CARACTERIZACIÓN DEL VIRUS INFLUENZA EQUINO CEPAS A/EQUI/1/SANTIAGO 77 (H7N7) Y A/EQUI/2/SANTIAGO 85 (H3N8). MO Celedón, L. Palominos, M Santibáñez y P Berríos 1993

• Caracterización del virus influenza equina cepas A/equi/1/Santiago 77 (h7n7) y A/equi/2/Santiago 85 (H3N8)

• María O. Celedón V.¹,
• Luz Palominos S.²,
• María de la Cruz Santibáñez Z.³,
• Patricio Berríos E.⁴

DOI: 10.5354/0716-260X.1993.6122

1 Virología. Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 2 Virología. Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 3 Virología. Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 4 Virología. Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile

Resumen

Se investigaron las principales características mor­fológicas, físicas, bioquímicas, serológicas y cultu­rales de dos aislados nacionales del virus influenza equina, cepas A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) y A/equi/2/Santiago 85 (H3N8).

Ambas cepas presentaron un marcado pleomor­fismo, con un diámetro entre 80 y 120 nm. Fueron sensibles a la acción de solventes lipídicos, tempe­ratura de 5º C por 30 minutos y pH 3,0; el pH 9,0 no las afectó. antisueros homólogos, de referencia y nacionales, inhibieron la capacidad hemoaglutinan­te de ambas cepas, lo que no ocurrió en la reacción heteróloga. Las dos cepas produjeron efecto de he­moadsorción y de desprendimiento celular en culti­vos celulares primarios de riñón fetal ovino y de fibroblastos de embrión de pollo y en las líneas celulares de riñón fetal bovino (MDBK) y de riñón fetal equino. Este efecto fue neutralizado, en las células MDBK, por antisueros homólogos y no por los heterólogos.

Se concluye que ambas cepas virales, tipificadas como A/equi/l/Santiago 77 (H7N7) y A/equi/2/San­tiago 85 (H3N8), presentan las características mor­fológicas, físicas, bioquímicas, serológicas y cultu­rales descritas para la familia Orthomyxoviridae género Influenza.

Palabras claves: Virus, influenza equina, equinos.

Abstract

The main characteristics of two Chilean strains of equine influenza virus A/equi/1/Santiago/77 (H7N7) and A/equi/2/Santiago/85 (H3N8) were studied.

Both strains were pleomorphic with small surface proyections and a diameter of 80 to 120 nm. They were sensitive to treatment with lipid solvents, ether and chloroforrn, temperature of 56º C for 30 minutes and pH 3.0; pH 9.0 did not affect them. Homologous antisera neutralized and inhibited the haemoagglutination capacity of the strains but they were unaffected by heterologous antisera. Both strains produced cytopathic effect (CPE), in the first passage in fetal lamb kidney and chick embryos fibroblasts, and in the second passage in fetal bovine kidney (MDBK) and fetal equipe kidney. The CPE, consisted in the appearance of a large amount of floating cells which adquired hemoadsorption capacity. The CPE was inhibited when a mixture of virus and homologous antiserum was inoculated in MDBK.

It is concluded that both Oral strains named as A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) and A/equi/2/Santiago 85 (H3N8) have morphological, physical, biochernical, serological and cultural characteristics described for the family Orthornyxoviridae genus Influenza.

Key words: Virus, equine influenza, horses.

Introducción

La influenza equina (IE) es una enfermedad cosmo­polita que afecta principalmente el tracto respirato­rio superior de los animales, es de diseminación rápida y generalmente provoca brotes explosivos en la población de equinos. El principal problema oca­sionado por esta enfermedad, es el impacto econó­mico expresado por la interrupción del entrena­miento, deterioro de la condición física, costo en medicamentos, atención veterinaria y en algunos casos la muerte del animal debido a complicaciones secundarias (Berríos y Celedón, 1992; Sarasola y col., 1992).

El agente causal de la IE pertenece a la familia Orthomyxoviridae género Influenza (Melnick, 1982). Su genoma está constituido por una hebra de ARN dividido en ocho segmentos, dispuesta en for­ma helicoidal y unido a proteínas, además presenta una cubierta proteica, la cual se rodea por una envol­tura externa lipídica de la que sobresalen proyeccio­nes glicoproteicas que representan a las hemoaglu­tininas y neuroaminidasa. El tamaño del virión varía entre 80 y 120 nm, observándose partículas pleo­mórficas con predominancia de la forma esférica (Paccaud, I969).

Los virus de la IE se han clasificado en base a su estructura antigénica en dos subtipos A/equi/1 y A/equi/2, cuyas cepas prototipos son A/equi/1/Pra­ga 56 y A/equi/2/Miami 63, denominados actual­mente H7N7 y H3N8, respectivamente.

Cepas pertenecientes al prototipo A/equi/1/Praga 56 (H7N7) no se han aislado en el mundo desde 1980, aunque hay evidencias serológicas para el H7N7 en caballos no vacunados hasta 1980 (Webster, 1992). Cepas pertenecientes al prototipo A/equi/2/Miami 63 (pN8) están prevalentes y son causantes de brotes epidémicos. Se describe el sur­gimiento de variantes antigénicas menores del subtipo A/equi/2 (H3N8) (Cruciere y col., 1989; Cham­bers, 1992; Alstad y col., 1993; Guo y col., 1991). La técnica de elección para aislar y replicar el virus de la IE es la inoculación en huevos embriona­dos de gallina, vía sacoalantoídea; además se ha descrito su replicación en cultivos celulares. Según Coggins y Kemen (1975), los huevos embrionados son más sensibles que los cultivos celulares para aislar virus influenza equina, debido a que los ort­homyxovirus producen un débil efecto citopático (ECP) en cultivos celulares, necesitándose varios pasajes del virus antes que se visualice dicho efecto, el que puede ser detectado por adsorción específica de eritrocitos en las células infectadas.

Yamagishi y col. (1981) al probar la susceptibi­lidad de diversos cultivos celulares, encontraron que ambos subtipos del virus de la IE producían ECP en todas las líneas celulares inoculadas. De acuerdo con este resultado, Yamagishi y col. (1982) realiza­ron una prueba de infecciosidad viral en células ESK, concluyendo que el procedimiento era simple y tan sensible como el método de la infectividad viral en huevos embrionados, aplicándolo para re­alizar pruebas de seroneutralización. Posteriormen­te, Yamagishi y col. (1984) desarrollaron un método de ensayo de placa en células ESK, adaptándolo para realizar pruebas de seroneutralización.

Cook y Cook (199I) demuestran que la línea celular de riñón canino Madin-Darby es significati­vamente más sensible que los huevos embrionados de gallina para la producción de antígeno a/equi/2 (H3N8) para la prueba de IHA.

El objetivo de este estudio es determinar las principales características morfológicas, físicas, bioquímicas, serológicas y culturales de las cepas chilenas A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) y A/equi/2/ Santiago 85 (H3N8), del virus influenza equina.

Material y métodos

Cepas vírales. Se utilizaron dos cepas del virus influenza equina designadas como A/equi/1/San­tiago/77 (H7N7) (Casanova y col., 1977) y A/equi/2/Santiago/85 (H3N8) (Berríos y col., 1986) cultivadas en huevos embrionados de gallina. Las suspensiones virales, contenidas en líquido alantoí­deo, fueron tituladas midiendo su capacidad hemo­aglutinante en la prueba de hemoaglutinación (HA) en microtítulo (Celedón y col., 1982), y su infeccio­sidad a través de la prueba dosis infectante embrión de pollo (DIEP 50).

Antisueros. Para producir antisueros contra las cepas vírales en estudio se utilizó el procedimiento descrito por Plateau y col., (1983) que consiste en inocular gallos adultos con una serie de cuatro in­yecciones de 5 ml de suspensión viral, cada una administrada por vía intramuscular, con intervalos de una semana. Los sueros obtenidos se inactivaron a 56° C durante 30 minutos, y fueron tratados con Caolín al 25% para eliminar inhibieres termolábi­les e inespecíficos de la hemoaglutinación. Los sue­ros de referencia, antivirus a/equi/1/Praga 56 (H7N7) y A/equi/2/Miami/63 (H3N8), fueron faci­litados por el Instituto Merieux de Francia.

El estudio serológico se realizó empleando la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) (Celedón y col., 1982) y el índice neutralizante (IN) en huevos embrionados (Cunningham, 1971).

Microscopía electrónica. El tamaño y forma de la partícula viral se determinó a través de microscopía electrónica, tinción negativa con ácido fosfotúngsti­co 1%. La suspensión viral fue centrifugada previa­mente a 80.000 x G por 1 hora (Burrows y col., 1981).

Sensibilidad a agentes físicos y químicos Alicuo­tas de los virus en estudio se sometieron a los si­guientes tratamientos. 56º C por 30 minutos en un baño termorregulado (Legrottaglie, 1980), adición de éter 25% a 4º C durante 18 horas en constante agitación (Andrewes y Horstmann, 1949); adición de cloroformo 10% a 4º C durante 1 hora en agita­ción (Martone y col. 1973); adición de solución tampón citrato pH 3,0 a 4º C durante 15 minutos y posterior ajuste a pH 7,0 con una solución de NaOH 0,25 M (Martone y col., 1973), adición de una solu­ción tampón borato pH 9,0 (10%) a 4º C durante 15 minutos y posterior ajuste a pH 7,0 con una solución del HCl 0,25 M (Martone y col., 1973).

Multiplicación viral en cultivos celulares. Las cepas vírales se inocularon en cultivos primarios de riñón fetal ovino (RFO) y de fibroblastos de em­brión de pollo (FEP) y en las líneas celulares de riñón fetal bovino (MDBK) y de riñón fetal equino (RFE) (Gaggero, 1984). Las células inoculadas se observaron diariamente, considerándose como ne­gativas aquellas en que no apareció efecto citopáti­co (ECP) en 4 días, luego de un mínimo de tres pasajes sucesivos. En todos los cultivos celulares inoculados con virus o en los controles, se realizo una prueba de hemoadsorción con eritrocitos de gallina al 0,5% a 4ºC durante 20 minutos (Pette y Teufel, 1966).

Resultados

Las cepas A/equi/1/Santiago/77 y A/equi/2/Santia­go/85 del virus influenza equina presentaron títulos infectantes entre 10^7.2 y l0^8,6 DIEP 50/ml y un título HA entre 128 y 256.

Los sueros anticepas A/equi/1/Santiago/77 y A/equi/2/Santiago/85 tuvieron títulos IHA de 64 y 16, e IN de ≥ 6,5 y ≥ 4,5 respectivamente. Los sueros de referencia presentaron un título IHA de 32 frente a las cepas de referencia A/equi/1/Praga/56 (H7N7) y A/equi/2/Miami/63 (H3N8). No hubo in­hibición de la hemoaglutinación ni neutralización en las reacciones con las cepas heterólogas.

Las partículas virales observadas en microscopio electrónica presentaron un marcado pleomorfismo, con formas irregulares, alargadas y circulares. El diámetro de estas partículas fue de 80 a 120 nm, apreciándose una envoltura externa de la que se pro­yectaban pequeñas espículas o proyecciones.

Ambas cepas vírales fueron muy sensibles al tratamiento de 56ºC, pH 3,0, éter y cloroformo, perdiendo el 100% de su infectividad, aunque man­teniendo su capacidad hemoaglutinante. El trata­miento con pH 9,0 no afectó significativamente su capacidad infecciosa (Cuadro 1).

CUADRO 1 SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS A/EQUI/1/SANTIAGO/77 (H7N7) Y A/EQUI/2/SANTIAGO 85 (H3N8) FRENTE A TRATAMIENTOS DE 56°C POR 30 MINUTOS, pH 3,0 Y 9,0, ÉTER Y CLOROFORMO

Cepa viral	Tratamiento	Título log DIEP 50/ml
A/equi/1/Santiago 77 (H7N7)	56°C	≤ 1,0
	pH 3,0	≤ 1,0
	pH 9,0	8,5
	Éter	≤ 1,0
	Cloroformo	≤ 1,0
	Control	8,5-8,6
A/equi/2/Santiago 85 (H3N8)	56°C	≤ 1,0
	pH 3,0	≤ 1,0
	pH 9,0	6,2
	Éter	≤ 1,0
	Cloroformo	≤ 1,0
	Control	7,2-7,6

Las cepas vírales en estudio al ser inoculadas en células de RFO y FEP, provocaron la aparición de ECP en el primer pasaje. El ECP se inició a las 24 horas después de la inoculación y se caracterizó por la presencia de gran cantidad de células desprendi­das sobre la monocapa celular; a las 72 horas la monocapa se destruyó totalmente. El ECP descrito se observó al menos durante cuatro pasajes seriados. La prueba de hemoadsorción fue positiva en los cultivos celulares con ECP. En los controles no se observó ECP ni hemoadsorción.

En células de riñón fetal bovino (MDBK) y RFE sólo se produjo un ECP débil a las 48 horas después de la inoculación en un segundo pasaje; el ECP consistió en células dispersas sobre la monocapa celular. Luego de un tercer y cuarto pasaje el ECP fue más marcado y demoró menos tiempo en apare­cer. La prueba de hemoadsorción fue positiva en los cultivos celulares con ECP y negativa en los contro­les.

En las células MDBK inoculadas con mezclas de suero con virus influenza equino homólogo no hubo ECP ni hemoadsorción, lo que implica que ambas cepas vírales fueron neutralizadas en su efecto por sus respectivos antisueros. Al inocular mezclas de virus con sus sueros heterólogas se observó ECP y hemoadsorción.

Discusión

Las partículas virales observadas en microscopio electrónica revelan un marcado pleomorfismo, con formas irregulares, alargadas y esféricas, estimán­dose que son semejantes a las descritas por Hoyle (1968).

La sensibilidad al tratamiento con pH 3,0, acción de la temperatura de 56°C y solventes lipídicos, éter y cloroformo, se ajusta a lo informado anteriormen­te por Legrottaglie (I980). Ambas cepas, después de ser sometidas a estos tratamientos, conservaron su capacidad hemoaglutinante, lo que concuerda con lo informado por Cunningham (1971), quien ha seña­lado que la propiedad hemoaglutinante de estos vi­rus sólo se altera cuando ocurre una degradación completa de la partícula viral.

El ECP producido por ambas cepas en todos los cultivos celulares inoculados, se caracterizó por la presencia de gran cantidad de células desprendidas sobre la monocapa celular y posterior destrucción de ella, este efecto difiere al descrito por Pette y Teufel (1966) y Yamagishi y col. (1981), quienes observan un ECP caracterizado por la presencia de células redondeadas, granulares y lisis celular.

El cultivo celular de riñón fetal ovino resultó ser el más sensible a la infección por las cepas vírales en estudio, el ECP se produjo en el primer pasaje, a las 24 horas después de la inoculación, provocando la lisies total de la monocapa a las 72 horas. No existen antecedentes sobre la citopatogenicidad del virus influenza equina en células de riñón fetal ovi­no.

En los cultivos celulares de fibroblastos de em­brión de pollo, el ECP apareció en el primer pasaje, entre 24 y 48 horas después de la inoculación, con destrucción de la monocapa a las 72 horas. Anterior­mente, Brion y col. (1966) lograron adaptar el virus de la influenza equina a estos cultivos mediante pasajes alternados en huevos embrionados y culti­vos celulares, observando un débil ECP caracteriza­do por destrucción de la monocapa celular. En Chi­le, Casanova y col., (I977) describen la producción de ECP en fibroblastos de embrión de pollo inocu­lados con la cepa A/equi/1/Santiago 77, el que apa­reció al octavo día en el primer pasaje; posterior­mente, Billik en 1979 logró adaptar la misma cepa viral en estos cultivos celulares, luego del cuarto pasaje, con producción progresiva de ECP caracte­rizado por la presencia de pequeñas áreas de des­trucción celular y gran cantidad de células globosas.

En las líneas celulares de riñón fetal de bovino y equino, el ECP no se produjo en el primer pasaje, lo que concuerda con lo afirmado por Coggins y Ke­men (I975), quienes señalan que es necesario reali­zar varios pasajes antes de que se observe ECP.

En células de riñón fetal bovino inoculadas con virus influenza equina, Pette y Teufel (1966) detec­taron la aparición de ECP en el cuarto pasaje, el que se caracterizó por la presencia de células esféricas y granulares, con lisis de la monocapa celular; Fontai­ne y Petermann (1969) después de varios pasajes lograron obtener sólo multiplicación viral sin la producción de ECP; Yamagishi y col., (1981) detec­taron ECP caracterizado por células redondeadas y eventual desintegración de la monocapa celular. En nuestra experiencia ambas cepas produjeron ECP en cultivos celulares MDBK en el segundo pasaje y a las 48 horas de la inoculación, observándose células desprendidas sin destrucción de la monocapa. La actividad viral hemoaglutinante y la especificidad se demostró fehacientemente por hemoadsorción y neutralización.

En células de riñón fetal equino se detectó ECP en el tercer pasaje con células desprendidas sobre la monocapa celular y leve destrucción del cultivo; anteriormente, Gaggero (1984) encontró ECP en el primer pasaje con células desprendidas y Tisis del cultivo.

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