borne Salmonella in poultry. Avian Dis 51, 817-828. [ Links ] Ghise A. 2009. The pH of the Digesta in the Gastrointestinal Tract, in Laying Hens. Bull UASVM, Vet Med 66, 491-492. [ Links ] Higgins JP, SE Higgins, KL Guenther, W Huff, AM Donoghue, DJ Donoghue, BM Hargis. 2005. Use of a specific bacteriophage treatment to reduce Salmonella in poultry products. Poult Sci 84, 1141-1145. [ Links ] Higgins S, J Higgins, L Bielke, BM Hargis. 2007. Selection and application of bacteriophages for treating Salmonella enteritidis infections in poultry. Int J Poult Sci 6, 163-168. [ Links ] Joerger RD. 2003. Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages. Poultry Sci 82, 640-647. [ Links ] Keller L, C Benson, K Krotec, R Eckroade. 1995. Salmonella Enteritidis colonization of the reproductive tract and forming and freshly laid eggs of chickens. Infect Immun 63, 2443-2449. [ Links ] Kinde H, HL Shivaprasad, BM Daft, DH Read, A Ardans, R Breitmeyer, G Rajashekara, KV Nagaraja, IA Gardner. 2000. Pathologic and bacteriologic findings in 27-week-old commercial laying hens experimentally infected with Salmonella enteritidis, phage type 4. Avian Dis 44, 239-248. [ Links ] Koo J, DL Marshall, A DePaola. 2001. Antacid increases survival of Vibrio vulnificus and Vibrio vulnificus phage in a gastrointestinal model. Appl Environ Microbiol 67, 2895-2902. [ Links ] Leverentz B, WS Conway, Z Alavidze, WJ Janisiewicz, Y Fuchs, MJ Camp, E Chighladze, A Sulakvelidze. 2001. Examination of bacteriophage as a biocontrol method for Salmonella on fresh-cut fruit: a model study. J Food Protec 64, 1116-1121. [ Links ] Leverentz B, WS Conway, MJ Camp, WJ Janisiewicz, T Abuladze, M Yang, R Saftner, A Sulakvelidze. 2003. Biocontrol of Listeria monocytogenes on fresh-cut produce by treatment with lytic bacteriophages and a bacteriocin. Appl Environ Microbiol 69, 4519-4526. [ Links ] MMWR, Morbidity and Mortality Weekly Report. 2010. Preliminary FoodNet Data on the Incidence of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food-10 states, 2009. M M W R 59, 418-422. [ Links ] Modi R, Y Hirvi, A Hill, MW Griffiths. 2001. Effect of phage on survival of Salmonella enteritidis during manufacture and storage of cheddar cheese made from raw and pasteurized milk. J Food Protec 64, 927-933. [ Links ] O'Flynn G, RP Ross, GF Fitzgerald, A Coffey. 2004. Evaluation of a cocktail of three bacteriophages for biocontrol of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol 70, 3417-3424. [ Links ] Prat S, A Fernández, A Fica, J Fernández, M Alexandre, I Heitmann. 2001. Tipificación fágica de aislados de Salmonella enteritidis de muestras clínicas, alimentarias y avícolas en Chile. Rev Panam Salud Pública 9, 7-12. [ Links ] Robeson J, J Retamales, C Borie. 2008. Genomic variants of bacteriophages against Salmonella enterica serovar Enteritidis with potential application in the poultry industry. Braz J Poult Sci 10, 173-178. [ Links ] Rosales R. 2005. Broilact® hace la diferencia. En: Boehringer Ingelheim Vetmedica S.A. (eds) una alternativa inteligente: exclusión competitiva. Boehringer Ingelheim Vetmedica S.A, Guadalajara, México. [ Links ] Santander J. 2003. Aislamiento y caracterización de bacteriófagos biocontroladores de Salmonella enteritidis y su ensayo sobre Salmonella pullorum: evaluación in vivo utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans como sistema animal modelo. Tesis de Magíster, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. [ Links ] Sklar I, R Joerger. 2001. Attempts to utilize bacteriophage to combat Salmonella enterica serovar Enteritidis infections in chickens. J Food Safe 2, 15-29. [ Links ] Smith H, M Huggins, K Shaw. 1987. Factors influencing the survival and multiplication of bacteriophage in calves and in their enviromental. J Gen Microbiol 133, 1127-1135. [ Links ] Toro H, SB Price, AS McKee, FJ Hoerr, J Krehling, M Perdue, L Bauermeister. 2005. Use of bacteriophages in combination with competitive exclusion to reduce Salmonella from infected chickens. Avian Dis 49, 118-124. [ Links ] Whichard JM, N Sriranganathan, FW Pierson. 2003. Suppression of Salmonella growth by wild-type and large-plaque variants of bacteriophage Felix O1 in liquid culture and on chicken frankfurters. J Food Protec 66, 220-225. [ Links ]

VIRUS BACTERIANOS, BACTERIÓFAGOS, FAGOS

Bacteriófagos Los bacteriófagos son la entidad biológica más abundante de la biosfera, siendo considerados los antagonistas naturales de todas las bacterias del medioambiente. Estructura de un Bacteriófago Los bacteriófagos son la entidad biológica más abundante de la biosfera, siendo encontrados en todos los ambientes donde existe vida. Se caracterizan por ser pequeñas partículas virales capaces de invadir única y exclusivamente bacterias, de ahí el origen de su nombre, donde “Fago” proviene del griego “Para comer”, es decir, “Para comer bacterias”. Su estructura esta compuesta de diferentes unidades proteicas y una unidad de material genético, lo que los hacen ser partículas muy simples y que no encajan dentro de las características de un organismo vivo. Se conocen por ser los antagonistas naturales de las bacterias, provocando naturalmente entre un 20% y un 50% de la mortalidad bacteriana, ya que para poder “sobrevivir”, estas partículas virales requieren reconocer específicamente a una bacteria, ingresar a su sistema y utilizar su maquinaria celular para replicarse y poder producir copias de sí mismo. Los bacteriófagos reconocen especificamente a una especie bacteriana ya que son capaces de unirse a alguna característica única de la superficie de la bacteria, llamado “Receptor”, y así poder insertar su material genético con el que serán capaces de crear las copias de sí mismos. Se cree que los bacteriófagos poseen una especie de jeringa, con la que al estar acoplados a la bacteria, insertan su DNA a la bacteria, el cual entrará en alguno de los 2 tipos de replicación existente. Ciclos de replicación Los bacteriófagos poseen 2 ciclos de replicación conocidos como Ciclo Lítico (Virulento) y Ciclo Lisogénico (Temperado), con los cuales logran crear múltiples copias de ellos mismos. Un bacteriófago que utiliza el ciclo lisogénico, se integra al material genético de la bacteria y permanece latente hasta que alguna señal produce que se comiencen a producir copias de sí mismo. En cambio un bacteriófago que utiliza un ciclo lítico rapta la maquinaria de la bacteria para sólo producir más copias de sí mismo, provocando que la bacteria sea eliminada en el proceso. Esquema de los ciclos de replicación de un Bacteriófago. (Maura y Debarbieux, 2011) Control Biológico Mantener los microorganismos controlados sin utilizar productos químicos. Microfotografía de un Bacteriófago ingresando a una bacteria. Desde el año 1919 se considera que los bacteriofágos pueden ser utilizados como agentes de eliminación bacteriana, lo que podría tener una utilidad en diversos escenarios, donde la presencia de bacterias no es deseable. Los estudios para su uso con este tipo de enfoques se vieron truncados con el descubrimiento de los antibióticos en 1942, ya que estos eran de un mayor espectro de acción y presentaban ciertas ventajas como terapia antibacterial. El desarrollo de los tratamientos antibacterianos basados en bacteriofagos quedó entonces relegado a los países soviéticos, donde se lograron diversos avances en la materia, pero nunca lograron despegar como método antibacterial efectivo. Actualmente, el indiscriminado uso de los antibióticos y las repercusiones que han tenido en los ecosistemas ha abierto las puertas para la aparición de nuevos métodos de eliminación de bacterias, donde los bacteriofágos llevan la delantera, al presentar características únicas que los hacen candidatos ideales para reemplazar a las antiguas metodología utilizadas, presentándose como una herramienta económica, efectiva y amigable con el medioambiente. Control bacteriano en alimentos Uno de los principales objetivos en el uso de los bacteriófagos es el control de bacterias patógenas en alimentos, ya que estos están expuestos a ser contaminados mediante diversas vías o por la misma manipulación que el hombre realiza sobre ellos, es por esto que surge la necesidad de contar con un método sin origen químico, para no dañar las características propias del alimento ni provocar intoxicaciones. Los bacteriófagos son seguros Al ser virus mucha gente podría pensar que los bacteriófagos son dañinos para el ser humano y el medio ambiente, pero esto no es así. Los bacteriófagos están naturalmente diseñados para atacar única y exclusivamente bacterias, por lo que es imposible que afecten a células eucariontes, como lo son las de plantas y animales. Además, es importante considerar que son el microorganismo más abundante en el planeta, por lo que se encuentran desde el agua que tomamos, el aire que respiramos e incluso dentro del propio organismo humano, sin causar efectos adversos. Por otro lado, estos microorganismos a pesar de ser un producto biotecnológico, no son producto de ingeniería genética o transgénicos, por lo que son absolutamente ecológicos y naturales. “Biotecnólogos crean producto que combate bacteria Escherichia coli” Publicado por Diego Belmar el 14.12.2011 en En la Prensa, PHT | Comentar → Durante el día de hoy, nuestro producto Safer fue destacado por el diario electrónico Nación.cl como un nuevo e interesante emprendimiento para el control de Escherichia coli en alimentos. Tres jóvenes egresados de la escuela de Ingeniería en Biotecnología de la Universidad Andrés Bello, crearon uncomplemento denominado “Safer” cuyo propósito es evitar que la peligrosa bacteria Escherichia coli actúe en el proceso digestivo de los alimentos. El producto, que pronto será lanzado al mercado, es a base de bacteriófagos los que pretenden ser usados comocomplemento alimenticio, que permita controlar bacterias patógenas en alimentos y preparaciones de consumo humano. La idea es que sea utilizado desde hogares hasta casinos, hoteles, restaurantes y todo lugar donde se manipulen alimentos y que puedan ser foco de intoxicaciones masivas. VENTAJAS - Protege el alimento de la presencia de la Eschericia coli a lo largo del tiempo - No es tóxico- - Absolutamente seguro para las personas- - Los bacteriófagos se mantienen intactos el color, sabor y aroma de los alimentos - Tiene un origen completamente biológico y natural - Es de bajo costo Los creadores de Safer, Hans Pieringer, Diego Belmar y Nicolás Ferreira, tienen un amplio currículo como profesores, ayudantes, co autores de diversas publicaciones, magísteres y se encuentran ahora consolidando su emprendimiento al fundar en 2009 Phage Techonlogies. Cuentan con la experiencia para el manejo y producción de bacteriófagos, llevando a cabo diversos proyectos en al área de la microbiología. En el último tiempo, se ha definido a la biotecnología como a la disciplina que en el futuro inmediato deberá entregar las respuestas para un mundo con recursos limitados y una población creciente, especialmente en países considerados como pobres. Expertos en cuestiones energéticas referidas a la alimentación estiman que a 2025 la mitad de las calorías demandadas por la población mundial serán suministradas por la mejoras biotecnológicas tanto en los cultivos como en las fibras. A esta realidad deberán sumarse las mejoras y seguridades que permitan un consumo seguro. Las capacidades de estos jóvenes profesionales les han permitido contar con diversos apoyos de connotados profesionales que ven en su apuesta y en sus conocimientos y habilidades un futuro auspicioso.

VIRUS GRIPE AVIAR MUTANTE

Un controvertido estudio sobre la gripe aviar mutante fue publicado este miércoles sin que se le modificaran “los elementos científicos esenciales” por la revista británica Nature, que también difundió un informe de una agencia de bioseguridad favorable a esta publicación. Así, Nature publicó el estudio de un equipo de Wisconsin, dirigido por Yoshihiro Kawaoka, mientras que el del científico holandés Ron Fouchier se está “revisando” y se publicará posteriormente en Science. El equipo de Kawaoka explica haber introducido una mutación por medio de un gen clave del virus H5N1, volviéndolo más compatible con las células del sistema respiratorio humano. Posteriormente, los científicos usaron el virus de la gripe porcina H1N1, que había causado una pandemia en 2009, para crear un “híbrido H5/H1″. Posteriormente, se infectó a seis hurones con el virus mutante, los cuales transmitieron el virus a otros hurones a través del aire, pero ninguno de ellos murió. Nature también publicó un artículo de una agencia de bioseguridad, en el que se afirma que los beneficios de la publicación superan los riesgos de un uso malintencionado de lo publicado. A fines de marzo, un panel no gubernamental de expertos científicos y de seguridad en Estados Unidos había dado luz verde para la publicación completa de dos estudios sobre la gripe aviar mutante, revirtiendo su anterior decisión de retener detalles clave de las investigaciones. Expertos de Estados Unidos se habían opuesto previamente a la publicación de esos estudios -que mostraban cómo un virus de la gripe H5N1 generado en un laboratorio podía transmitirse fácilmente a través del aire entre los hurones- por temor a que la información terminara en las manos equivocadas y desencadenara una pandemia de gripe mortal. Por el contrario, a fines de marzo, los expertos del Consejo Asesor Nacional Científico de Bioseguridad (NSABB) consideraron que “la comprensión de las mutaciones específicas puede mejorar la vigilancia internacional y la salud pública y la seguridad”. Los expertos acordaron por unanimidad que la investigación del equipo de Wisconsin debía ser publicada en su totalidad, según lo previsto por Nature. Sin embargo, la votación sobre la investigación de Fouchier fue aprobada por una votación de 12-6, lo que indicaba que persistían algunas dudas entre los miembros. La gripe aviar se estima responsable de la muerte de más de la mitad de las personas que infecta, lo que es mucho más letal que las cepas típicas del virus estacional. Según la Organización Mundial de la Salud, ha habido 573 casos de gripe aviar H5N1 en humanos en 15 países desde 2003, con un 58,6% de casos fatales. Observations Observations [RSS feeds for Observations] Opinion, arguments & analyses from the editors of Scientific American Observations HomeAboutContact Controversial Bird-Flu Research Published: How Worried Should We Be? By Fred Guterl | May 2, 2012 | Comments1 ShareShare ShareEmail PrintPrint chickens on a farm Credit: Larry Rana/USDA A highly controversial research paper on bird flu was released today by the journal Nature. It shows that a particularly troublesome strain of avian influenza, designated H5N1, which has been worrying public health officials for more than a decade, has the potential to become a human pandemic. In other words, H5N1 bird flu, which so far has been highly lethal to humans but has not acquired the ability to spread easily among us, could do so at any time. The researchers, under the direction of Yoshihiro Kawaoka at the University of Wisconsin at Madison, crossed an H5N1 virus with the H1N1 pandemic virus of 2009, which spread like wildfire from one end of the world to another. The 2009 pandemic, you’ll recall, caught public health officials by surprise but luckily turned out to be mild. Kawaoka’s lab-made hybrid virus spreads among ferrets by airborne droplets expelled during the course of respiration–just as human influenza viruses such as the 2009 pandemic strain spread from person to person. Kawaoka’s concoction does not kill ferrets, and probably wouldn’t kill humans, but the feat is troubling because it demonstrates that an H5N1 virus that can spread among humans is most likely possible. (We don’t know for sure because it was tested only on ferrets, not humans, of course.) Whether an H5N1 virus could acquire the two deadly traits–transmissibility and lethality–at the same time is a burning question. (Kawaoka’s paper does not address it.) If one could, it would be bad news indeed. The 1918 flu virus, an H1N1 type, killed about 2 or 2.5 percent of the people it infected but spread so readily the death toll reached 20 million to 50 million. By contrast, about 60 percent of the 600 or so people who have caught H5N1 in the past few years have died. A highly transmissible H5N1 virus with a 60 percent fatality rate could kill hundreds of millions of people, perhaps billions. That’s not likely to happen, fortunately. The known H5N1 viruses that currently exist in nature do not attach to the upper respiratory tracts of humans, so most victims caught the virus from close contact with birds. And there is reason to think that a highly lethal but poorly transmissible virus like H5N1 would change in the process of becoming transmissible—that in acquiring the ability to spread, the virus would have to make genetic tradeoffs that compromise its ability to kill. For instance, one reason that the Ebola virus doesn’t spread widely among humans is that it is too efficient—mortality is as high as 90 percent—which means victims die before they can infect many others. We do not know, however, to what extent a human-transmissible H5N1 virus would have to make this tradeoff. Scientists differ widely in their opinions on this point. The strain that Kawaoka concocted in his lab seems to be mild—it made ferrets sick, but didn’t kill them. Even if his virus is not itself dangerous, however, it demonstrates that an H5N1 strain could one day arise that turns into a worrisome human pathogen. As Michael Osterholm, director of the Center for Infectious Disease Research and Policy at the University of Minnesota, has pointed out, a human-transmissible virus with a lethality rate 20 times lower than current wild strains of H5N1 would still kill more efficiently than the 1918 flu. The degree to which H5N1 is potentially dangerous to humans is the subject of much speculation. In part because of all the uncertainty, the biosecurity community has been in an uproar ever since the Kawaoka paper came to their attention last year. (Things really got stirred up when Ron Fouchier of Erasmus Medical Center in Rotterdam made remarks at a conference in Malta about similar work on H5N1 transmissibility, which he submitted to Science but has been held up by the Dutch government.) Many security experts believe no work on H5N1 transmissibility among mammals should have been conducted in the first place, and that the world would be a safer place if information about the results of the Kawaoka and Fouchier experiments and their methods were never disseminated. (Although the National Science Advisory Board for Biosecurity voted to green-light the publication of both papers, that vote came only after the results and the methods used to make the viruses had been disseminated to hundreds of people in the course of the standard pre-publication review process; holding up publication at that point, in this age of Wikileaks, probably would have been futile.) Recently the U.S. government has called for risk-benefit assessments of pathogens on its select agent list before research is conducted (H5N1 is on that list), but compliance is left to the funding agencies. Some biosecurity experts are calling for further restrictions in H5N1 research on transmissibility among mammals, such as limiting the work to labs with the highest biosafety standards. Many scientists believe this would be a mistake. They think that research on what could possibly make H5N1 deadly to humans is too urgent to be put under onerous security constraints. I interviewed Kawaoka in 2010, during the course of research for my book, The Fate Of the Species (which Bloomsbury releases on May 22). At the time, Kawaokoa was deeply worried about the danger of H5N1 bird flu. There had been outbreaks among poultry in 1997 and again in 2004 in Hong Kong, and the virus had shown other signs of restlessness—it had killed wild birds, which usually carry H5N1 without symptoms, and it had shown a propensity to spread outward from east Asia, despite the culling of millions of chickens and other poultry. How long would it be before nature’s roulette wheel produced a human version of H5N1? Kawaoka got a taste of how nasty bird flu can be when he arrived in the United States in 1983 as a young researcher in the lab of Robert Webster at St. Jude Children’s Hospital in Memphis, Tennessee. Webster was investigating the theory that birds provide a reservoir for human influenza viruses (which has since been confirmed and is now accepted as conventional wisdom). Webster got wind of an outbreak of avian influenza on poultry farms in Pennsylvania and raced to the scene, sending tissue samples back to Kawaoka, who analyzed them in the lab. The 1983 demonstrated to the young Kawaoka how changeable and dynamic a flu virus can be. The outbreak started out in April 1983 as a mild virus—it make chickens a little wheezy, but didn’t kill many of them. By November, the virus (an H5N2 type) had given rise to a sub-strain that was highly lethal. Chickens started keeling over, and farmers worried for their livelihoods. The U.S. Department of Agriculture came in to handle the outbreak, imposing a military-style culling of 17 million birds from Pennsylvania to Virginia. (No people died in the outbreak, just poultry.) While all this was going on, Kawaoka, back in Memphis, isolated samples of the virus and infected chickens in the lab to see how the virus worked. The mortality rate among his chickens was 100 percent. When he performed autopsies, he found that the virus had ravaged not just the birds’ gastrointestinal tracts, which you’d expect in a bird flu, but almost every organ—the kind of total attack documented in human victims of Ebola. Later, Kawaoka decided to compare the April strain and the November one to find out what had changed to make the virus suddenly lethal. He found that the two were identical except for a single protein. “What this tells you,” Kawaoka told me in 2010, “is that a highly pathogenic virus was generated from a single mutation. And it tells you there are many sources of highly pathogenic influenza viruses. It’s all out there in birds.” Researchers have already found natural strains of H5N1 that have acquired some of the genetic changes that Kawaoka’s recent paper identifies as necessary for transmissibility among ferrets. The research that Kawaoka and other influenza scientists are conducting certainly poses a risk, as some biosecurity experts have pointed out. The experiment that nature is conducting every day, as H5N1 viruses mutate and borrow genetic material from other viruses, is also potentially dangerous. Which should we fear most? On this question there are many opinions, but no definitive answers. Fred GuterlAbout the Author: Fred Guterl is the executive editor of Scientific American and author of Fate of the Species, which Bloomsbury releases on May 22. Follow on Twitter @fredguterl.

ANTICUERPOS SERONEUTRALIZANTES PARA PESTIVIRUS Y HERPESVIRUS EN OVINOS, CAPRINOS Y CAMËLIDOS SUDAMERICANOS 2001

Pesquisa de anticuerpos seroneutralizantes para pestivirus y herpesvirus en ovinos, caprinos y camélidos sudamericanos de Chile * Survey for antibodies to pestivirus and herpesvirus in sheep, goats, alpacas (Lama pacos ), llamas (Lama glama ), guanacos (Lama guanicoe ) and vicuña (Vicugna vicugna ) from Chile Arch. med. vet. v.33 n.2 Valdivia 2001 M. CELEDÓN, M.V., M.S.; A. SANDOVAL, M.V.; J. DROGUETT, Lic. Cs. Vet.; R. CALFIO, Lic. Cs. Vet.; L. ASCENCIO, Lic. Cs. Vet.; J. PIZARRO, B.Q.; Dr. Cs. C. NAVARRO, B.Q. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias,Casilla 2, Correo 15, Santiago, Chile. e-mail: oceledon@uchile.cl SUMMARY Microtitration serum virus-neutralization tests were used to determine antibody titres for pestivirus: bovine viral diarrhea virus (NADL strain) and herpesvirus: bovine herpes virus 1 (Los Angeles strain) in 321 sheep, 322 goats, 74 alpacas (Lama pacos ), 43 llamas (Lama glama ), 48 guanacos (Lama guanicoe ) and 34 vicuñas (Vicugna vicugna ), from several Regions of Chile. Antibodies to pestivirus were found in 60 (18,7%) sheep, in 21 (6,5%) goats, in 8 (10,8%) alpacas and in 6 (14%) llamas. The guanacos and vicuñas did not have antibodies to pestivirus. Antibodies to herpesvirus were found in 8 (2,5%) sheep and in 62 (19,3%) goats. The alpacas, llamas, guanacos and vicuñas did not antibodies to herpesvirus. From the seropositive animals to pestivirus, the sheep flocks were located in the Metropolitan Region and XII Region of Chile with 7,1% to 82,1% positive serum samples, with titres between 11 to 1024, and 5 (22,7%) positive flocks; The goat flocks were located in the IV Region and the Metropolitan Region with 6,7% to 100% positive serum samples, with titers between 4 to 512, and 3 (13,6%) positive flocks. The alpacas and llamas flocks were located in the Metropolitan Region (where they live with other ruminants). Alpacas 10,8% serum samples from 2 flocks and 14% serum sample of llamas from 1 flock, were positive, with titers between 32 to 2048. From the seropositive animals to herpesvirus, only one sheep flock was positive and it was located in VI Region of Chile with 28,6% positive serum samples, with titers between 2 to 5,6; The goat flocks positive to herpesvirus were located in the IV Region and the Metropolitan Region with 4,2% to 66,7% positive serum samples, with titers between 2 to 45, and 14 (63,6%) positive flocks. The serum samples from guanacos and vicunas were obtained from their natural Regions, guanacos from the IV and XII Regions and vicuñas from the I Region. The findings of our study confirm that pestivirus infections of sheep, goats, alpacas and llamas and herpesvirus infections of sheep and goats occur in Chile. Palabras claves: pestivirus, herpesvirus, ovinos, caprinos, camélidos sudamericanos Key words: pestivirus, herpesvirus, sheep, goats , Sudamerican camelids INTRODUCCION Los pequeños rumiantes (PR), ovinos y caprinos, y los camélidos sudamericanos (CS), alpacas (Lama pacos), llamas (Lama glama ) guanacos (Lama guanicoe ) y vicuñas (Vicugna vicugna ), son especies animales ampliamente distribuidas en el territorio nacional, siendo, en la mayoría de los casos, la única fuente de sustento para sectores poblacionales de menores recursos económicos, por el consumo y comercialización de los productos que de ellos se obtienen (FIA, 2000). En la actualidad, adquieren mayor importancia debido a que se está estimulando su producción, especialmente de las especies domésticas–caprinos, ovinos, alpacas y llamas, con la finalidad de mejorar la calidad de vida de sus propietarios. Las patologías asociadas con problemas reproductivos adquieren una relevancia especial y los pestivirus y herpesvirus son importantes de considerar dado que producen pérdidas productivas y reproductivas y se encuentran presentes en la masa bovina de nuestro país (Berríos y col., 1979; 1985; Celedón y col., 1996, 1997a, 1997b,1998, Reinhardt y col., 1986, 1990). Los pestivirus, agentes causales de la diarrea viral bovina (DVB) del bovino y enfermedad de border (EB) del ovino, pueden cruzar barreras de especie con relativa facilidad e infectar a otras especies de rumiantes domésticos y silvestres (Nettleton, 1990), provocándoles infecciones asintomáticas, enfermedad moderada a severa e incluso la muerte (Doyle y Heuschele, 1983), a la vez que estas especies pueden servir de reservorio viral para las especies de más valor productivo (Nettleton, 1990). En ovinos y caprinos, cuando los pestivirus infectan a un animal adulto inmunocompetente, éstos sólo hacen una viremia transitoria con leucopenia y fiebre moderada (Hussin y Woldehiwet, 1994). No obstante, si la infección ocurre en una hembra en gestación, se producen las mayores pérdidas reproductivas (Loken y col., 1982; Hussin y Woldehiwet, 1994; Nettleton y col., 1998), incluyendo el nacimiento de animales portadores e inmunotolerante (PIT) que son considerados como la principal fuente de infección viral para el rebaño (Westbury y col., 1979; Terpstra, 1981). Además, el animal PIT puede hacer un cuadro mortal similar al de la enfermedad mucosa (EM) del bovino (Barlow y col., 1983; Radostits y Littlejohns, 1988). Los CS son susceptibles de infectarse con pestivirus. Hay evidencias serológicas de anticuerpos para el VDVB (Doyle y Heuschele, 1983; Rivera y col., 1987; Motha y Tham, 1992) y se ha aislado VDVB de llamas con rinitis y de llamas con diarrea (Mattson, 1994). Los herpesvirus, en rumiantes, son capaces de provocar un amplio rango de sindromes (Engels y Ackernann, 1996). El virus herpes bovino 1 (VHB-1) tiene como hospedador natural al bovino, se asocia con enfermedad genital, respiratoria, aborto y meningoencefalitis (Gibbs y Rweyemamu, 1977); el VHB-5, cuyo hospedador natural es el ovino, es causante de rinitis y signos neurológicos en los corderos (Silva y col., 1999) y el VHB-6, también denominado virus herpes caprino tipo1 (VHC-1), cuyo hospedador natural es el caprino, es agente causal de diarreas sanguinolentas, cianosis y disnea e infección sistémica con muerte en los cabritos (Berríos y col., 1975, Van Der Lugt y Randles, 1993); enfermedad respiratoria y genital en los adultos (Horner y col., 1982; Tarigan y Webb, 1987; Koptopoulus, 1992) y muerte fetal y aborto en hembras gestantes (Neil y col., 1997). A pesar de la especificidad de la infección de los virus herpes, se ha aislado VHB-1 desde el tracto respiratorio de ovejas con enfermedad respiratoria (Trueblood y col., 1978); se ha detectado seropositividad para VHB-1 en corderos (Howard y col., 1985); se ha reportado enfermedad respiratoria en caprinos con infección con VHB-1 (Mohanty y col., 1972); se ha aislado VHB-1 en llamas con neumonía y en llamas con enfermedad neurológica aguda (Mattson, 1994); y evidencias serológicas, en alpacas del Perú (Rivera y col., 1987), también confirman la infección por VHB-1 en esta especie. La infección por VHC-1 en ovinos es discutida. Por inoculación experimental se ha logrado multiplicar VHC-1 en ovinos con baja respuesta de anticuerpos neutralizantes, considerando al VHC-1 sin un rol epidemiológico importante para estas especies (Berríos y col., 1975), pero, Papanastasopoulus y col., 1991 por inoculación experimental de VHC-1, en ovinos, produjeron una enfermedad similar o más severa que la producida en cabritos. En Chile los únicos registros disponibles de infección por pestivirus y herpesvirus en PR y CS se refieren a estudios efectuados en ovinos de la X Región, donde se encontraron anticuerpos para pestivirus (Riedemann y col., 1991) y se determinó la prevalencia serológica promedio de 8,5% para EB (Tadich y col., 1998). Considerando la posibilidad de que los PR y CS estén infectados con pestivirus y/o herpesvirus, la imposibilidad de usar cepas virales propias para estas especies, y la existencia de epitopes neutralizables comunes entre pestivirus (Plant y col., 1973) y entre herpesvirus de bovidos, (Gibbs y Rweyemamu, 1977), se plantea conocer si los PR y CS de Chile están infectados con pestivirus y herpesvirus a través de la pesquisa de anticuerpos neutralizantes mediante el uso de pestivirus y herpesvirus de origen bovino. MATERIAL Y METODOS Muestras. Con el objeto de pesquisar un animal serorreaccionante, con una proporción esperada de muestras positivas de un 2%, con un 95% de confianza, se consideró un tamaño mínimo muestreal de 149 ovinos, 149 caprinos y 149 CS (Thrusfield, 1986). Las muestras obtenidas, mayoritariamente de sectores en donde, clínicamente, se sospechaba de la presencia del virus, se extrajeron por punción de la vena yugular, o de la herida de deguello en plantas faenadoras de carne, y fueron recibidas en frascos estériles. El suero se extrajo del coágulo sanguíneo por centrifugación a 3000xg por 10 minutos y se inactivó en un baño termorregulado, sometiéndolo a 56° C por 30 minutos, conservándose a 20 °C hasta el momento de realizar la prueba de seroneutralización. Cultivos celulares. Se empleó la línea celular de cornete nasal bovino (Bovine turbinate cells. ATCC CRL-1390) cultivada en medio esencial mínimo adicionada de aminoácidos no esenciales, bicarbonato, "buffer" Hepes, combiótico y un 10% de suero equino como factor de crecimiento, el que fue rebajado a un 2% en el medio de mantenimiento celular. Virus. Se emplearon las cepas de referencia, NADL del VDVB como pestivirus, y Los Angeles del VHB-1 como herpesvirus. La capacidad infectante, de cada una de las cepas, se determinó por dilución punto final, calculándose la dosis infectante cultivo de tejido 50% (DICT50) por el método de Reed y Muench (1938). Prueba de seroneutralización. Se efectuó en microplacas de 96 pocillos, realizándose diluciones al doble en volúmenes de 50 ul, empleándose dos pocillos por dilución. A cada dilución de suero se adicionaron 50 ul de 200 DICT50 del virus respectivo. Paralelamente, se incluyeron sueros controles positivos (anti VDVB y anti VHB-1) y negativos, se realizaron controles de viabilidad celular, toxicidad de los sueros, unidades virales y título de la cepa viral. Las mezclas de suero-virus y controles se incubaron por 1 hora a 37° C y, posteriormente, se adicionaron 100 ul de una suspensión de 100.000 células por ml con un 20% de suero equino (Rossi y Kiesel, 1971). Las microplacas se controlaron diariamente, por observación microscópica, y el título dilución punto final seroneutralizante (DPFSN) del suero fue calculado por el método de Reed y Muench (1938). Con título DPFSN, igual o mayor a 2, el animal se consideró como seropositivo (Koptopoulos, 1992). RESULTADOS Se analizaron 321 muestras de ovino, 322 de caprinos y 199 de CS distribuidas en 74 alpacas, 43 llamas, 48 guanacos y 34 vicuñas. De las 842 muestras analizadas, en 95 (11,3 %) se detectaron anticuerpos DPFSN para pestivirus y en 70 (8,3 %) se detectó la presencia de anticuerpos DPFSN para herpesvirus, encontrándose seropositividad para pestivirus en ovinos, 18,7%, en caprinos 6,5%, en alpacas 10,8% y en llamas 14%. En guanacos y vicuñas no se detectaron anticuerpos para pestivirus (cuadro 1). En relación a la serología para herpesvirus, la seropositividad fue en ovinos 2,5%, y en caprinos 19,3%. En alpacas, llamas, guanacos y vicuñas no se detectaron anticuerpos para herpesvirus (cuadro 1). Cuadro 1. Frecuencia de ovejas, cabras, alpacas (Lama pacos), llamas (Lama glama ) guanacos (Lama guanicoe) y vicuñas (Vicugna vicugna) seropositivas a pestivirus y seropositivas a herpesvirus. Frequency of seropositives to pestivirus and seropositives to herpes virus sheep, goats, alpacas (Lama pacos), llamas (Lama glama) guanacos (Lama guanicoe ) and vicuñas (Vicugna vicugna). Especie animal Total Pestivirus Herpesvirus Muestras Predios Positivos # Positivos * Muestras Predios Muestras Predios N° (%) N° (%) N° (%) N° (%) Ovina Caprina Alpacas Llamas Guanacos Vicuñas 321 322 74 43 48 34 22 22 4 4 ** ** 60 21 8 6 0 0 (18,7) (6,5) (10,8) (14,0) (0,0) (0,0) 5 3 2 1 0 0 (22,7) (13,6) (50,0) (25,0) (0,0) (0,0) 8 62 0 0 0 0 ( 2,5) (19,3) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0) 1 14 0 0 0 0 (4,6) (63,6) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0) Total 842 52 95 (11,3) 11 (21,2) 70 (8,3) 15 (28,9) * Suero con capacidad de neutralizar 100 dosis infectante cultivo de tejido 50%, de la cepa NADL del virus de la diarrea viral bovina (pestivirus), o de la cepa Los Angeles del virus herpes bovino 1 (herpesvirus). ** Especies de vida silvestre, vicuñas del altiplano de la 1ª Región, 4 guanacos de la IV Región y 44 de la XII Región. Se pesquisaron animales serorreaccionantes para pestivirus en ovinos de la Región Metropolitana y de la XII Región, en caprinos de la IV Región y de la Región Metropolitana, y en alpacas y llamas de la Región Metropolitana. Para herpesvirus se pesquisaron animales serorreaccionantes en ovinos de la VI Región, y en caprinos de la IV Región y de la Región Metropolitana (cuadro 2). Cuadro 2. Frecuencias y títulos de anticuerpos seroneutralizantes para pestivirus y herpesvirus en ovinos, caprinos y camélidos sudamericanos según su distribución geográfica. Frequency and titers of seroneutralizing antibodies to pestivirus and herpesvirus in sheep, goats, alpacas (Lama pacos), llamas (Lama glama) guanacos (Lama guanicoe) and vicuñas (Vicugna vicugna) according geographic region. Especie Región Predio Muestras total Anticuerpos pestivirus Anticuerpos herpesvirus Positivas Rango titulo* M.G ** Positivas Rango titulo* M.G ** N° (%) N° (%) Ovina Metropo- litana VI XII 1 2 3 1 1 2 14 11 10 28 28 48 1 3 1 0 23 32 (7,1) (27,3) (10) (82,1) (66,7) 64 45 - 1024 11 16-256 32-710 64 210 11 100 120 0 0 0 8 0 0 (28,6) 2-5,6 3,5 Caprina IV Metropo- litana 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 13 6 28 30 20 20 11 16 14 8 24 10 19 8 0 0 0 2 0 0 11 0 0 0 0 0 0 (33,3) (6,7) (100) 89 - 256 4-16 11-512 160 8 69 1 8 4 8 4 11 4 4 5 3 1 5 1 3 (4,2) (61,5) (66,7) (28,6 (13,3) (55) (20) (36,4) (31,3) (21,4) (12,5) (20,8) (10) (15,8) 23 4-32 2-2,8 2-11 4-45 2-8 2-5,6 2-8 2,8-5,6 2 16 2-16 4 2-4 23 10 3,6 4 8,8 3 2,8 3,7 3,7 2 16 6,5 4 2,5 Alpaca Metropo- litana 1 2 12 38 1 7 (8,3) (18,4) 256 89 - 2048 256 430 0 0 Llama Metropo- litana 1 18 6 (33,3) 32-128 64 0 * suero con capacidad de neutralizar 100 dosis infectante cultivo de tejido 50%, de la cepa NADL del virus de la diarrea viral bovina (pestivirus), o de la cepa Los Angeles del virus herpes bovino 1 (herpesvirus). ** Media geométrica DISCUSION La seropositividad detectada para las dos virosis, en este estudio, indican que los caprinos y ovinos se encuentran infectados con pestivirus y con herpesvirus y las alpacas y llamas con pestivirus. Cabe hacer notar que las muestras de guanacos y vicuñas fueron obtenidas por captura de animales que se encontraban en su ambiente natural, y la ausencia de anticuerpos hace suponer, que en esas condiciones, estos animales no estarían infectados al menos con un pestivirus antigénicamente relacionado con la cepa NADL del VDVB ni con un herpesvirus antigénicamente relacionados con la cepa Los Angeles del VHB-1, no obstante ser ellos susceptibles de infectarse, dado su estrecho parentesco genético con los camélidos domésticos (alpacas y llamas). Esta situación es de especial relevancia ya que las dos virosis son causantes de serios problemas reproductivos en las especies donde ellas se han estudiado (bovinos, ovinos y caprinos) y de ser introducidas en estas especies silvestres, inmunológicamente desprotegidas, podrían provocar un gran impacto en la población. Por otra parte, las alpacas y llamas ubicadas en la Región Metropolitana pertenecen a animales trasladados desde la I Región y los que registraron seropositividad llevaban mayor tiempo de permanencia y estaban en contacto con otras especies de rumiantes (ovinos y caprinos). Según el número de animales serorreaccionantes, en las especies ovina y caprina, se destaca que los mayores porcentajes de positivos estuvieron para pestivirus en la especie ovina y para herpesvirus en la especie caprina (cuadro 1), lo que estaría señalando que, al parecer, existiría mayor predisposición de infección con pestivirus en ovinos que en caprinos y mayor predisposición de infección por herpesvirus en caprinos que en ovinos. Estas diferencias también fueron observadas por Howard y col. (1985), quienes encontraron en corderos un 6,4% de seropositivos para VDVB en 234 muestras analizadas, y un 0,4% de positivos para VHB-1 en 229 muestras analizadas. Al respecto, se ha podido comprobar que, por inoculaciones experimentales, las ovejas se infectan con VHB-1 y seroconvierten pero no diseminan fácilmente el virus (Hage y col., 1997). A pesar de no ser este un estudio de prevalencia serológica, los resultados obtenidos a través de la pesquisa de anticuerpos, lo hace comparable a los reportados por otros estudios. En este caso, el porcentaje de seropositivos para pestivirus en ovinos varió desde un 7,1% hasta un 82,1%, detectándose un 22,7% de los rebaños infectados, resultado que es similar al obtenido por Tadich y col. (1998), donde los seropositivos para EB en ovinos de la X Región, empleando una prueba de ELISA, varió de 5,3% a 42,8% y encontró un 23% de las ovejerías seropositivas. Preliminarmente, Riedemann y col. (1991), en otro estudio de pesquisa de anticuerpos, detectó un 18% de seropositivos por prueba de neutralización para VDVB en ovinos de la X Región. En algunos rebaños seleccionados en Canadá se ha pesquisado un 0,9% de animales seropositivos con 20% de rebaños positivos (Heckert y col., 1994); en Francia la seropositividad para ovinos varió entre un 5 a un 85% y cerca del 30% de los rebaños ovinos fueron seropositivos y 10 al 30% de los rebaños caprinos tienen animales con anticuerpos (Russo y col., 1986, 1999). Cabe hacer notar que en dos rebaños de la XII Región hubo un 66,7 % y 82,1% de infección, lo que podría estar denotando la existencia de un número considerable de animales PIT, ya que se atribuye la alta seroprevalencia de los rebaños a la presencia de infectados persistentemente (Lees y col., 1991). Referente a los títulos de anticuerpos obtenidos, se observa que para pestivirus, en general, los títulos son más elevados que para herpesvirus. Al respecto, Howard y col. (1985) analizaron sueros de corderos por prueba de neutralización empleando la cepa Singer del VDVB y la cepa Colorado del VHB-1, y también detectaron diferencias en los rangos de títulos de anticuerpos para ambas virosis con valores <2 a >256 para VDVB y <2 a 2 para el VHB-1. Se debe tener presente que, en este estudio, se emplearon cepas virales propias de la especie bovina (VDVB y VHB-1) y para ellas se describe una mayor relación antigénica entre VDVB y VEB que entre VHB-1 y VHO-1 y VHC-1. Si bien los caprinos pueden infectarse por VHB-1 y VHC-1, a pesar de que ambos virus presentan epitopes neutralizables comunes, la neutralización es en un sentido y el VHB-1 puede ser neutralizado más fácilmente por anticuerpos contra el VHB-1 que los producidos contra el VHC-1, a diferencia del VHC-1, que es neutralizable en igual medida por anticuerpos inducidos por VHB-1 y VHC-1 (Koptopoulus, 1992). Esto estaría señalando que la infección de los caprinos, de este estudio, sería más atribuible al VHB-1 que al VHC-1, ya que los títulos de anticuerpos oscilaron entre 2 y 45 y en infecciones por VHC-1 los títulos de anticuerpos han oscilado entre 8 y 128 (Neil y col., 1997). De todas maneras, la presencia de títulos neutralizantes de 2 o mayores indican infección por herpesvirus (Berríos y col., 1975; Horner y col., 1982; Koptopoulos, 1992). Es preciso señalar que, en este estudio, todas las muestras seropositivas para herpesvirus (dado su bajo título) fueron nuevamente analizadas con la misma cepa viral pero disminuyendo de 100 a 10 las DICT50, con el fin de hacer menos exigente la prueba y confirmar la seropositividad de ellos. En todas las muestras procesadas la positividad se mantuvo y los títulos aumentaron en 0,5 a 1 dilución. Respecto de la distribución geográfica, es destacable que los mayores serorreaccionantes se ubiquen para pestivirus en ovinos de la XII Región, y para herpesvirus en caprinos de la IV Región, lo que es de consideración por el rol que estarían jugando estos virus en estas zonas, dado que la producción ovina es el principal recurso ganadero que sustenta a la XII Región, como la producción caprina lo es para la IV Región, de tal modo que se hace necesario conocer el real impacto de estos virus en estas producciones en nuestro país. Se confirma, a través de la detección de anticuerpos neutralizantes, que existe infección por pestivirus en ovinos, caprinos, alpacas y llamas en cautiverio, y que, los ovinos y caprinos están infectados por herpesvirus. RESUMEN Se investigó la presencia de anticuerpos por dilución punto final seroneutralizante (DPFSN) para pestivirus (cepa NADL del virus de la diarrea viral bovina) y para herpesvirus (cepa Los Angeles del virus herpes bovino 1), en muestras de sueros de 321 ovinos, 322 caprinos, 74 alpacas (Lama pacos ), 43 llamas (Lama glama ), 48 guanacos (Lama guanicoe ) y 34 vicuñas (Vicugna vicugna ), procedentes de diferentes regiones del país. Para pestivirus se detectó reacción serológica positiva en 60 (18,7%) ovinos, en 21 (6,5%) caprinos, en 8 (10,8%) alpacas y en 6 (14%) llamas. Los guanacos y vicuñas fueron seronegativos para pestivirus. Para herpesvirus, la seropositividad se obtuvo en 8 (2,5%) ovinos y 62 (19,3%) caprinos. No se detectaron anticuerpos para herpesvirus en las muestras de camélidos. Según la distribución geográfica los mayores porcentajes de positividad resultaron ser: para pestivirus en ovinos de 2/3 predios de la XII Región (con positividad de 66,7% y 82,1%), con rangos de títulos de 16 a 710 y, para herpesvirus en caprinos de 5/6 predios de la IV Región (con positividad de 4,2%, 13,3%, 28,6%, 61,5% y 66,7%), con rango de títulos de 2 a 45. Las alpacas y llamas serorreaccionantes a pestivirus se encontraban ubicadas en la Región Metropolitana, en confinamiento en conjunto con otras especies de rumiantes, en cambio que las especies silvestres, guanacos y vicuñas fueron muestreadas en sus lugares de origen. Se confirma que en Chile existe infección por pestivirus en ovinos, caprinos, llamas y alpacas y por herpesvirus en ovinos y caprinos. AGRADECIMIENTOS Agradecemos la colaboración prestada por médicos veterinarios, ingenieros agrónomos y otros profesionales por el aporte de las muestras, que fueron fundamentales para realizar este estudio. * Financiamiento por Proyecto Fondecyt 1981193 BIBLIOGRAFIA BARLOW, R. M., A. C. GARDINER, P. F. NETTLETON. 1983. The pathology of spontaneous and experimental mucosal disease-like syndrome in sheep recovered from clinical Border disease. J Comp. Pathol. 93:451-461. BERRIOS, P. E., D. G. McKERCHER, H. D. KNIGHT. 1975. Pathogenicity of a caprine herpesvirus. Am. J. Vet. Res. 36: 1763-1769. BERRIOS, P., M. JARPA, S. HERRERA. 1979. Aislamiento y tipificación del virus de la rinotraqueítis infecciosa de bovinos con sintomatología respiratoria. Arch. Med. Vet. Supl.I. 140-141. BERRIOS, P., M. CELEDON, F. CORTES, M. LUENGO. 1985. Aislamiento del virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina en un brote de aborto en la zona sur de Chile. Arch. Med.Vet. 12:49-52. CELEDON, M., C. VARGAS, A. SALINAS, A. CASANOVA, L. IBARRA, P. BERRIOS. 1996. Prevalencias serológicas para el virus de la diarrea viral bovina y de la rinotraqueítis infecciosa bovina en predios lecheros de la Región Metropolitana. Av. Cs. Vet. 11:75-80. CELEDON, M., L. PALACIOS, J. PIZARRO, L. IBARRA. 1997a. Prevalencia de anticuerpos seroneutralizantes para el virus de la diarrea viral bovina en ganado de carne de la Región Metropolitana de Chile. Av. Cs. Vet. 12:98-100. CELEDON, M., L. ROCO, G. QUINTEROS, M. SANTIBAÑEZ, P. BERRIOS. 1997b. Puesta en evidencia del virus diarrea viral bovina en bovinos clínicamente afectados. Arch. Med. Vet. 29: 189- 195. CELEDON, M., J. CARBONELL, L. IBARRA, J. PIZARRO. 1998. Detección de bovinos portadores e inmunotolerantes al virus de la diarrea viral bovina en predios lecheros de la Región Metropolitana. Arch. Med. Vet. 30:125-132. DOYLE, L. G., W. P. HEUSCHELE. 1983. Bovine viral diarrhea virus infection in captive exotic ruminants. J. Am. Vet. Med. Assoc. 183:1257-1259. ENGELS, M., M. ACKERMANN. 1996. Pathogenesis of ruminant herpesvirus infections. Vet. Microbiol. 53:3-15. FIA. (FUNDACION PARA LA INNOVACIÓN AGRARIA. GOBIERNO DE CHILE). 2000. Camélidos en Chile. Situación actual y perspectivas. 130 pp. GIBBS, E. P. J., M. M. RWEYEMAMU. 1977. Bovine herpesviruses. Part I. Bovine herpesvirus 1. Vet. Bull. 47:317-343. HAGE, J. J., P. VELLEMA, Y. H. SCHUKKEN, H. W. BARKEMA, F. A. M. RIJSEWIJK, J. T. van OIRSCHOT, G. H. WENTINK. 1997. Sheep do not have a major role in bovine herpesvirus 1 transmission. Vet. Microbiol. 57:41-54. HECKERT, R. A., C. DUBUC, M. R. BRISCOE, M. RANGER. 1994. Prevalence of border disease virus infection in a small group of Canadian sheep. Can. Vet. J. 35: 379-381. HORNER, G. W., R. HUNTER, A. M. DAY. 1982. An outbreak of vulvovaginitis in goats caused by a caprine herpesvirus. N. Z. Vet. J. 30:150-152. HOWARD, D. L., R. C. CUTLIP, S. R. BOLIN, K. A. BROGDEN. 1985. Seroepidemiologic survey for antibodies to selected viruses in the respiratory tract of lambs. Am. J. Vet. Res. 46:2601-2604. HUSSIN, A. A., Z.WOLDEHIWET. 1994. Border disease virus: A review. Bet. Bull. 64: 1131-1151. KOPTOPOULUS, G. 1992. Goat herpesvirus 1 infection: a review. Vet. Bull. 62:77-85. LEES, V. W., K. G. LOEWEN, D. DEREGT, R. KNUDSEN. 1991. Isolation of border disease virus from twin lambs in Alberta. Can. Vet. J. 32:678-682. LOKEN, T., I. BJERKAS, B. HYLLSETH. 1982. Border disease in goats in Norway. Res. Vet. Sci. 33: 130-131. MATTSON, D. E. 1994. Update on llama medicine. Viral diseases. Vet. Clin. North . Am: Food Anim. Pract. 10:345-351. MOHANTY, S. B., M. G. LILLIE, N. P. CORSELIUS, J. D. BECK. 1972. Natural infection with infectious bovine rhinotracheitis virus in goats. J. Am. Vet. Med. Assoc. 160:879 -880. MOTHA, J., K. THAM. 1992. Pestivirus infection in a llama (Lama glama). N. Z. Vet. J. 40:126. NEIL, M. W., M. L. VICKERS, R. R. TRAMONTIN, M. B. PETRITES-MURPHY, G. P. ALLEN. 1997. Multiple abortions associated with caprine herpesvirus infection in a goatherds. J. Am. Vet. Med. Asoc. 211:89-91. NETTLETON, P. F. 1990. Pestivirus infections in ruminants other than cattle. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 9:131-150. NETTLETON, P. F., J. A. GILRAY, P. RUSSO, E. DLISSI. 1998. Border disease of sheep and goats. Vet, Res. 29:327-340. PAPANASTASOPOULOU, M., G. KOPTOPOULOS, S. LEKKAS, O. PAPADOPOULOS, H. LUDWIG. 1991. An experimental study on the pathogenicity of the caprine herpesvirus type 1 (CHV-1). Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 14: 47-53. PLANT, J. W., I. R. LITTLEJOHNS, A. C. GARDINER, J. T. VANTSIS, R. A. HUCK. 1973. Immunological relationships between border disease, mucosal disease and swine fever. Vet. Rec. 92:455. RADOSTITS, O. M., I. R. LITTLEJOHNS. 1988. New concepts in the pathogenesis, diagnosis and control of diseases caused by the bovine viral diarrhea virus. Can. Vet. J. 29:513-528. REED, L. J., H. A. MUENCH. 1938. A simple method of estimating fifty-percent endpoints. Am. J. Hyg. 27:493-497. REINHARDT, G., S. RIEDEMANN, H. FIEDLER, M. NIEDDA, M. AGUILAR, V. CUBILLOS, E. PAREDES. 1986. Diarrea viral bovina/enfermedad mucosa. Primer aislamiento del agente causal en Chile. Arch. Med. Vet. 18:157-161. REINHARDT, G., S. RIEDEMANN, S. ERNST, M. AGUILAR, R. ENRIQUEZ, J. GALLARDO. 1990. Seroprevalence of bovine viral diarrhea/mucosal disease in souther Chile. Prev. Vet. Med.10: 73-78. RIEDEMANN, S., N. TADICH, G. REINHARDT, M. I. MONTECINOS, M. AGUILAR. 1991. Pesquisa serológica de PI-3, BHV-1, y BVDV en ovinos de 11 predios de la X Región, Chile. Arch. Med. Vet. 23:185-187. RIVERA, H., B. R. MADEWELL, E. AMEGHINO. 1987. Serologic survey of viral antibodies in the Peruvian alpaca (Lama pacos). Am. J. Vet. Res. 48:189-191. ROSSI, C. R., K. KIESEL. 1971. Microtiter tests for detecting Antibody in bovine serum to parainfluenza 3 virus, infectious bovine rhinotracheitis virus, and bovine viral diarrhea virus. Appl. Microbiol. 22:32-36. RUSSO, P., A. GIAUFFRET, C. FLECHE-SEBAN. 1986. Ovine pestiviruses in France Incidence in infectious pathology. 9th International Symposium of the World Association of Veterinary Microbiologists. Immunologists and Specialists in infectious disease. 42. RUSSO, P., E. DLISSI, P.F. NETTLETON. 1999. Border disease and abortion in small ruminants. Conference26th World Veterinary Congress WVA. Lyon. France. SILVA, A. M., R. WEIBLEN, L. F. IRIGOYEN, P. M. ROEHE, H. J. SUR, F. A. OSORIO, E. F. FLORES. 1999. Experimental infection of sheep with bovine herpesvirus type-5 (BHV-5). Vet. Microbiol. 66: 89-99. TADICH, N., P. F. NETTLETON, K. L. MORGAN, A. HODGSON, R. MACAULAY, G. REINHARDT, S. RIEDEMANN. 1998. Seroprevalencia de Border disease en 22 ovejerías del sur de Chile. Arch. Med. Vet. 30:191-196. TARIGAN, S., R. F. WEBB. 1987. Caprine herpesvirus from balanoposthitis. Aust. Vet. J. 64:321. TERPSTRA, C. 1981. Border disease: virus persistence, antibody response and transmission studies. Res. Vet Sci. 30:185-191. THRUSFIELD, M. 1986. Veterinary Epidemiology. London. Butterworths. Pp.197-198. TRUEBLOOD, M. S., B. L. SWIFT, L. McHOLLAND-RAYMOND. 1978. A bovine herpesvirus isolated from sheep. Can. J. Comp. Med. 42:97-99. VAN DER LUGT, J. J., J. L. RANDLES. 1993. Systemic herpesvirus infection in neonatal goats. Jl. S. Afr.vet. Ass. 64:169-171. WESTBURY, H. A., D. V. NAPTHINE, E. STRAUBE. 1979. Border disease: persistent infection with the virus. Vet. Rec. 104:406-409. Aceptado: 22.05.2001 Arch. med. vet. v.33 n.2 Valdivia 2001

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÖN DE PESTIVIRUS DE ALPACAS DE LA RM Chile 2006

Aislamiento e identificación de pestivirus obtenidos de alpacas (Lama pacos) y llamas (Lama glama) de la Región Metropolitana, Chile# Isolation and identification of pestiviruses in alpacas (Lama pacos) and llamas (Lama glama) introduced to the Región Metropolitana, Chile M O Celedón*, J Osorio, J Pizarro Arch. Med. Vet. 38, Nº 3, 2006 correo electrónico oceledon@uchile.cl casilla 2, correo 15, Santiago, Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Santiago, Chile. SUMMARY The natural habitat for more than 90% of the domestic South American camelids (SAC) in Chile, alpaca (Lama pacos) and llama (Lama glama), is located between 11° and 21° South latitude at 3,800 and 5,000 ms of altitude. Lately, alpacas and llamas have been introduced to other geographic parts of the country where they are in contact with domestic ruminants, making likely infection with BVDV, present in cattle, goats and sheep. The BVDV includes two species, BVDV genotype I (BVDV I) and BVDV genotype II (BVDV II), which along with the border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV) conforms the Pestivirus genus of the Flaviviridae family. This study evaluates the hypothesis that SAC introduced to the Metropolitan Region (MR) of Chile are infected with pestiviruses. In order to perform viral isolation, samples were taken from 80 SAC (42 live alpacas, 35 live llamas, 2 dead llamas and 1 aborted foetus of llama), coming from 4 flocks suspected to be infected with pestivirus. The samples were inoculated in primary culture of bovine foetus lung cells (free of BVDV), passing each sample 5 times, and were then analyzed by direct immunofluorescence and indirect immunoperoxidase techniques to detect the presence of pestivirus antigens. For molecular characterization, a fragment of the 5’-untranslated region (5’-UTR) of RNA of the isolates was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and treated with restriction enzymes Pst I, Bgl I and Xho I in order to identify species of viruses. The results show that 18 SAC (10 alpacas and 8 llamas from the 4 studied flocks), were infected with pestivirus. All isolates were non cytopathogenic. BVDV I was isolated from 6 alpacas while BVDV II was isolated from 4 alpacas and 8 llamas . The viral samples were obtained from 8 healthy alpacas, 2 alpacas with abortion, 5 healthy llamas, 2 llamas with abortion and 1 dead llama without clinical history. It is concluded that alpacas and llamas from the MR of Chile are infected with BVDV I and BVDV II. Palabras clave: Camélidos, sudamericanos, DVB, pestivirus. Key words: South American camelids, pestiviruses, bovine viral diarrhoea virus. INTRODUCCION El género Pestivirus, perteneciente a la familia Flaviviridae, incluye al virus de la diarrea viral bovina (VDVB), al virus de la enfermedad de la frontera (VEF) y al virus de la peste porcina clásica (VPPC). El VDVB infecta rumiantes domésticos, rumiantes silvestres y cerdos; el VEF infecta ovinos, caprinos y cerdos. El VPPC infecta cerdos (Vilcek y Belak 1996, Walz y col 1999). El VDVB, VEF y VPPC poseen antígenos comunes y propios, pero sólo se define un serotipo por especie viral, pese a que los aislados virales presentan una alta diversidad antigénica (Corapi y col 1990, Xue y col 1990, Paton y col 1991, Paton y col 1995ª, Ridpath y col 2000). De acuerdo a la capacidad que tiene el virus para provocar efectos visibles en cultivos de células in vitro, se describen dos biotipos, citopático y no citopático (Lee y Gillespie 1957). El análisis de diferentes regiones del genoma y en particular de la región 5’ no traducida (5’UTR) ha permitido clasificar los Pestivirus en 4 grupos: VDVB genotipo I (VDVB I), VDVB genotipo II (VDVB II), VEF y VPPC (Pellerin y col 1994, Ridpath y col 1994, Vilcek y col 1994). Actualmente se han obtenido nuevos aislados virales a partir de animales silvestres y el análisis de su genoma ha llevado a postular su inclusión como nuevas especies de pestivirus (Becher y col 1997, Becher y col 1999, Harasawa y col 2000). El VDVB se distribuye en la población bovina mundial y produce, principalmente, infecciones que afectan los aparatos digestivo y respiratorio (Baker 1987). La infección de hembras en gestación puede producir aborto, muerte perinatal, o el nacimiento de terneros persistentemente infectados (Brownlie 1990). En el año 1994, en Estados Unidos de Norteamérica y en Canadá surgió una enfermedad severa con mortalidad mayor a un 25% que se denominó “síndrome hemorrágico” o “diarrea viral bovina aguda severa”. En todos los casos se aisló VDVB II (Pellerin y col 1994, Ridpath y col 1994). El VDVB II también se ha aislado de bovinos con 248 M O CELEDON Y COL enfermedad clínica moderada o desde animales sin síntomas de enfermedad (Ridpath 2003). En ovinos la infección con el VDVB I o con el VDVB II produce signos clínicos similares a los producidos por el VEF (Giangaspero y Harasawa 2004). En otras especies, como cabras, rumiantes exóticos y camélidos del viejo y nuevo mundo, los signos clínicos producidos por el VDVB son similares a los descritos para el bovino, pero la presentación de la enfermedad es de menor frecuencia (Loken 1995). En Chile el VDVB está ampliamente difundido en el ganado bovino (Reinhardt y col 1990, Celedón y col 1996, Celedón y col 1997ª) identificándose la presencia de los genotipos VDVB I y VDVB II (Aguilera 2001, De Calisto 2001) en el ganado nacional, aunque no se han descrito casos de enfermedad grave. También se ha detectado el VDVB I en ovinos y caprinos (Müller 2003) y anticuerpos neutralizantes para el VDVB en alpacas (Lama pacos) y llamas (Lama glama) ubicadas en la Región Metropolitana (RM) y en contacto con ganado doméstico. Sin embargo, no se han pesquisado animales con anticuerpos para el VDVB en guanacos (Lama guanicoe) de la Región de Aysén y Magallanes ni en vicuñas (Vicugna vicugna) de la Región de Tarapacá (Celedón y col 2001). Debido a que algunos productos obtenidos de los camélidos sudamericanos (CSA), como la fibra, la carne y el cuero, muestran interesantes perspectivas de mercado, en los últimos años se ha tratado de impulsar el desarrollo de esta ganadería, lo que ha llevado a un aumento en la frecuencia de transporte de animales desde el altiplano chileno a diferentes regiones del país. El cambio de ambiente y la posibilidad de contacto con el ganado doméstico facilita la posibilidad de que los CSA se infecten con el VDVB pudiendo hacer cuadros clínicos de variada gravedad y/o servir de reservorio para las especies susceptibles. A base de lo anterior, el objetivo de este trabajo fue aislar e identificar pestivirus desde alpacas y llamas introducidas en la R.M. MATERIAL Y METODOS Muestras. De 42 alpacas y 35 llamas vivas se tomaron muestras de sangre, una llama murió al día siguiente de haberse tomado la muestra. De 2 llamas adultas muertas y de 1 feto de llama abortado se tomaron muestras de tejidos (bazo, ganglios linfáticos, hígado, pulmón o riñón). Todas las muestras provenían de animales entre 4 y 10 años, ubicados en 4 rebaños (A, B, C y D) de 4 comunas diferentes de la R.M. Para el rebaño A se contaba con el antecedente de la existencia de una alpaca y una oveja con anticuerpos para pestivirus y que las alpacas estaban separadas de corrales de bovinos, ovinos y caprinos por no más de tres metros; todos los animales del predio presentaban apariencia de estar sanos. El rebaño B estaba constituido por 200 alpacas, llamas y algunas ovejas; se tenía el antecedente que en un período de 9 meses había ocurrido un episodio de enfermedad respiratoria, digestiva y abortos. De 41 hembras preñadas 26 abortaron muriendo 8 y, además, murió una hembra que parió un mortinato (Miranda 2000); por análisis serológico, de 32 hembras sobrevivientes, en 7 se detectaron anticuerpos para pestivirus (Celedón y col 2001). El rebaño C constituido por 45 llamas; en un período de 4 meses las llamas sufrieron fiebre, 6 abortaron y 5 de ellas murieron, a la necropsia los intestinos se observaron enrojecidos. No se detectaron animales serorreaccionantes a pestivirus. En el rebaño D, 3 de 11 llamas presentaban anticuerpos para pestivirus (Celedón y col 2001); 2 se encontraron muertas, sin antecedentes previos de estar enfermas. De la muestra de sangre sin coagular se extrajeron plasma y leucocitos, mediante un gradiente de densidad de Ficoll Hipaque® (densidad 1,077). De la sangre coagulada se extrajo suero. Los fragmentos de tejidos fueron procesados separadamente para la obtención de inóculos. El plasma, los leucocitos, el suero y los inóculos se conservaron a –40°C hasta ser sometidos al aislamiento viral. Aislamiento viral. Las células y el suero equino, previos a ser usados en el aislamiento viral, fueron verificados de estar libres de infección con el VDVB, por prueba de inmunofluorescencia directa (IFD) que emplea un conjugado fluorescente policlonal para el VDVB∗, y por prueba de inmunoperoxidasa indirecta (IPI) que emplea un “kit” comercial que contiene una mezcla de 4 anticuerpos monoclonales para el VDVB#. En el aislamiento viral se empleó el procedimiento recomendado por la OIE (2000), con algunas modificaciones. Las muestras se inocularon en volumen de 200 ul sobre monocapas de cultivos primarios constituidos por, aproximadamente, 400.000 células de pulmón fetal bovino, en su quinto pasaje, con 24 horas de crecimiento en MEM• adicionado de un 10% de suero equino♦. Luego de incubar por 60 minutos a 37°C se agregó MEM con un 2% de suero equino. Las células inoculadas y sin inocular (a modo de control celular) se incubaron a 37°C por un período de 5 días efectuándose observaciones microscópicas diarias para controlar viabilidad celular, toxicidad de las muestras, efecto citopático y contaminación bacteriana o fúngica. Al quinto día se lisaron mediante 3 ciclos de congelación y descongelación. Los cultivos celulares inoculados con las muestras de suero, plasma y/o linfocitos procedentes de un mismo animal, después del primer pasaje se reunieron en una alícuota para volver a inocularse sobre una nueva monocapa celular; las cosechas * Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Cat. Nº PA 0205-08. # Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Cat. Nº PA 0258. • Medio Esencial Mínimo Eagle, GIBCO BRL Cat. Nº 41500-067. ♦ HyClone Cat. Nº SH 3007403. 249 CAMELIDOS SUDAMERICANOS, DVB, PESTIVIRUS constituidas por muestras de tejidos se continuaron inoculando en forma separada. El proceso se repitió 5 veces. Identificación antigénica de los aislados virales. Para pesquisar la presencia de antígenos de pestivirus se aplicaron las pruebas, antes descritas, de IFD en células crecidas en laminillas dispuestas en tubo y de IPI en células crecidas en microplacas. Identificación genómica de los pestivirus aislados. Los aislados virales obtenidos a partir de los camélidos, e identificados como pestivirus por las pruebas de IFD e IPI, se identificaron genómicamente por RT-PCR y posterior análisis con enzimas de restricción. Para ello se extrajo el ARN total de monocapas de células infectadas con el virus, utilizando Trizol LS, según instrucciones del proveedor (Invitrogen, USA). El ARN obtenido se resuspendió en agua destilada libre de ADNasas y ARNasas y se guardó a –20°C hasta el momento de realizar la PCR. La transcripción inversa del ARN y la posterior amplificación por PCR (RT-PCR) de la región 5' UTR del genoma de los pestivirus se realizó de acuerdo a las condiciones optimizadas en el laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Los partidores utilizados para la RTPCR fueron 326: 5’-TCAACTCCATGTGCCATGTAC- 3’ y 324: 5'-ATGCCCTTAGTAGGATAGCA-3 con ubicación 395-375 y 108-128 en el genoma de la cepa NADL del VDVB, respectivamente (Vilcek y col 1994). La transcripción inversa se realizó en un volumen de 10 ul, bajo las siguientes condiciones: Tris HCl 20 mM; KCl 50 mM; ditiotreitol 5 mM; 10 pmoles de partidor 326; MgCl2 8 mM; dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0,5 mM de cada uno; Thermoscript transcriptasa inversa (GIBCO, USA) 1U; inhibidor de ribonucleasa Rnasa OUT (GIBCO-BRL) 2U. La reacción se realizó por 45 minutos a 55°C y luego se incubó 5 minutos a 90°C para inactivar la enzima. La PCR se realizó en un volumen de 25 ul, de acuerdo a las siguientes condiciones: Tris HCl 20 mM, KCl 50 mM; MgCl2 2 mM; ditiotreitol 2 mM; dATP; dCTP, dGTP, dTTP, 0,2 mM de cada uno; 2U de inhibidor de ribonucleasa Rnasa OUT (GIBCO-BRL); partidor 324 10 pmoles; Taq polimerasa 2,5U (GIBCO) y 10 ul de la reacción de transripción inversa. La PCR se realizó de acuerdo al siguiente programa: desnaturación inicial a 94°C por 2 minutos, seguido de 40 ciclos de alineaciónelongación- desnaturación del ADN a 55°C por 30 segundos, 72°C por 3 minutos y 94°C por 30 segundos. Para el último ciclo el tiempo de extensión fue de 10 minutos. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador con placa difusora de calor (PTC –100. MJ Research Inc). Como control negativo de la reacción de RT-PCR se utilizó el ARN total extraído a partir de monocapas de células de pulmón fetal bovino no inoculadas con muestras y libres de pestivirus. Como control positivo se utilizó el ARN total extraído de monocapas de células de pulmón fetal bovino, infectadas con la cepa NADL del VDVB. El fragmento de ADN amplificado se visualizó por electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5% en tris borato EDTA (TBE) y posterior tinción con nitrato de plata (Espejo y Escanilla 1993). La electroforesis se llevó a cabo a 150 Volt por 1 hora. El fragmento amplificado del ADN se determinó por la detección, en el gel, de una banda de 288 pb. Genotipificación de los aislados de pestivirus. La determinación de los genotipos de los aislados de pestivirus obtenidos a partir de los CSA se realizó a través del análisis de los patrones de fragmentos de ADN, obtenidos luego de cortar el ADN sintetizado por la RT-PCR, con las enzimas de restricción (ER) Bgl I, Xho I y Pst I (RFLP) (cuadro 1) (Vilcek y col 1994, Paton y col 1995b, Harpin y col 1995). Para ello, 50 ng del fragmento de ADN amplificado se incubaron con 5U de cada una de las enzimas de restricción por 3-4 horas a 37°C. Luego, los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% en TBE (150 volt durante 105 minutos) y se tiñeron con nitrato de plata (Espejo y Escanilla 1993). La identificación de los distintos tipos de pestivirus se realizó según lo mostrado en el cuadro 1 (Vilcek y col 1994, Paton y col 1995b, Harpin y col 1995). RESULTADOS En los 4 rebaños de CSA ubicados en la R.M. se detectó presencia de animales infectados con pestivirus. En el rebaño A, se aisló VDVB en la sangre de 5 de las 12 alpacas muestreadas; en el rebaño B, de las muestras de sangre de 32 alpacas, en 5 se aisló pestivirus; en el rebaño C de las muestras de sangre de 22 llamas, en 3 se pesquisó pestivirus, en tanto que desde muestras de bazo, ganglio linfático, hígado, pulmón y riñón obtenidos de una llama adulta muerta y desde muestras de hígado y pulmón obtenidos de un feto abortado, no se aisló pestivirus; en el rebaño D, de las muestras de sangre de 11 llamas, en 4 se pesquisó pestivirus y en una muerta se aisló pestivirus desde las muestras de bazo, ganglio, pulmón y riñón (llama 1.064) (cuadro 2). A excepción de la alpaca 10 del rebaño A, que entregó un resultado negativo a la prueba de IFD y de la llama 796 del rebaño C, en que no fue posible precisar el diagnóstico por la prueba de IFD, las muestras de los 16 camélidos restantes fueron diagnosticadas como positivas por los dos procedimientos empleados (IFD, IPI), sólo hubo diferencias en la cantidad de células que 250 M O CELEDON Y COL demostraron presencia de antígenos de pestivirus y también en la intensidad de la coloración, con respecto a una misma prueba (cuadro 1) En ninguno de los cultivos celulares inoculados, luego de 5 pasajes de las muestras, se detectó presencia de efecto citopático en las monocapas celulares, considerándose a todos los aislados de pestivirus como virus no citopáticos. En todos los virus aislados se pudo amplificar por RT-PCR la región 5’ UTR del genoma viral, confirmando su identificación como pestivirus. Ninguno de los fragmentos de ADN obtenidos por la RT-PCR fue digerido simultáneamente por las enzimas de restricción Pst I, Bgl I y Xho I, lo que indica que no habrían aislados del VPPC. Fragmentos de ADN obtenidos por la RT-PCR a partir de 6 aislados de pestivirus obtenidos desde alpacas, fueron digeridos por las enzimas Pst I y Xho I, lo que identificó a estos pestivirus como virus del genotipo I del VDVB (VDVB-I). Por otra parte, fragmentos de ADN obtenidos de 4 alpacas y de 8 llamas fueron digeridos por la enzima‘Xho I y no fueron digeridos por la enzima Pst I, identificándolos como virus del genotipo II del VDVB (VDVB-II) (cuadro 1). No se observaron fragmentos de ADN digeridos únicamente por la enzima Pst I, lo que indica que ninguno de los pestivirus aquí obtenidos corresponde a un VEF. DISCUSION Al aislar e identificar VDVB en CSA naturalmente infectados, se confirma la infección por pestivirus en los CSA de Chile, preliminarmente detectada a través de la identificación de animales con anticuerpos que neutralizan al VDVB (Celedón y col 2001). El alto porcentaje de aislamientos se atribuye a que se realizó un muestreo dirigido a rebaños de CSA donde se sospechaba de la presencia del virus, dado por la detección de animales serorreaccionantes al VDVB, por antecedentes de la existencia de CSA enfermos con una patología atribuible a pestivirus, y por estar en contacto con ganado bovino, ovino o caprino susceptible de estar infectado con pestivirus. En segundo término, se inoculó, por separado, en diferentes monocapas de células, diferentes inóculos procedentes de un mismo animal, y en tercer lugar se aumentó el número de pasajes de la muestra en los cultivos celulares, de 3 (que es lo recomendado por los estándares) a 5, a base de experiencias previas en el laboratorio, donde se ha observado que muestras que resultan negativas al tercer pasaje se hacen positivas al aumentar el número de pasajes a 5. Si bien con este estudio no es posible conocer el origen de la infección en estos CSA, es probable que lo sea por el contacto con bovinos, lo que se sustenta en que no se detectó presencia de anticuerpos para el VDVB en vicuñas de la Región de Tarapacá y en guanacos de la Región de Aysén y Magallanes (Celedón y col 2001), Cuadro 1. Patrones de digestión de VPPC∗, VDVB I•, VDVB II♦ y VEF# con las ER° Pst I, Bgl I y Xho I. Digestion patterns of classical swine fever virus, bovine viral diarrhea virus genotype I, bovine viral diarrhea virus genotype II and border disease virus with the restriction endonucleases Pst I , Bgl I and Xho I. ER VPPC VDVB I VDVB II VEF F Pst I + + - + Bg1 I + - - - Xho I + + + - +: Digestión del ADN con la enzima - : Ausencia de digestión con la enzima. (Vilcek y col 1994, Paton y col 1995 b, Harpin y col 1995). ∗ virus peste porcina clásica • virus diarrea viral bovina genotipo I ♦ virus diarrea viral bovina genotipo II # virus enfermedad de la frontera ° enzimas de restricción Cuadro 2. Genotipos de los aislados del virus diarrea viral bovina obtenidos de alpacas y llamas de la Región Metropolitana. Genotypes of bovine viral diarrhea virus isolates obtained from alpacas and llamas of the Región Metropolitana. Rebaño Animal IFD(a) IPI(b) Genotipo A Al 2: Al 7: Al 10: Al 12: Al 27: + ++ -++ + +++ +++ ++ ++ II I II II II B Al 285: Al 286: (c) Al 288: (c) Al 345: Al 350: +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ IIIII C Ll 791: (c) Ll 794: (c) Ll 796: ++ +++ ND +++ ++ + II II II D Ll 620: SNI Ll 621: SNI Ll 622: SNI Ll 626: SNI Ll 1064: SNI +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ II II II II II (a)Inmunofl uorescencia directa; (b)Inmunoperoxidasa indirecta; (c)con aborto; Al alpaca; Ll llama; hembra; macho; + menos del 25% de las células con reacción; ++ de 25 a 50% de las células con reacción; +++ sobre el 50% de las células con reacción; ND no determinado; SNI sexo no identifi cado. lugares donde el ganado bovino es escaso o no existe y el ganado ovino se maneja en forma extensiva. Otro antecedente es que los aislados resultaron ser no citopáticos y de genotipo I y II, lo que corresponde a las características de los VDVB obtenidos de bovinos de diferentes regiones del país (Meléndez y Celedón 1995, Celedón y 251 CAMELIDOS SUDAMERICANOS, DVB, PESTIVIRUS col 1997b, Celedón y col 1998, Aguilera 2001, De Calisto 2001) y, en parte, diferente a los pestivirus obtenidos de ovinos y caprinos en que sólo han resultado ser VDVB I, con una proporción similar de aislados citopáticos y no citopáticos (Müller 2003); y, por último, se describe que el ganado bovino es la fuente de infección más probable para los CSA (Wentz y col 2003). La literatura señala que los pestivirus no serían patógenos importantes para los CSA, dado que la inoculación experimental de llamas, con aislados de VDVB, no produjo enfermedad y la respuesta de anticuerpos seroneutralizantes fue pobre (Wentz y col 2003). Además, los únicos antecedentes clínicos existentes señalan que el VDVB se ha aislado desde llamas con descarga nasal excesiva y con diarrea (Evermann y col 1993, Mattson 1994). Sin embargo, en este estudio, a excepción del rebaño A, que fue el único en que no se registraban antecedentes de enfermedad clínica al momento de tomar las muestras, en los otros tres había fuertes sospechas de la participación de un pestivirus. Se suma a lo anterior el hecho de que nunca se detectó efecto citopático en los cultivos celulares, haciendo poco probable la participación de otros virus en los cuadros clínicos, tales como virus herpes, virus parainfluenza o adenovirus, entre otros, que son virus que producen efecto citopático en los cultivos celulares. En definitiva, se concluye que las alpacas y llamas introducidas a la R.M. están infectadas con VDVB I y VDVB II, desconociéndose el lugar y fuente de la infección, pero sospechándose del rol de los bovinos en la transmisión del virus. Además, se sospecha fuertemente del VDVB como agente responsable de los graves cuadros clínicos observados en estas especies. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren a futuro estudiar el impacto de la infección con cepas nacionales de pestivirus en la salud de los CSA y, además, evaluar el probable rol de los CSA como especies reservorio del virus, tanto para rumiantes domésticos como silvestres. RESUMEN El ambiente natural para más del 90% de las alpacas (Lama pacos) y llamas (Lama glama), camélidos sudamericanos (CSA) domésticos de Chile, se ubica entre los 11° y 21° latitud sur a 3.800 y 5.000 m de altitud. En el último tiempo las alpacas y las llamas han sido introducidas en otros lugares geográficos del país, donde toman contacto con rumiantes domésticos, facilitándose la infección con el virus diarrea viral bovina (VDVB) que está presente en bovinos, ovinos y caprinos de Chile. El VDVB incluye a dos especies, VDVB genotipo I y VDVB genotipo II, que junto con el virus de la enfermedad de la frontera (VEF) y el virus de la peste porcina clásica (PPC) conforman el género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Este estudio evalúa la hipótesis que los CSA introducidos en la Región Metropolitana (R.M.) de Chile están infectados con pestivirus. Para hacer el aislamiento viral se tomaron muestras de 80 CSA de la RM, 42 alpacas y 35 llamas vivas, 2 llamas muertas y un feto abortado provenientes de 4 rebaños sospechosos de estar infectados con pestivirus. Las muestras fueron inoculadas en cultivos celulares primarios de pulmón fetal bovino (libre de VDVB), subcultivando por 5 veces cada muestra. Para detectar antígenos de pestivirus, las células con las muestras fueron analizadas por prueba de inmunofluorescencia directa y de inmunoperoxidasa indirecta. Para la caracterización molecular, una fracción del fragmento no traducido del genoma viral (5’UTR) de los aislados fue amplificado por RT-PCR y posteriormente, para identificar las especies virales, fue tratado con las enzimas de restricción Bgl I, Pst I y Xho I. Los resultados muestran que 18 CSA, 10 de alpacas y 8 de llamas de los 4 rebaños estudiados estaban infectadas con pestivirus. Todos los aislados fueron no citopáticos. En 6 alpacas se aisló VDVB I y en 4 alpacas y 8 llamas se aisló VDVB II. El virus fue obtenido desde 8 alpacas sanas, 2 alpacas con aborto, 5 llamas sanas, 2 llamas con aborto y una llama muerta sin antecedentes de enfermedad clínica. Se concluye que alpacas y llamas ubicadas en 4 rebaños de la R.M. se encuentran infectados con el VDVB genotipo I y con el VDVB genotipo II. REFERENCIAS Aguilera M. 2001. Caracterización genotípica de aislados nacionales del virus diarrea viral bovina (VDVB) mediante enzimas de restricción. Memoria de titulación, Escuela de Ciencias Veterinarias. Universidad de Chile. Baker J C. 1987. Bovine viral diarrhea virus: A review. J Am Vet Med Assoc 190, 1449-1457. Becher P, M Orlich, A D Shannon, G Horner, M Konig, H J Thiel. 1997. Phylogenetic analysis of pestiviruses from domestic and wild ruminants. J Gen Virol 78, 357-1366. Becher P, M Orlich, A Kosmidou, M König, M Baroth, H J Thiel. 1999. Genetic diversity of pestiviruses: identification of novel groups and implications for classification. Virology 262, 64-71. Brownlie J. 1990. The pathogenesis of bovine virus diarrhoea virus infections. Rev Sci Technical 9, 43-59. Celedón M, C Vargas, A Salinas, A Casanova, L Ibarra, P Berríos. 1996. Prevalencias serológicas para el virus de la diarrea viral bovina y de la rinotraqueítis infecciosa bovina en predios lecheros de la Región Metropolitana de Chile. Av Cs Vet 11, 75-80. Celedón M, L Palacios, J Pizarro, L Ibarra. 1997a. Prevalencia de anticuerpos seroneutralizantes para el virus de la diarrea viral bovina en ganado de carne de la Región Metropolitana de Chile. Av Cs Vet 12, 98-100. Celedón M, L Roco, G Quinteros, M Santibáñez, P Berríos. 1997b. Puesta en evidencia del virus diarrea viral bovina en bovinos clínicamente afectados. Arch Med Vet 29, 189-195. Celedón M, J Carbonell, L Ibarra, J Pizarro. 1998. Detección de bovinos portadores e inmunotolerantes al virus de la diarrea viral bovina en predios lecheros de la Región Metropolitana. Chile. Arch Med Vet 30, 125-132. Celedón M, A Sandoval, J Droguett, R Calfío, L Ascencio, J Pizarro, C Navarro. 2001. Pesquisa de anticuerpos seroneutralizantes para pestivirus y herpesvirus en ovinos, caprinos y camélidos sudamericanos de Chile. Arch Med Vet 33, 165-172. Corapi W V, R O Donis, E Dubovi. 1990. Characterization of a panel of monoclonal antibodies and their use in the study of the antigenic diversity of bovine viral diarrhea virus. Am J Vet Res 51, 1388- 1394. De Calisto, A. 2001. Caracterización genotípica de los aislados nacionales del virus diarrea viral bovina (VDVB) mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Memoria de titulación, Escuela de Ciencias Veterinarias. Universidad de Chile. Espejo R, D Escanilla. 1993. Detection of HIV 1 DNA by a simple procedure of polimerase chain reaction using “primer-dimer” formation as a internal control of amplification. Res Virol 144, 243-246. Evermann JF, ES Berry, TV Baszler. 1993. Diagnostic approaches for the detection of bovine viral diarrhea (BVD) virus and related pestiviruses. J Vet Diagn Invest 5, 265-269. 252 M O CELEDON Y COL Giangaspero M, R Harasawa. 2004. Genetic variety of bovine viral diarrhea virus 2 strains isolated from sheep. J Vet Med Sci 66, 323-326. Harasawa R, M Giangaspero, G Ibata, PJ Paton. 2000. Giraffe strain of pestivirus: its taxonomic status based on the 5’-untranslated region. Microbio Immunol 44, 915-921. Harpin S, S Medí Elahi, E Cornaglia, R H Yolken, Y Elazhary. 1995. The 5’- untranslated region sequence of a potential new genotype of bovine viral diarrhea virus. Arch Virol 140, 1285-1290. Lee K, J Gillespie. 1957. Propagation of virus diarrhea virus of cattle in tissue culture. Am J Vet Res 18, 952-955. Loken T. 1995. Ruminant pestivirus infections in animals other than cattle and sheep. Vet Clin North Am Food Anim Pract 11, 597-614. Mattson DE. 1994. Viral diseases. Update on llamas medicine. Vet Clin North Am Food Anim Pract 10, 345-351. Meléndez P, MO Celedón. 1995. Pesquisa del virus diarrea viral bovina desde un cuadro respiratorio atípico en novillo. Av Cs Vet 10, 83-85. Miranda P. 2000. Determinación ultrasonográfica de los períodos de pérdidas embrio-fetales durante la gestación en alpacas (Lama pacos). Memoria de titulación, Escuela de Ciencias Veterinarias. Universidad de Chile. Müller C. 2003. Aislamiento e identificación de pestivirus y herpesvirus obtenidos de ovinos y caprinos de Chile. Memoria de titulación, Escuela de Ciencias Veterinarias. Universidad de Chile. OIE. Office International des Épizooties. 2000. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccine. Chapter X.5. Paton DJ, JJ Sands, PM Roehe. 1991. BVD monoclonal antibodies: relationship between viral protein specificity and viral strain specificity. Arch Viro Suppl 3, 47-54. Paton DJ, JJ Sands, JP Lowings, JE Smith, G Ibata, S Edwards. 1995a. A proposed division of the pestivirus genus using monoclonal antibodies, supported by cross-neutralization assays and genetic sequencing. Vet Res 26, 92-109. Paton D.J, U Carlsson, JP Lowings, JJ Sands, S Vilcek, S Alenius. 1995b. Identification of herd-specific bovine viral diarrhoea virus isolates from infected cattle and sheep. Vet Microbiol 43, 283-294. Pellerin C, J Van Den Hurk, J Lecomte, P Tussen. 1994. Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities. Virology 203, 260-268. Reinhardt G, S Riedemann, S Ernst, M Aguilar, M Enriquez, J Gallardo. 1990. Seroprevalence of bovine viral diarrhea/mucosal disease in Southern Chile. Prev Vet Med 10, 73-78. Ridpath JF. 2003. BVDV genotypes and biotypes: practical implications for diagnosis and control. Biologicals 31, 127-131. Ridpath JF, SR Bolin, EJ Dubovi. 1994. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes. Virology 205, 66-74. Ridpath JF, JD Neill, M Frey, JG Landgraf. 2000. Phylogenetic, antigenic and clinical characterization of type 2 BVDV from North America. Vet Microbiol 77, 145-155. Vilcek S, S Belák. 1996. Genetic identification of pestivirus strain Frijters as a border disease virus from pigs. J Virol Methods 60, 103-108. Vilcek S, AJ Herring, PF Nettleton, JP Lowings, DJ Paton. 1994. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch Virol 136, 309-323. Walz PH, JC Baker, TP Mullaney, JB Kaneene, RK Maes. 1999. Comparison of type I and type II bovine viral diarrhoea virus infection in swine. Can J Vet Res 63, 119-123. Wentz PA, EB Belknap, KV Brock, JK Collins, DG Pugh. 2003. Evaluation of bovine viral diarrhea virus in New World camelids. J Am Vet Med Assoc 223, 223-228. Xue W, F Blecha, HC Minocha. 1990. Antigenic variations in bovine viral diarrhea viruses detected by monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 28, 1688-1693

PROSPECCIÖN SEROLÓGICA DEL VIRUS PARAINFLUENZA-3 EN CAMÉLIDOS SUDSMERICANOS

Prospección serológica del virus parainfluenza 3 en camélidos sudamericanos en Chile A serological survey of parainfluenza-3 virus in South American camelids from Chile CP Cepeda, C Navarro, MO Celedón * Arch Med Vet 43, 177-179 (2011) Departamento de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile. * Casilla 2 correo 15, Santiago, Chile; oceledon@uchile.cl. SUMMARY A total of 370 sera collected from 87 alpacas (Lama pacos), 88 llamas (Lama glama), 89 guanacos (Lama guanicoe) and 106 vicunas (Vicugna vicugna) were investigated for the presence of antibodies to parainfluenza 3 virus (PIV-3). Hemagglutination inhibition test indicated that a total of 91 (24.6%) South American camelids (SAC) had PIV-3 antibodies, including 18 (20.7%) alpacas, 36 (40.9%) llamas, 27 (18.9%) vicunas and 10 (11.2%) guanacos. Titers of the positive samples ranged from 8 to 256 with a geometric mean of 31. These results establish that SAC in Chile are infected with PIV-3. Key words: serology, South American camelids, parainfluenza virus 3. RESUMEN En un total de 370 sueros obtenidos de 87 alpacas (Lama pacos), 88 llamas (Llama glama), 89 guanacos (Lama guanicoe) y 106 vicuñas (Vicugna vicugna) se investigó la presencia de anticuerpos para el virus parainfluenza 3 (VPI-3). La prueba de inhibición de la hemoaglutinación mostró que 91 (24,6%) de los camélidos sudamericanos (CSA) distribuidos en 18 (20,7%) alpacas, 36 (40,9%) llamas, 27 (18,9%) vicuñas y 10 (11,2%) guanacos tenían anticuerpos. El rango de los títulos de las muestras positivas estuvo entre 8 y 256 con una media geométrica de 31. Los resultados establecen que los CSA en Chile están infectados con VPI-3. Palabras clave: serología, camélidos sudamericanos, virus parainfluenza 3. INTRODUCCIÓN Los camélidos en Sudamérica están representados por cuatro especies, dos domésticas: la alpaca (Lama pacos) y la llama (Lama glama) y dos silvestres: el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugna vicugna). La población de camélidos sudamericanos (CSA) estimada en Chile es de 179.589 animales, ubicándose el mayor número de animales domésticos en el altiplano de la Región de Arica y Parinacota y Región de Tarapacá. En cuanto a los camélidos silvestres, casi la totalidad de las vicuñas se encuentra en las dos regiones antes mencionadas, y la mayor concentración de guanacos se sitúa en la Región de Magallanes y la Antártica Chilena. A pesar de que los camélidos domésticos representan sólo el 1% de la producción pecuaria nacional, su mayor importancia radica en que son el sustento para pueblos originarios que viven en condiciones geográficas extremas, como el altiplano chileno (FIA 2000). Mediante prospecciones serológicas en CSA ubicados en diferentes zonas geográficas de Chile, se ha detectado seropositividad para el virus herpes equino 1 (Vergara 2004) y para el virus de la diarrea viral bovina (Celedón y col 2001), a la vez que se ha aislado el virus diarrea viral bovina desde animales sanos y enfermos (Celedón y col 2006). Hasta ahora se desconoce si los CSA de Chile están infectados con el virus parainfluenza-3 (VPI-3). El VPI-3 pertenece al género Respirovirus de la familia Paramyxoviridae y es responsable de producir enfermedad respiratoria en animales rumiantes domésticos y silvestres (Murphy y col 1999). En Chile, el virus fue aislado desde un bovino con enfermedad respiratoria (Berríos y col 1985) y desde el pulmón de un cordero con lesiones neumónicas (Berríos y col 1991). Mediante prospecciones serológicas y estudios de prevalencia serológica se han detectado anticuerpos en bovinos de la Provincia de Valdivia (Reinhardt y col 1980), en bovinos de la zona central-sur (Berríos y col 1983), en ovinos de las Regiones de Valparaíso y del Libertador General Bernardo O’Higgins (Berríos y col 1987) y en ovinos de la Región de Los Lagos (Riedemann y col 1991). En este trabajo se plantea como objetivo conocer si los CSA de Chile se han infectado con VPI-3 a través de la detección de anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación en muestras de suero. MATERIAL Y MÉTODOS MUESTRAS Para conocer si los CSA se han infectado con el VPI-3 se utilizó un total de 370 muestras de sueros procedentes de 87 alpacas, 88 llamas, 89 guanacos y 106 vicuñas. Las muestras de sangre fueron obtenidas entre los años 2000 y 2006 por punción de la vena yugular de animales adultos clínicamente sanos mediante un muestreo no aleatorio. Las muestras de alpacas procedían de cuatro rebaños ubicados en la Región Metropolitana; las de llamas, de cuatro rebaños de la Región Metropolitana y de 10 rebaños de la Región de Arica y Parinacota; las muestras de guanacos se obtuvieron de animales capturados y mantenidos en cautiverio procedentes de un rebaño de la Región Metropolitana y de un rebaño de la Región de Magallanes y la Antártica Chilena; las muestras de vicuñas se obtuvieron de animales mantenidos en semicautiverio en tres localidades de la Región de Arica y Parinacota. Antes de realizar la prueba serológica los sueros se sometieron a 56 °C por 30 minutos, se trataron con caolín al 25% y se adsorbieron con eritrocitos de cobayo, con el fin de eliminar las proteínas termolábiles del complemento, los inhibidores inespecíficos de la hemoaglutinación y remover posibles autohemoaglutininas (Chanock y Johnson 1964). PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN (IHA) Se seleccionó esta prueba en virtud de que es la frecuentemente empleada para detectar anticuerpos contra el VPI-3. El antígeno viral consistió en VPI-3 aislado de bovino, previamente propagado en cultivos celulares de pulmón fetal bovino y titulado por prueba de hemoaglutinación (Chanock y Johnson 1964). La prueba se realizó en microplacas de 96 pocillos, para lo cual se hicieron diluciones en base 2 desde 1:8 hasta 1:256 en solución tampón fosfato salino (PBS 0,01 M pH 7,2) en volúmenes de 50 µl. Cada dilución de suero se mezcló, en igual volumen, con una dilución de virus que contiene ocho unidades hemoaglutinantes (UHA). Luego de incubar a 25 °C durante 60 minutos, se agregaron eritrocitos de cobayo lavados y suspendidos al 1% en PBS. En forma paralela, se realizaron controles de suero, de eritrocitos y de UHA del virus. Después de una segunda incubación por 40 minutos, se realizó la lectura de la prueba que consistió en determinar la dilución del suero con capacidad de inhibir la acción de cuatro UHA del virus (Chanock y Johnson 1964). Se consideraron como muestras positivas aquellas en que diluciones iguales o mayores a ocho tuvieron la capacidad de inhibir las cuatro UHA del virus y se interpretó como evidencia de infección con un VPI-3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el cuadro 1 se muestra que de las 370 muestras de sueros de CSA, 91 (24,6%) presentaron anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación (AcIHA) para el VPI-3 con valores entre ocho y 256, con una media geométrica de 31 positivos. La especie que presentó mayor número de reaccionantes positivos correspondió a las llamas, con un 40,9%, y el menor número de reaccionantes positivos se obtuvo en los guanacos con un 11,2%. La razón de esto podría deberse a diferencias en la susceptibilidad de infección entre las dos especies y a las posibilidades de contacto con animales infectados tratándose de una especie doméstica, la llama, y de una especie silvestre, el guanaco, a pesar de encontrarse, esta última, en cautiverio. En el cuadro 2 se muestra la distribución geográfica de los animales con anticuerpos para el VPI-3. En él se observa que los cuatro rebaños de alpacas y los cuatro rebaños de llamas ubicados en la Región Metropolitana tienen a lo menos un animal con anticuerpos anti-VPI-3. De igual forma, ocho de los 10 rebaños de llamas de la Región de Arica y Parinacota y los tres rebaños de vicuñas fueron reaccionantes al VPI-3. Estos antecedentes permiten establecer que el virus está presente en la población de CSA de Chile y considerar, de mayor importancia, su presencia en las regiones que concentran el 90% de la población de alpacas, llamas y vicuñas del país. Al respecto, Martín (2010) señala que una de las principales limitaciones en la producción de CSA es la elevada mortalidad de las crías, debido al manejo inadecuado y a las enfermedades infecciosas produciendo pérdidas que superan el 50% de los animales nacidos, lo que origina la pérdida de unidades productivas tanto para el autoconsumo como para la comercialización. Bajo este concepto, el VPI-3 podría tener una activa participación y su control, mediante medidas profilácticas como son el manejo adecuado de las crías, la disminución de las condiciones de estrés y el eventual empleo de vacunas, contribuiría a reducir las pérdidas productivas, lo que redunda en una mejora de las condiciones de vida de las comunidades andinas. Cuadro 1. Distribución de títulos de anticuerpos antivirus parainfluenza 3 en camélidos sudamericanos de Chile. Distribution of parainfluenza 3 antibody titers among Chilean South American camelids. * Recíproco de la dilución de suero que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de virus parainfluenza 3. ** Títulos mayores o iguales a ocho se consideran positivos. *** Media geométrica. Cuadro 2. Frecuencia de camélidos sudamericanos en rebaños de diferentes lugares geográficos de Chile serológicamente reaccionantes y no reaccionantes al virus parainfluenza 3. Frequency of parainfluenza- 3 sero-positive and sero-negative animals from South American camelid herds from various geographical locations of Chile. * Región de Arica y Parinacota. ** Región de Magallanes y Antártica Chilena. AGRADECIMIENTOS A la Corporación Nacional Forestal Chile y a la Planta Faenadora de Carnes de Arica, por la cooperación en la toma de muestras. REFERENCIAS Berríos P, MO Celedón, A Pinto d'Aguiar, G González. 1983. Parainfluenza-3: Estudio serológico en bovinos de la zona sur de Chile (VIII, IX y X Regiones). Arch Med Vet 15, 73-79. Berríos P, MO Celedón, M Duchens, L Lorca. 1985. Aislamiento del virus parainfluenza - 3 de bovinos con sintomatología respiratoria. Monografías Medicina Veterinaria 7, 61-62. Berríos P, P Pérez, MO Celedón, R Zúñiga. 1987. Parainfluenza-3: Estudio serológico en ovinos de la zona central de Chile (V y VI Regiones). Arch Med Vet 19, 7-11. Berríos P, C González, J Enciso, M Santibáñez. 1991. Aislamiento del virus parainfluenza tipo 3 en ovinos con neumonía. Av Cs Vet 6, 185-186. Celedón MO, A Sandoval, J Droguett, R Calfío, L Ascencio, J Pizarro, C Navarro. 2001. Pesquisa de anticuerpos seroneutralizantes para pestivirus y herpesvirus en ovinos, caprinos y camélidos sudamericanos de Chile. Arch Med Vet 19, 7-11. Celedón MO, J Osorio, J Pizarro. 2006. Aislamiento e identificación de pestivirus obtenidos de alpacas (Lama pacos) y llamas (Lama glama) de la Región Metropolitana, Chile. Arch Med Vet 38, 247-252. Chanock RM, KM Johnson. 1964. Parainfluenza viruses. In: Lennete EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Diseases. 3rd ed. American Public Health Association, INC. Broadway, New York, USA, Pp 470-486. FIA, Fondo Innovación Agraria. 2000. Proyecto Camélidos en Chile: Situación Actual y Perspectivas. FIA, Ministerio de Agricultura, Santiago, Chile. Martín C, CE Pinto, MD Cid. 2010. Camélidos sudamericanos: Estado sanitario de sus crías. Revista Complutense de Ciencias Veterinarias 4, 37-50. Murphy F, E Gibbs, M Horzinek, MJ Studdert. 1999. Paramyxoviridae. In: Murphy F, Gibbs E, Horzinek M, Studdert MJ (eds). Veterinary Virology. 3ª ed. Academic Press, California, USA, Pp 411-428. Reinhardt G, M Polette, M Cano. 1980. Prospección serológica del virus parainfluenza-3 en bovinos de la provincia de Valdivia. Zbl Vet Med B 27, 144-148. Riedemann S, N Tadich, G Reinhardt, M Montecinos, M Aguilar. 1991. Pesquisa serológica de PI-3, BHV-1 y BVDV en ovinos de 11 predios de la X Región, Chile. Arch Med Vet 23, 185-187. Vergara F. 2004. Primera detección en Chile de anticuerpos seroneutralizantes contra herpesvirus equino tipo 1 en camélidos sudamericanos. Memoria de título, Escuela de Ciencias Veterinarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.