DETERMINACIÓN DE TÍTULOS DE ANTICUERPOS DE DOS VACUNAS COMERCIALES CONTRA INFLUENZA EQUINA, MEDIANTE LA TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN. Alejandra Jiménez N. 2010

1. INDICE

1- Índice…………………………………………………………………………...1-2

2- Introducción…………………………………………………………………....3-4

3- Revisión bibliográfica………………………………………………………...5-15

4- Objetivos

4.1 Objetivo general………………………………………………...……16

4.2 Objetivo específicos ……………………………....………….…....16

5- Materiales y Métodos ..……………………………………….………….......17-18

6- Resultados y Discusión………….……………………………...…………..19-28

6.1. Tabla Nº 1- Títulos de anticuerpos para Influenza equina según dos
vacunas comerciales………………………………………….…………19-20

6.2. Gráfico 1: Títulos de anticuerpos obtenidos con Vacuna 1(Americana)
en cada uno de los diez ejemplares………………………….……….21

6.3. Gráfico 2: Títulos de anticuerpos obtenidos con la Vacuna 2 (Chilena)
en cada uno de los diez ejemplares .. ………………………………....22

6.4. Gráfico 3 y 4: Frecuencia de presentación de cada título de anticuerpo
de Vacuna 1……………………………………………………………....23

6.5. Gráfico 5 y 6: Frecuencia de presentación de cada título de anticuerpo
de Vacuna 2………………………………………………………………24

7- Conclusión…………………………………………………………………...29


8- Bibliografía…………………………………………….……………………30-34

9- Anexo…………………………………………………………….................35-36

9.1. Informe de Análisis……………………………………...……….35

9.2. Esquema del Virus de la Influenza Equina………….…….…..36

9.3. Placa micrométrica utilizada para la determinación de títulos de
anticuerpos…………………………………………………….………36


2. INTRODUCCIÓN

 Las enfermedades del Aparato Respiratorio son las segundas en
importancia, después de las del Aparato Músculo Esquelético en la limitación
del rendimiento deportivo del caballo. Dentro de éstas, las infecciosas son de
gran importancia económica, especialmente, las de origen viral; debido a su
alta morbilidad afectando a un gran número de animales, llegando a producir
brotes de gran magnitud. Por esto su prevención es de gran importancia y debe
ser abordada bajo estrictos conocimientos sobre enfermedades infecciosas que
se refieren básicamente a su diagnóstico e inmunización.

En el caso de los caballos, una de las enfermedades virales respiratorias
más importantes por su alta morbilidad es la Influenza Equina, que afecta a un
gran número de ejemplares y se dispersa rápidamente abarcando un radio
amplio de contagio. Debido a esto, se puede ocasionar importantes pérdidas
económicas en un hipódromo, ya sea por el costo del tratamiento o cese de las
prácticas deportivas.

El primer brote en Chile fue descrito el año 1963. Luego han seguido a
las grandes pandemias ocurridas en el continente Americano y algunos de
estos brotes, se produjeron luego de la entrada de caballos aparentemente
sanos desde Argentina. Éstos fueron diagnosticados mediante la técnica de
laboratorio llamada Inhibición de la Hemoaglutinación, obteniéndose entonces
altos títulos de anticuerpo coincidentes con la enfermedad.

Debido a que ésta es una enfermedad altamente contagiosa, su
prevención y control son fundamentales a través de la Inmunización. En el
caso de la Influenza Equina se utilizan vacunas bivalentes, que contienen los
dos subtipos del virus, para así crear inmunidad y disminuir la posibilidad de
contagio.


 Actualmente en Chile se ocupan vacunas nacionales e importadas, las
cuales tienen diferencias de precio notables. El presente estudio pretende
determinar los títulos de anticuerpos de dos vacunas comerciales contra el virus
de la Influenza, mediante la Técnica de Inhibición de la Hemoaglutinación

3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

La Influenza Equina es una enfermedad infectocontagiosa de origen viral
que afecta las vías respiratorias superiores del equino y se caracteriza por ser
de aparición repentina y epizoótica. La Influenza Equina fue descubierta en la
antigüedad, ya que fue descrita hace varios siglos por veterinarios árabes en
Yemen. La enfermedad Clínica fue registrada en 1754. El primer virus de la
Influenza Equina fue aislado en Checoslovaquia en 1956 durante una epizootia
ocurrida en Europa del Este y se denominó A1 Praga. El segundo subtipo viral
fue aislado en Miami en 1963 y se conoce como A2 Miami (Berríos y Celedon,
1992.).

Es una enfermedad altamente contagiosa, de baja mortalidad (menor al
1%), pero de alta morbilidad aproximadamente 100% (Rolle y Mayer, 1984), de
denuncia obligatoria y aparición brusca, presentándose en grandes brotes
epizoóticos. Tiene una amplia distribución geográfica, presentándose brotes en
Norte y Sur América, Europa, India, África, China y Japón donde se efectuó el
último seguimiento de la OIE el 01/04/2009, sin encontrar nuevos focos. Por
esto, la Oficina Internacional de Epizootias, OIE, recomienda que la importación
de equinos sea de áreas libres de Influenza, exigiendo que los caballos vengan
vacunados y con un refuerzo booster dado dos a ocho semanas previo al viaje
(OIE, 2005).

La Influenza Equina es una enfermedad de denuncia obligatoria y de
notificación internacional a la OIE. En Chile se ha presentado en forma
esporádica y en algunas ocasiones ha mostrado un carácter de epizoótico
(Méndez y col. 2006).

En Chile, el primer brote de Influenza Equina fue descrito en 1963. Los
brotes han seguido a las grandes pandemias ocurridas en el continente


Americano y algunos de estos brotes, se produjeron luego de la entrada de
caballos aparentemente sanos desde Argentina (Berrios y Celedón, 1992).

La Influenza Equina es producida por un virus de la Familia
Orthomyxoviridae, estos virus están constituidos por un genoma formado por
ocho segmentos de ARN de simple cadena y polaridad negativa; cada uno de
estos segmentos, se encuentra unido a nucleoproteínas, dentro de la
nucleocápside también se localizan las tres polimerasas virales (PB1, PB2, PA)
y dos proteínas no estructurales (NS1 y NS2) que actúan como reguladoras de
la trascripción, a su vez, la nucleocápside se encuentra recubierta por una
envoltura lipídica que está tapizada por las proteínas de matriz y membrana. La
superficie externa de estos virus, está cubierta por dos glicoproteínas con forma
de Espículas: neuranimidasa y hemoaglutinina (Sguazza, 2006), siendo esta
última la más abundante y es el principal antígeno contra el cual se producen
anticuerpos neutralizantes del hospedador (Hidalgo y col, 1999). La HA, permite
la adsorción viral a receptores celulares que contienen ácido siálico, siendo
incorporado a la célula en una vesícula endoplasmática por endocitosis. La
acidificación de la vesícula cambia la conformación de la HA e induce la fusión
del manto viral con la membrana endocítica, liberando al citoplasma el complejo
ARN - nucleoproteína (NP) - polimerasas (PA-PB1-PB2), el cual es
transportado al núcleo. Allí se transcriben los 8 ARN mensajeros que originarán
proteínas estructurales y no estructurales (NS1, NS2). Los nuevos viriones se
ensamblan en la superficie celular y se liberan por yemación. En esta etapa, la
neuraminidasa juega el papel fundamental de separar el ácido siálico de las
glicoproteínas viral y celular, permitiendo la liberación del virus y evitando su
aglutinación en la mucosa. En este proceso algunas células mueren por efecto
del virus o de la respuesta inmune celular; otras permiten varios ciclos
replicativos virales.

Los diferentes subtipos de virus influenza se originan por los cambios en
los antígenos de superficie H y/o N. Estas variaciones antigénicas ocurren por
recombinaciones genéticas o por mutaciones puntuales, fenómenos frecuentes
en estos virus debido a la fragmentación del ARN y a la baja fidelidad de la
replicación viral (Luchsinger, 2009).

La partícula viral posee tres componentes antigénicos, uno de ellos es la
nucleoproteína, cuyas diferencias antigénicas permiten clasificarlos en tres
grandes tipos (A, B y C). Los virus del tipo A son los únicos que a su vez se
pueden subdividir en diferentes subtipos de acuerdo a la composición de las
otras dos proteínas antigénicas: H y N. Los virus del tipo B y C son patógenos
predominantemente humanos aunque también han sido aislados a partir de
mamíferos marinos y cerdos respectivamente y solamente producen
infecciones respiratorias muy leves (Sguazza, 2006).

Presenta 2 subtipos: A equi 1 Paraga y A equi 2 Miami, que no presentan
reacción antigénica cruzada, actualmente se denominan H7N7 y H3N8, ambos
se han presentado en Chile. El subtipo H7N7 no se ha detectado en el mundo
desde 1980. Sin embargo, en 1996 se reportó la detección de 53,9% de
positivos contra el subtipo A/equino-1 en equinos no vacunados provenientes
de tres regiones de Croacia, planteándose además que su circulación en la
población equina es subclínica (Berrios, 2005). H3N8, por otra parte, se ha
demostrado que circulan en grandes partes del mundo con exclusión de Nueva
Zelandia e Islandia.

Estudios recientes del subtipo H3N8 del virus de la gripe equina han
demostrado que estas cepas se han ido distanciando en dos linajes evolutivos,
el significado funcional de esta dicotomía filogenética ha sido examinado en dos
estudios de antigenicidad del virus, que emplean a un suero policlonal y el otro
que emplean anticuerpos monoclonales para estudiar la hemaglutinina (HA) de
proteínas de los virus (Oxburgh y Klingeborn, 1999).

El virus tiene capacidad de mutar por medio de dos tipos de cambios
antigénicos. Uno produce modificaciones menores y graduales dentro del
subtipo (“Drift” o deriva antigénica), con participación de la respuesta inmune. El
otro genera cambios mayores bruscos (“Shift” o recombinación de alta
frecuencia) a causa de recombinación genética durante una infección mixta
(Pinotti y col, 2002).

A pesar de su gran circulación entre los equinos, ambos subtipos
mostraron relativa estabilidad antigénica en comparación con el alto grado de
variabilidad serológica mostrado por los virus humanos en el mismo período de
tiempo (Donatelli y col., 1991).

En Chile, en el brote de Influenza Equina ocurrido en 1985 y causado por
el subtipo H3N8, se comprobó la existencia de anticuerpos contra el subtipo
H7N7 en animales no vacunados contra la IE y que habían presentado una
enfermedad respiratoria muy suave en los últimos meses de ese año, la que
había pasado casi desapercibida (Berríos, 2005)

Clásicamente, la IE se propaga a través de aerosoles, ya que un caballo
infectado con el virus, al toser o estornudar puede expulsar el virus a varios
metros de distancia. Hay pruebas que sugieren que cuando hay una
concentración de caballos enfermos en un solo lugar, podría generar una nube
de virus que podría viajar kilómetros de distancia, favorecida por el viento. Virus
de la gripe equina también tiene un desagradable truco: En el período previo al
desarrollo de la enfermedad, conocido como “el periodo de incubación”, los
caballos se observan aparentemente sanos, pero pueden eliminar el virus, y
propagan enfermedad en silencio (Forrest, 2007).

La enfermedad clínica se inicia con fiebre de 38.5 a 41ºC, el signo
dominante es tos seca que puede persistir durante una a tres semanas. Se
aprecian abundantes lágrimas, decaimiento. La inamovilidad, cansancio, rigidez
para echarse o levantarse con síntomas muy comunes. La mucosa respiratoria
se presenta congestiva, pudiendo detectarse Faringitis, Laringitis y Traqueítis.

Ocasionalmente se detecta Bronconeumonía y Miocarditis. Los ganglios
linfáticos del cuello pueden estar aumentados de volumen.
El animal con Influenza también presenta dolores musculares y está decaído e
inapetente. La recuperación ocurre entre 7 y 10 días. La tos puede persistir
durante 2 y 3 semanas. Las complicaciones de la IE comprenden: neumonía
bacteriana secundaria, pleuresía, bronquitis crónica, y enfermedad pulmonar
crónica obstructiva (Poleo, 2008).

La recuperación completa de los animales ocurre en 2 a 3 semanas
(Hidalgo y Col, 1999), siempre y cuando no existan infecciones secundarias, de
lo contrario la recuperación tarda más en concretarse, provocando grandes
pérdidas.

Los signos clínicos asociados al subtipo H7N7 son menos severos que
los producidos por el subtipo H3N8 (Hidalgo y col, 1999), además hace largo
tiempo no se ha encontrado un brote producido por este subtipo.

 El diagnóstico serológico tradicional se realiza por la prueba de
inhibición de hemoaglutinación, en la cual los anticuerpos, presentes en el
suero del animal infectado, inhibirán la capacidad del virus de aglutinar glóbulos
rojos de pollo (Hidalgo y col, 1999).

Para entender mejor la Hemoaglutinación se basa en algunos antígenos
virales que tienen la capacidad para aglutinar eritrocitos de diversas especies,
sin embargo, la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente
evitan la aglutinación de los eritrocitos por tales antígenos; cuando esto ocurre
se evidencia la presencia de anticuerpos. Para cuantificarlos se hacen diversas
diluciones del suero con el fin de hacer una titulación y determinar el nivel de
anticuerpos del paciente (Crespo, 2003).

El Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación es utilizada por muchos
laboratorios de diagnóstico y vigilancia para la detección de anticuerpos contra
el virus de la gripe (Boliar y col, 2006). Esta prueba fue descrita por Hirts en
1942 y luego modificada por Salk en 1944. Se realiza en placas de
microtitulación, mezclándose en una cantidad estandarizada de antígeno con
antisuero diluidos en forma seriada; posteriormente se añaden eritrocitos para
determinar la unión específica del anticuerpo a la molécula. Es una técnica
extremadamente confiable, pero es requisito indispensable que los antisueros
de referencia se separen basándose en las cepas vacunales, que son las
cepas que circulan anualmente (Oropesa, 2003). Es bien sabido que la
Prueba de Inhibición de la Hemaglutinación es afectada por los inhibidores
inespecíficos presentes en el suero equino, Para esto hay varios tratamientos
para eliminar estos inhibidores, como el caolín (Boliar y col, 2006)

Ante la existencia de una enfermedad infecciosa en una población, el
objetivo inicial es su control y posteriormente, su erradicación. Para lograr tal fin
es indispensable establecer la causa, el origen, la transmisión del agente
infeccioso, teniendo en cuenta las especies involucradas, vías de eliminación,
resistencia en el ambiente, vectores, puertas de entrada, etc., intentando
interrumpir esta cadena epidemiológica en su eslabón más vulnerable, o que
más nos convenga desde el punto de vista de efectividad, practicidad o
economía. (Caro y Gutiérrez, 1999).

Por esto, las prácticas sanitarias de separación, eliminación, control de
ingreso, además del uso de tratamientos y medidas profilácticas específicas,
como la vacunación entre otras, han contribuido en reducir e incluso hacer
desaparecer algunas enfermedades infecciosas, sea a niveles locales, de
áreas, países, continentes e incluso mundial (Pinochet y Abalos, 1989.)

Deben establecerse regímenes de desinfección regular y aislamiento de
los animales infectados y períodos de cuarentena adecuados antes y después
de la movilización de equinos. Sin embargo, como consecuencia de la variación
antigénica de las cepas de virus de influenza, que ocurren a través de los años,
deben incorporarse a la vacuna cepas de aislamiento reciente, para el control
efectivo de esta enfermedad (Hidalgo y col 1999). Un estudio en el cual un
grupo de caballos fueron vacunados dos veces al año, fueron expuestos al
virus, demostrando que en ellos la tasa de morbilidad fue un 19%, lo que
concluye que es beneficioso para los recintos deportivos (Sugita y col, 2008)

El uso de vacunas contra la Influenza Equina se ha ido incentivando por
las graves pérdidas económicas que esta enfermedad ha producido en la
Hípica Mundial. En 1977 en nuestro país, la vacuna no se usaba. Cabe señalar
que al tenerse conocimiento de la presencia de Influenza Equina en Argentina,
algunos animales fueron vacunados presentando síntomas clínicos más
suaves. En 1985 y 1992 la enfermedad fue menos grave que en 1977,
probablemente debido al uso de vacunas; sin embargo, hay que señalar que su
aplicación no ha alcanzado la intensidad que las pérdidas económicas
ameritan. Al respecto es indicativo el hecho que en 1992, la enfermedad no se
presentó en el Hipódromo Chile de Santiago, plantel que vacunaba
regularmente (Berrios, 1995).

Cabe mencionar que dicha vacuna no previene completamente la
enfermedad, ya que en el caso de exposición al virus un número de éstos
enferman, pero su sintomatología es leve y en algunos casos pasa de forma
desapercibida, lo cual también es un problema ya que los enfermos subclínicos
la diseminan de forma oculta, este es un gran debate en los países libres de
Influenza Equina. (Newton y col, 2006)

La vacunación por sí sola no tiene como resultado la erradicación de la
enfermedad, por esto las medidas estrictas de bioseguridad y controles de
circulación son sumamente necesarias (Crook y Ada, 2007), sin embargo es
importante destacar que el virus muta año a año, por eso es importante
controlar las gripes extrajeras, además de tener una explicación a las variantes
y esto considerarlo para que se incluyan en nuevas vacunas (Imagawa y col,
1999).

En Chile, están registradas y autorizadas tres vacunas bivalentes contra
Influenza Equina, las cuales tienen altos niveles inmunitarios a fin de prevenir la
infección viral (Méndez y col, 2006), y se recomienda que estas vacunas
contengan un virus de la familia A/eq/South Africa/4/2003 (H3N8) (linaje
americano) y un virus de la familia A/eq/Newmarket/2/93 (H3N8) (linaje
europeo) (OIE,. 2005)

Esta vacuna es inactivada, es decir está formada por el o los
microorganismos completos, pero inactivados por algún método físico o
químico, éstas presentan gran estabilidad y seguridad, pero dan una respuesta
inmunitaria menos que las vacunas atenuadas (Sánchez, 2004)

Estas vacunas deben entregar al animal vacunado una resistencia
específica frente a la enfermedad, la resistencia producida por la vacuna debe
ser lo más larga en el tiempo, No debe producir efectos colaterales
indeseables, debe cumplir una serie de exigencias inherentes al producto
mismo. (Pinochet y Abalos, 1989.)

La reacción post vaccinal hace que la inmunidad del animal cree
anticuerpos protectivos contra el virus de la Influenza Equina, los cuales van
disminuyendo desde los 3 meses post vacunación en adelante. En Argentina
durante años se exigió vacunación anual, pero las últimas investigaciones
indican que la protección que ofrecen muchas vacunas disminuye al cabo de
unos meses. Esto significa que, cuando está por terminar el año de vacunación,
los caballos pueden volver a infectarse, aunque no muestren síntomas de la
enfermedad. Estos casos son particularmente peligrosos porque pueden
diseminar el virus e iniciar una epidemia (Quinlivan y col, 2005)

Se han propuesto diversos protocolos de vacunación:

 Howard en 1971, proponía un calendario de vacunación contra la
Influenza Equina, que se iniciaba con dos dosis, como vacunación base,
aplicadas con un intervalo de 3 meses; en el caso de animales mayores
sin antecedentes de vacunación, este intervalo debería ser solamente de
2 semanas. En equinos menores de 2 años la revacunación debe
hacerse dos veces al año, bastando una sola dosis en animales
mayores.
. Bürki en 1977, preconizaba vacunar a potrillos mayores de 3 meses, los
que presentan un sistema maduro, a la vez que carecen de anticuerpos
maternos (Oirschot y col., 1991). Esta primera vacunación consistía en la
aplicación de dos dosis con un intervalo de 9 semanas. La revacunación
en equinos jóvenes, hasta 2 años de edad, sería en base semianual (dos
veces al año), en julio y enero del Hemisferio Norte, debido
principalmente a que la mayoría de los brotes de influenza equina en
Europa Central, habían ocurrido entre febrero y junio, y entre agosto y
octubre.
. Según Liu (1986) es recomendable aplicar una Dosis de Refuerzo
("Booster") repetida con 2 a 3 meses de intervalo, seguido por
vacunaciones anuales o semianuales. La primera vacunación se hacía a
los 3 meses de edad, considerando la presencia de anticuerpos
maternales; sin embargo, Liu y col. (1985) demuestran que los
anticuerpos maternos persisten en el animal joven durante 2 a 4
semanas, considerándose como títulos de anticuerpos IHA de valor
protectivo mínimo entre 16 y 32. Según estos autores pareciera que un
50% de los potrillos hijos de madres vacunadas un mes antes de la
parición, estarían protegidos durante los dos primeros meses de vida.
. Intervet (2008) primera vacunación a los 4 meses de edad o mayores,
segunda vacunación 4 semanas después de la primera vacunación,
tercera vacunación 6 meses después de la primera vacunación y luego
revacunación anual (detalle de producto Intervet
http://www.intervet.com.co/products/equilis__equenza_t/020_detalle_de_
producto.asp).

Y muchos más, pero cada recinto utiliza el protocolo que rige el país, de
acuerdo a las medidas de control y prevención que la autoridad sanitaria
describa.

En el caso de la Influenza Equina la respuesta inmunitaria post vacunal
es rápida, obteniéndose cantidades de anticuerpos protectivos antes de la
semana después de la vacunación, los que alcanzan un máximo
aproximadamente entre uno y dos meses después, para descender a valores
mínimos entre los dos y tres meses después de la vacunación (Berríos, 1995).

Tras la primera vacunación, se puede encontrar alguna reacción local en
algunos animales, que puede ser provocada en el caso que la aguja pase a
llevar algún vaso, por esto la vacunación es segura para su uso bajo
condiciones de campo normales (Heldens y col, 2002).

En nuestro país las actividades hípicas deportivas se desarrollan durante
todo el año, lo que implica que el riesgo de infección es constante, por el
frecuente traslado de equinos tanto dentro como fuera del país. Esto exige que
los equinos estén protegidos en forma permanente contra la IE, (Keller y col,
1990)

Para la entrada de equinos en Chile se exige: Que el país o zona de
procedencia esté libre oficialmente de Influenza Equina; antes del embarque los
animales deben ser sometidos a un periodo de aislamiento durante 30 días
como mínimo, en el lugar de origen; que sean negativos a las pruebas
diagnósticas y los animales deben ser vacunados con vacuna bivalente
inactivada entre 6 meses a 30 días previos al embarque ; deben venir
amparados con el certificado sanitario oficial otorgado al momento del
embarque por la autoridad sanitaria competente del país de procedencia que
acredita el cumplimiento de las exigencias sanitarias y se ajuste al modelo
aprobado. A la llegada de los animales serán sometidos a una cuarentena en la
Estación Cuarentenaria Pecuaria del SAG.

Es importante mencionar en cuanto a los títulos que podrían conside-
rarse protectivos frente a una infección de campo con virus de la IE, no existe
uniformidad de criterios. Según Jaeger y Barth (1971), títulos de 20 o mayores
serían protectivos. No obstante, otros autores señalan que títulos IHA
protectivos estarían dados por valores de 40 (Dannacher y col., 1977). Además
que la inmunidad óptima no se presenta hasta 7 ó 14 días después de la
segunda vacunación.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Determinación de títulos de anticuerpos de dos vacunas comerciales contra
influenza equina, mediante la técnica de inhibición de la hemaglutinación.

4.2 Objetivos específicos

- Determinar la respuesta inmunológica obtenida de caballos vacunados con
dos tipos de vacunas comerciales contra influenza equina, mediante la
obtención de títulos de anticuerpos.

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Para este estudio se utilizaron 20 caballos Fina Sangre de Carreras,
entre 3 y 5 años de edad, clínicamente sanos, alojados en pesebreras del Club
Hípico de Santiago, y que fueron vacunados dentro del plan normal de
vacunación contra Influenza Equina de esta entidad hípica, es decir, todos
vacunados hace tres meses con 2 vacunas de distinta procedencia; una
nacional y otra americana.

 Todos los ejemplares fueron sometidos a un examen clínico donde se
controló la temperatura corporal, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria,
tiempo llenado capilar y reflejo tusígeno negativo.

Estos ejemplares fueron escogidos al azar y separados en dos grupos
según la vacuna que habían recibido tres meses atrás de acuerdo al plan de
vacunación de esta entidad hípica.

. Grupo Nº 1 constituido por 10 ejemplares que habían recibido tres meses
atrás una vacuna comercial importada Americana: Vacuna subunitaria
bivalente para la inmunización activa contra la Influenza y el Tétanos en
equinos. Contenía las subunidades proteicas del virus de la influenza
equina A equi subtipo 1 (Praga 56); A equi subtipo 2 (Newmarket 1/93) y
A equi subtipo 2 (Newmarket 2/93) más toxoide tetánico inactivado;
. Grupo Nº 2 constituido por 10 ejemplares que habían recibido tres meses
atrás una vacuna comercial. Vacuna viral Anti-Influenza Equina,
elaborada con serotipos A equi 1 y A equi 2, cultivados en embrión de
pollo, inactivados químicamente y absorbidos en hidróxido de aluminio.

Las vacunas utilizadas se encontraban autorizadas y registradas por el
SAG, ambas caracterizadas por sus laboratorios por su inocuidad, por una
rápida inducción y por una alta respuesta inmunitaria.

Las muestras se recolectaron en tubos con silicona, por punción desde la
vena yugular izquierda de cada ejemplar. Estas muestras se tomaron en la
mañana, entre las 8:00 y 9:00 horas, previo a que el ejemplar realice su
ejercicio matinal. Una vez recolectadas, se enviaron al laboratorio de virología
de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
en un cooler, para ser procesadas y sometidas a la técnica de inhibición de la
hemoaglutinación para la determinación de los títulos de anticuerpos, donde
cada suero se evaluó individualmente mediante la técnica de micrométodo
recomendada para los virus de influenza humana, para lo cual los sueros
fueron diluidos previamente al 1/10 en PBS, luego se realizaron diluciones
seriadas al doble en PBS en volúmenes de 0,025 ml, a las que se adicionó
0,025 ml de una suspensión de antígeno conteniendo 4 UHA de virus. La
mezcla suero-virus se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente,
posteriormente se adicionó 0,05 ml de glóbulos rojos al 0,5%. Paralelamente a
la prueba se controlaron las UHA del antígeno, hemaglutinación inespecífica del
suero y sedimentación de los glóbulos rojos. Las pruebas se incubaron durante
30 minutos a temperatura ambiente. La lectura del título IHA se expresa como
el valor recíproco de la dilución más alta del suero capaz de inhibir
completamente la hemaglutinación de 4 UHA del virus empleado en la prueba.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos a través de las muestras de sangre mediante la
Técnica de Inhibición de la Hemoaglutinación, con los dos subtipos de virus, en
este caso se utilizó el virus A/equi/Santiago 77 H7N7 y el virus
A/equi/Santiago85 H3N8, con un valor recíproco de la dilución que inhibe cuatro
unidades hemoaglutinantes de la cepa viral. Los resultados obtenidos en el
Laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de
la Universidad de Chile.

Por tratarse de un estudio descriptivo se analizaron los resultados en
base a parámetros como la moda y frecuencia de presentación de los títulos de
anticuerpos.

 Están expresados en la siguiente tabla:

6.1. Tabla Nº 1- Títulos de anticuerpos, con un valor recíproco
de la dilución que inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes de
la cepa viral para Influenza equina según dos vacunas
comerciales.

VACUNA1



GRUPO A

H7N7

H3N8

1

1:32

1: 8

2

1:32

1: 8

3

1:32

1:32

4

1:64

1:64

5

1: 8

1:8

6

1: 8

1: 8

7

1:8

1: 8

8

1:32

1: 8

9

1:16

1: 8

10

1:8

1: 8




VACUNA 2

GRUPO B

H7N7

H3N8

11

1:16

1: 8

12

1:8

1: 8

13

11:6

1:16

14

1:16

1: 8

15

1:8

1: 8

16

1:8

1:64

17

1:8

1:16

18

1:8

1:16

19

1:8

1:32

20

1:8

1: 8

 


El presente corresponde a un estudio de tipo descriptivo, los resultados
están expresados con el valor de mayor frecuencia en la distribución de datos,
expresados gráficamente:

6.2. Gráfico 1: Títulos de anticuerpos obtenidos con vacuna 1,
Americana, con un valor recíproco de la dilución que inhibe
cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral, en cada uno
de los diez ejemplares (Grupo A), donde el eje “y” representa a
los títulos de anticuerpos y el eje “x” es cada uno de los
equinos (1-10):

 

6.3. Gráfico 2: Títulos de anticuerpos obtenidos con la vacuna
2, Chilena, con un valor recíproco de la dilución que inhibe
cuatro unidades hemoaglutinantes de la cepa viral, en cada uno
de los diez ejemplares (Grupo B) donde el eje “y” representa a
los títulos de anticuerpos y el eje “x” es cada uno de los
equinos (1-10):

6.4. Gráfico 3 y 4: Frecuencia de presentación de cada título de
anticuerpo con Vacuna 1 (Grupo A), representado gráficamente

 Grafico 3 Grafico 4




6.5. Gráfico 5 y 6: Frecuencia de presentación de cada título de
anticuerpo con Vacuna 2 (Grupo B), representado gráficamente



Grafico 5 Grafico

En los gráfico 3, 4 ,5 y 6 tienen como medida un valor recíproco de la dilución que
inhibe cuatro unidades hemoaglutinantes
Evaluando cualitativamente los resultados, se aprecia que la moda para
ambas vacunas está dada por títulos bajos (1:8 y 1:16).

Se puede observar en el Gráfico Nº 3 y 4, que el 40% de los ejemplares
muestreados presentaban títulos de anticuerpos contra H7N7 de 1:32 y de 1:8,
mientras que para H3N8, el 80% de los ejemplares presentaban títulos de 1:8.
Esto indica que este grupo de animales tiene una correcta protección frente al
virus H7N7 con la vacuna 1 a los tres meses post vacuna, según Dannache y
col (1977) Sin embargo, el último brote de influenza que se presentó en el país
en el año 2006 (Mendez y col., 2006), la cepa actuante fue la H3N8. Los títulos
que dio esta vacuna para esta cepa son muy bajos y no protectivos.

Como se aprecia en los Gráficos Nº 5 y 6, para la vacuna nacional, un
alto porcentaje de los caballos presentaban bajos títulos de anticuerpos para
ambas cepas del virus. Los títulos para el serotipo H7N7 para esta vacuna
fueron sólo de 1:8 y 1:16, por lo tanto, según Dannacher y col (1977), no
protegen frente a un brote de Influenza equina. Los títulos obtenidos para el
serotipo H3N8 fueron igualmente bajos. Se puede concluir que después de tres
meses de ser vacunados estos caballos presentan títulos de anticuerpo bajos,
lo que lleva a una inmunidad baja para dicha enfermedad, por lo tanto, están
en alto riesgo de contraer la enfermedad en caso que entre el virus a nuestro
país.

La baja cantidad de títulos de anticuerpos demostrados en este estudio
nos lleva a la discusión a un cambio en el plan de vacunación utilizado o a
conseguir otra vacuna que entregue mejores títulos protectivos.

 

Esto es de cuidado ya que aun existen brotes esporádicos de la
enfermedad en países donde se practica la vacunación, esto se debe a que la
vacuna no tuvo buena cobertura o a que nuevas cepas surgen y se introducen
(Crook y Ada, 2007).

El virus influenza presenta variaciones antigénicas constantemente y de
diversa importancia, conocidas como variaciones menores (drif) y mayores
(shift). Las variaciones menores afectan a la hemaglutinina y conducen a la
aparición de nuevas cepas; se producen por mutaciones espontáneas de genes
que codifican la hemaglutinina y dan lugar a la aparición de nuevos brotes
epidémicos. Las variaciones mayores son conocidas como cambios totales del
antígeno H, del N o de los dos, lo que da lugar a la aparición de pandemias
(Juanes y Arraosla, 2002).

Se sabe, por lo mencionado anteriormente, que la vacuna no tiene por si
sola la capacidad de erradicar a la enfermedad, pero sí reduce la
susceptibilidad de los caballos en riesgo, además que reduce la severidad de
los signos clínicos; esto último también se puede tomar como el lado negativo
de esta vacuna, ya que puede enmascarar la enfermedad, produciendo el
contagio de otros caballos; éste es un gran tema de discusión en países como
Australia, en el cual solo se ha producido un brote y Nueva Zelanda que es un
país libre de la enfermedad, según Imagawa y col (1999).

Para esto se utilizan los estudios epidemiológicos basados en la
presencia de títulos de anticuerpos, además éste aporta a identificar si el plan
de vacunación utilizado es el adecuado para la población, de no ser así (como
el presente), optar por otro plan, para obtener los mayores beneficios de esta
vacuna. Este es un punto muy importante a considerar, ya que en Chile se
pueden identificar tres tipos de huéspedes distintos: Los no inmunes, que son
aquellos que nunca se han vacunado, ni enfermado; los inmunizados
completamente, que son animales con correcto plan de vacunación o que han
enfermado durante el último año, ya que la infección natural puede proveer de
protección clínica por lo menos un año (Hannant y col. 1988) y por ultimo los
parcialmente inmunes, que son aquellos con un plan de vacunación pobre;
estos últimos son los mas importante epizoóticamente, ya que pueden
enmascarar la enfermedad.

En cuanto a la muestra y resultados obtenidos en este estudio, con la
técnica antes descrita, al obtener bajos títulos de anticuerpos refleja que la
población en cuestión es altamente susceptible a epizootias, con alta
morbilidad que se traduce en enormes pérdidas económicas, por esto se
debería aplicar otro plan de vacunación, así se incrementaría la cobertura
inmunológica poblacional; a pesar que aumentarían la mantención de cada
ejemplar drásticamente, ya que a la vez es una inversión en el caso de que se
produzca algún brote, más aun cuando en estos momentos se están realizando
competencia a nivel mundial, donde la entrada y salida de caballos es alta,
aumentando el riesgo de contagio tanto en Chile, como en otros países, a pesar
de que exista un gran control por las entidades sanitarias adoptada en cada
país, en este caso el SAG, como cuarentenas, restricciones de ingreso y
egreso del país; es prácticamente imposible asegurar que la infección no
llegara en algún momento a nuestro país.

Con las vacunas disponibles contra influenza equina, se alcanza niveles
requeridos de anticuerpos para una solida protección solo por breves períodos
de tiempo, ya que a los 3 meses post vacuna los títulos de anticuerpos son
bajos. Esta situación hace que la población sea altamente susceptible a la
posibilidad de epizootias de muy alta morbilidad. Por esto, los estudios son de
gran importancia, ya que basados en los títulos de anticuerpos de la población
de caballos FSC, se puede proponer un nuevo plan de vacunación, que nos
proporcione inmunidad constantemente contra esta enfermedad que produce
tantas pérdidas económicas cuando se instala en un recinto deportivo ecuestre.

La mejor protección se producirá cuando exista una vacuna que tenga
estrecha relación entre el virus de campo y la cepa utilizada para crear dicha
vacuna, ya que se ha comprobado que las vacunas utilizadas han sido muy
efectivas para la infección con H7N7, pero no en infecciones por H3N8, porque
como esta última muta levemente, las vacunas se han quedado atrasadas ya
que el virus que contienen son irrelevantes como consecuencia de la deriva
antigénica.

Sin embargo la evolución de la vacuna contra La Influenza Equina no ha
terminado, ni terminará, por los cambios menores que presenta el virus que trae
consigo la necesidad de revacunar. Sería muy interesante encontrar un
antígeno estable, para que así la vacuna dure varios años y al momento de
realizar este tipos de estudios encontrar títulos altos; puesto que hoy en día las
fronteras, océanos y continentes dejaron de constituir un obstáculo para la
entrada del virus.

El seguimiento de los brotes por parte de las entidades sanitarias del
país es primordial, para identificar el virus que está infectando a la población,
estudiar la variabilidad antigénica de este virus, si es que la tuvo (lo que es un
gran aporte a la investigación y creación de nuevas vacunas) y obviamente
impedir la diseminación masiva de este; mediante aislamiento, tratamiento y
disminución de contagio.

Por lo mismo este estudio puede ayudar a los organismos, a la industria
y a los propietarios, a tener una visión más clara en cuanto a las medidas de
seguridad y educación sanitaria que deben instaurar en los recintos deportivos.
Un buen programa de vacunación es parte esencial de la crianza y mantención
de equinos en estos recintos.

7. CONCLUSIÓN

Los títulos de anticuerpos contra Influenza Equina determinados en estos
caballos FSC después de tres meses de ser vacunados fueron bajos para
ambas vacunas comerciales.

7. BIBLIOGRAFÍA

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infectol. v.23 n.2 Santiago jun. 2006

9- Anexos

9.1 Informe de análisis de muestras de la facultad de ciencia Veterinarias y
Pecuarias de la Universidad de Chile


 RESULTADOS TESIS ALEJANDRA JIMENEZ

9.2 Esquema del Virus de la Influenza Equina

9.3 Placa micrométrica utilizada para la determinación de títulos
de anticuerpos utilizada en este estudio.