- Influenza equina en Chile (1963- 1992)
DOI: 10.5354/0716-260X.1992.4692
1 Virología. Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile, 2 Virología. Departamento de Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile
In this general article is presented the situation of equine influenza in Chile from 1963, when the first outbreak of this disease was described. Equine influenza has been reported several times from then; main outbreaks have occurred in 1977, 1985 and recently on march of 1992. The presentation of equine influenza in our country is discussed en relation to continental epizootics. Equine influenza virus has been isolated only in three oportunities: in 1977 it was isolated the strain A/equi/1/Santiago, Chile/1977 (H7 N7); in 1985 the strain A/equi/2/Santiago, Chile/1985 (H3 N8), and in 1992 the strain A/equi/2/Quillota, Chile/1992 (H3 N8). Beside, it is discussed different studies about the use of hemoagglutination inhibition test, viral seroneutralization and single radial hemolisis test; preliminary characterization of chilean strains of equine influenza virus and post vaccinal response to national and international vaccines against equine influenza.
Key words: Virus, influenza, horses.
Palabras claves: Virus, influenza,equino.
Antecedentes generales
La influenza equina es una enfermedad viral infecto contagiosa que afecta las vías respiratorias superiores de los equinos y se caracateriza por ser de aparición repentina y epizoótica. Es causada por los subtipos A/equi/1/Praga 56 (Heq 1 Neq 1) y A/equi/2/Miami 63 (Heq 2 Neq 2). Los que actualmente se denominan, de acuerdo a sus antígenos de superficie, hemoaglutininas y neuroaminidasas, H7 N7 y H3 N8, respectivamente (WHO, 1980). Estos virus tienen ARN como genoma y pertenecen a la Familia Orthomyxoviridae, género influenza tipo A. El primer brote de influenza equina descrito en el país, ocurrió en junio de 1963 (Fuschlocher y col., 1963) y el último en diciembre de 1985 (Berríos y col., 1986), causando sustanciales pérdidas económicas en la hípica nacional. Se debe agregar el brote que se presentó en marzo de 1992 (Celedón y col., 1992).
En el hombre, la primera pandemia de influenza ocurrió en 1580, originada probablemente en Asia, desde donde se diseminó a Africa y Europa, causando una alta mortalidad debido a la práctica de sangrar a los pacientes para reducir la fiebre. Sin embargo, fue Hipócrates, el padre de la medicina, quien describió por primera vez una epidemia con las características de la influenza, esto fue en el año 412 a.C. El término influenza fue introducido en Italia en el siglo xv para describir una epidemia que se atribuía a la 'influencia' de las estrellas. La gran pandemia de 1918-1919, denominada 'Spanish flu', causó un mínimo estimado de 20 millones de seres humanos muertos (Kaplan y Webster, 1977; Beveridge, 1977).
A fines de 1918, el médico veterinario J. S. Koen del Dpto. de Agricultura de los Estados Unidos de Norteamérica informó que una nueva enfermedad que se había presentado en cerdos del 'Middle West', era extraordinariamente parecida y coincidente con la presentación de influenza humana entre los granjeros, afirmando que la enfermedad era la misma. Posteriormente, en 1928, un equipo de médicos veterinarios del 'Bureau of Animal Industry', dirigidos por C.N. McBryde, logró transmitir la enfermedad en cerdos infectándolos con exudados mucosos provenientes de cerdos con influenza. Tres años después, en 1931, Richard E. Shope del 'Rockefeller Institute of Comparative Pathology' de Princeton New Jersey, transmitió la enfermedad entre cerdos a través de inoculación intranasal de exudado nasal filtrado. Este virus influenza, el primero en ser aislado, se denominó (Hsw1 N1 ). En 1933 se aisló el virus influenza humano en hurones y en ratones, y se denominó (H0 N1). Estos virus, provenientes de humanos y porcinos, eran similares pero no idénticos. Al respecto cabe señalar que personas que vivieron durante la pandemia de 1918 tenían anticuerpos relacionados con ambos virus. De acuerdo a estos antecedentes se formuló la hipótesis que los cerdos habrían contraído la infección del hombre; no obstante algunos investigadores sostienen la posibilidad contraria, es decir, que la infección humana se originó desde los cerdos. Al menos la transmisión de la infección del hombre al cerdo es posible como se ha demostrado en los últimos años (Kaplan y Webster, 1977; Kaplan, 1982).
Los virus influenza tienen la particularidad de poseer un ARN con 8 segmentos, lo que significa que fácilmente pueden ocurrir recombinaciones genéticas en infecciones mixtas con diferentes cepas de virus influenza A, humana o de animales. La recombinación de los segmentos del ARN de los virus influenza es la clave de sus variaciones antigénicas, las que ocurren principalmente a nivel de los antígenos de superficie glicoproteicos, hemoaglutininas y neuroaminidasas (Figuras 1, 2 y 3). Se describen cambios antigénicos menores y mayores. Los cambios antigénicos menores o 'antigenic drift' resultan de mutacionesde los genes de las hemoaglutininas y neuroaminidasas, que emergen por selección de mutantes menos sensibles a los anticuerpos y que son predominantes en la población. Los cambios antigénicos mayores o 'antigenic shift' no pueden ser explicados por una simple mutación, probablemente ocurren por recombinaciones en que hay reordenamientos génicos; estas recombinaciones entre diferentes virus influenza han sido obtenidas experimentalmente en animales y luego seleccionadas por pasajes en animales inmunizados. A pesar de esta gran plasticidad, solamente algunos virus influenza, principalmente aquellos que afectan al hombre, han sufrido cambios antigénicos. El virus influenza del cerdo mantiene su estructura antigénica desde 1931 al igual que el subtipo 1 del virus influenza equina (H7 N7 ),mientras que el subtipo 2 (H3 N8 ) ha presentado pequeñas variaciones (Pereira y col., 1972; Heuschile, 1978; Hinshaw y col., 1983; Plateau y col., 1983; Berg y col., 1990), lo que ha llevado a incluirlo en algunas vacunas antiinfluenza equina. El virus influenza humano, desde que se aisló la cepa Ho N1 en 1933, ha presentado importantes variaciones antigénicas, las que han sido responsables de grandes pandemias de influenza, causadas por las cepas (H1 N1 ) en 1947; (H2 N2 ) en 1957, que corresponde a la primera cepa asiática; (H3 N3) o cepa Hong Kong y sus variantes England, Port Chalmers, Scotland y Victoria, en 1968.
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| Figura 1. Virus influenza. (Adaptado de Kaplan y Webter, 1977). |
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| Figura 2. Representación esquemática de la estructura tridimensional de hemoaglutinina (Trímero). (Adaptado de Pérez Bercoff, 1987). |
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| Figura 3. Representación esquemática de la estructura tridimensional de la neuroaminidasa (Tetrámero). (Adaptado de Pérez Bercoff, 1987). |
En 1957, Kaplan planteó en la OMS la hipótesis que las cepas de virus influenza humana habrían emergido de un reservório animal, opinión compartida por Chu Chi-Ming del 'National Vaccine and Serum Institute' de Changchun, quien también sugirió un reservorio animal como origen de las nuevas cepas asiáticas. Inmediatamente se iniciaron estudios sistemáticos para establecer si los animales tienen alguna importancia como fuente primaria de los componentes antigénicos de los virus influenza, o si de ellos pueden emerger nuevas cepas variantes que irían a infectar al hombre (Kaplan y Webster, 1977).
En el cerdo se ha demostrado la presencia de la cepa Hong Kong (H3 N2) de origen humano, habiéndose encontrado esta cepa en cerdos en Hong Kong y Estados Unidos de Norteamérica. En Chile, Vicente y col. (1979) describen un 93% de positividad frente a cepas de influenza humana del subtipo H3 N2 en 112 sueros de cerdos mayores de 15 meses de edad; sin embargo, no se detectaron anticuerpos contra la cepa A/porcino/Wisconsin/67. En Rusia, la cepa Hong Kong ha sido aislada desde perros, gallinas y vacas. Por otra parte en Fort Dix se aisló la cepa HSw1 N1 de un soldado muerto de influenza, constatándose serológicamente que 500 personas habían sido infectadas por este virus, aunque no ocurrió una diseminación mayor.
En el caso del equino, algunos brotes de 'influenza' descritos en el siglo XIX, fueron relacionados con la influenza humana; así en estudios serológicos retrospectivos realizados en sueros de personas que vivieron en 1889, se encontraron anticuerpos contra el antígeno H3 estrechamente relacionado con la cepa humana Hong Kong y el subtipo equino H3 N8 . Otro hecho curioso es la detección, en 1960, de anticuerpos contra el antígeno H3 en caballos de Mongolia, los cuales constituyen una población animal aislada de otros países. Al respecto, se piensa que el virus llegó desde Miami, en 1963 portado por aves migratorias; hipótesis que ha sido respaldada al determinarse que el antígeno H3 de la cepa Hong Kong está estrechamente relacionada, además del subtipo equino 2, con la hemoaglutinina del virus influenza aislado en patos, en Ucrania en 1963 (Lipkind, 1989; Lipkind y Weisman, 1989). Las clásicas técnicas serológicas de neutralización y de inhibición de la hemoaglutinación no son capaces de entregar pruebas fehacientes que un mismo virus ha afectado a dos especies de animales, por lo que actualmente se están utilizando, en forma combinada, las técnicas de hibridización de ARN y anticuerpos monoclonales (Cruciére y col., 1988; Lipkind, 1989; Appleton y col., 1989). En un caso de sospecha ecológica de infección interespecies con el virus influenza, el uso de estas técnicas modernas ha demostrado que los virus influenza aislados desde patos salvajes y pavos domésticos son indistinguibles (Yasuda y col., 1991).
 Los estudios realizados por los autores, han sido financiados por el Depto. Técnico de Investigación de la Universidad de Chile a través del Proyecto A-147 (1977- 1982). 'Estudio virológico de enfermedades respiratorias de mamíferos y aves'. |
Influenza equina
Antecedentes históricos
La influenza equina es una efermedad respiratoria conocida desde hace varios siglos. Los primeros antecedentes que se tienen sobre ella corresponden a veterinarios árabes quienes describieron un cuadro similar en caballos del Yemen (Fain Binda, 1990). Es importante señalar al respecto que en el equino, las virosis que se presentan como problemas respiratorios son causadas por diversos virus, citándose entre ellos, además del virus de la influenza equina, el virus herpes equino tipo 1 (VHE-1) y tipo 4 (VHE-4), ambos producen enfermedad respiratoria, pero el VHE-1 está relacionado con enfermedad sistémica y es el principal responsable de los abortos, muertes perinatales y síndromes neurológicos, virus parainfluenza tipo 3, adenovirus, rhinovirus; reovirus que produce la enfermedad del caballo africano y reovirosis, y un togavirus causante de la arteritis viral equina (Berríos, 1984). Obviamente la sola presentación de un cuadro respiratorio no puede conducir a un diagnóstico diferencial de estas virosis, situación que se debe tener en cuenta al analizar antecedentes históricos ocurridos antes del desarrollo de las técnicas virológicas y serológicas de diagnóstico.
El primer virus influenza equino fue aislado en 1956 en Checoslovaquia, durante una epizootia que abarcó Europa del Este y Suecia en 1955 y 1956. El virus fue denominado inicialmente como A 1 Praga. El segundo virus o subtipo fue aislado en Miami, Florida, Estados Unidos de Norteamérica, en un brote de enfermedad respiratoria que se inició en febrero de 1963, extendiéndose en junio del mismo año a Louisiana, Kentucky, Maryland, Nebraska, Colorado, California y luego a todo el resto de USA (Howard, 1971). El virus fue denominado A 2 Miami. Según Howard (1971) en enero de 1963 se habían observado, en Miami, equinos Fina Sangre de Carrera con una enfermedad respiratoria semejante a la descrita en la influenza equina. Cabe señalar que estos animales habían sido importados desde Argentina por vía aérea. Por otra parte, este autor, consigna que en mayo de 1963 ocurrió en Kentucky una segunda epizootia de influenza que sólo afectó a equinos de 2 años de edad, aislándose el virus A 1 Praga. Los síntomas clínicos en ambas epozootias fueron semejantes. Estudios retrospectivos demostraron que el virus A 1 Praga estaba presente en forma enzoótica en los Estados Unidos de Norteamérica ya en 1957 (Howard, 1971).
Considerando los antecedentes antes descritos se plantea la gran interrogante sobre el origen de los virus influenza equino. Si se acepta que los virus influenza derivan de un ancestro común y que ellos han estado mutando continuamente, habría que considerar la posibilidad de aparición de nuevas mutantes que al infectar poblaciones de animales carentes de inmunidad específica causen explosivos brotes de la enfermedad, como fue el caso de la influenza humana causada por la cepa Hong Kong. Además existen evidencias sobre la recombinación de virus influenza que afectan a diferentes especies en la naturaleza, es así como experimentalmente se han obtenido híbridos estables que contienen antígenos de cepas equinas y humanas del virus influenza inoculadas simultáneamente en embriones de gallina (Beveridge, 1977).
Según Bryans (1975) existirían evidencias históricas de la presentación de la gripe equina en los siglos XVIII y XIX. Es anecdótica la situación producida en Nueva York, en 1872, cuando la movilización de aquel entonces fue severamente alterada por un cuadro gripal que afectó a los caballos que tiraban los carruajes de esa época.
La influenza equina es una enfermedad de características infecciosas y contagiosas que afecta las vías respiratorias superiores de los equinos; presentándose en grandes brotes epizoóticos, con un corto período de incubación de 2 a 4 días. La enfermedad es de alta morbilidad y baja letalidad. Los animales son susceptibles, cualquiera sea su edad o raza, cuando no presentan inmunidad específica. La sintomatología clínica, de aparición rápida, se refiere principalmente a una rinitis seromucosa que paulatinamente se hace mucopurulenta en complicaciones bacterianas. Además se aprecia alza térmica (39 a 41ºC), decaimiento y tos seca. Las membranas mucosas respiratorias están congestivas, pudiendo detectarse faringitis y laringitis. Otras complicaciones como neumonía, bronconeumonía y pleuresía, son ocasionales. La destrucción de la mucosa respiratoria posibilita las complicaciones bacterianas oportunistas. Aproximadamente a los 10 días de iniciado el cuadro los animales se recuperan, manteniéndose la tos residual aproximadamente durante 3 semanas. En el equino no se describen abortos causados por el virus influenza, como ocurre en los cerdos (Kemen, 1975).
Diagnóstico
El diagnótico de laboratorio de la influenza equina se realiza con muestras nasofaríngeas profundas, las que deben ser tomadas en la fase inicial febril de la enfermedad, utilizando sondas profundas. Para la replicación viral se inoculan huevos embrionados de gallina, vía cavidad alantoidea o amniótica. La presencia de virus influenza se detecta mediante la prueba de hemoaglutinación de eritrocitos de gallina, y su tipificación mediante la prueba de inhibición de la hemoaglutinación, utilizando sueros patrones. El subtipo H7 N7 mata al embrión de gallina antes de las 48 horas de inoculación, mientras que el subtipo H3 N8 es más lento.
Los virus de las influenzas, sólo se multiplican en células previo tratamiento con tripsina (Davies y col., 1978).
El diagnóstico serológico se realiza tomando muestras séricas pareadas en equinos que presentan síntomas respiratorios, una al inicio de la enfermedad y la segunda, aproximadamente, a los 14 días después; la seroconversión debe ser de tres a cuatro diluciones al doble de anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación para ser considerada como alza diagnóstica.
La prueba de fijación del complemento permite detectar tempranamente, antes de los 7 días después de la infección, anticuerpos clase IgM, lo que permite determinar el tipo (A, B o C) del virus influenza actuante. Otras pruebas serológicas tales como inhibición de la neuroaminidasa, inmunodifusión, seroneutralización, hemólisis radial simple y ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) han sido utilizadas eventualmente. Recientemente se han desarrollado técnicas más sofisticadas como la prueba de fijación de antiglobulina radioisótopa y Das-Elisa (double antibody sandwich). En Suecia se utiliza una variante de la prueba inmunoenzimática ELISA, llamada de bloqueo, debido a que si el suero equino contiene anticuerpos contra el virus influenza equino, éstos se van a unir al virus previamente fijado en pocitos de microplacas, bloqueándolos, es decir impidiendo que en una segunda fase de la prueba, se unan a anticuerpos monoclonales conjugados con peroxidasa (Dinter, 1989).
El diagnóstico clínico presuntivo, diferencial, debe considerar fundamentalmente que la influenza equina es de aparición brusca y de rápida diseminación; presentándose generalmente en grandes brotes epizoóticos que pueden abarcar no sólo países sino también continentes. En el caso de la rinoneumonitis equina, la sintomatología respiratoria se presenta principalmente en potrillos y en forma menos severa que en la influenza equina; en yeguas preñadas, éstas pueden abortar en el último tercio de la gestación. En la arteritis viral equina el cuadro respiratorio es acompañado de queratoconjuntivitis y el aborto se produce inmediatamente después; en esta enfermedad, que no se ha presentado en Chile, hay un manifiesto edema en las extremidades. Los adenovirus equino afectan principalmente a potrillos de raza Arabe que sufran algún tipo de inmunodeficiencia; su presentación es esporádica, describiéndose además de los síntomas respiratorios, panuveítis, neumonía, atelectasia y diarreas. Los rhinovirus del equino son responsables de una enfermedad respiratoria esporádica, semejante al resfrío común del hombre; en Chile se puede considerar la posibilidad que algunos cuadros respiratorios de carácter estacional, denominados catarros y confundidos con una presentación enzoótica de influenza, sean realmente causados por rhinovirus equinos (Berríos, 1984a).
Quimioprofilaxis
Desde un punto de vista profiláctico de la quimioterapia antiviral se ha descrito que la amantadina (l adamantanamina H Cl) es efectiva contra los virus influenza equinos. Esta amina cíclica actúa inhibiendo la penetración y desnudamiento de los virus influenza; se ha usado como tratamiento en humanos, aunque los mejores resultados se han obtenido como medida de profilaxis. In vitro se ha demostrado que es efectiva también para el virus influenza aviar.
Inmunoprofilaxis
La infección con un subtipo del virus influenza equino no produce inmunidad contra el otro subtipo, por lo cual las vacunas antiinfluenza equina deben contener ambos subtipos. Estas vacunas son preparadas con virus obtenido en huevos embrionados de gallina e inactivados con formalina o beta propiolactona conservándose completa la partícula viral. Como toda vacuna inactivada debe adicionarse un coadyuvante, hidróxido de aluminio, alginato de sodio o adyuvante de Freund, con lo que se consigue una mejor respuesta inmunológica.
La purificación y concentración del virus influenza equino se puede realizar mediante sencillas técnicas de adsorción y elución del virus sobre eritrocitos de gallina o mediante ultracentrifugación. Se ha descrito la preparación de estas vacunas produciendo la desintegración de la partícula viral al someterla a un tratamiento con éter y un detergente, tween (Burki y Sibalin, 1973).
En influenza equina no se utilizan vacunas preparadas con virus vivo modificado; sin embargo, se ha experimentado con cepas de origen aviar que posean ya sea las hemoaglutininas o las neuroaminidasas semejantes a la de los virus influenza equina. Brundage-Anguish y col. (1982) describen la obtención de un virus influenza equino, subtipo A/equi/1 (ts) que correspondería a una mutante termosensible por reordenamiento génico; al mezclar un virus influenza humano ts donante con un virus influenza equino A/equi/1 Cornell/16/74 se obtuvo un virus influenza ts con las hemoaglutininas y neuroaminidasas del virus equino. Anteriormente se había logrado transferir los genes responsables de mutaciones ts desde un virus donante ts atenuado a un virus influenza de campo, habiéndose obtenido su atenuación para el hombre. Los clones ts no replican a 37 ó 38ºC in vitro, si se multiplican eficientemente en el tracto respiratorio de humanos y hamsters, induciendo una buena respuesta sistemática y humoral contra el virus influenza.
En el equino, estos virus ts no replican en el tracto respiratorio bajo, que tiene una temperatura aproximada de 38ºC y por lo tanto no deberían producir la característica tos de la influenza equina; además, debido a una mayor estimulación del sistema inmune local y sistémico disminuiría la necesidad de vacunar frecuentemente a los equinos, permitiendo hacerlo una sola vez al año. Las ventajas que ofrecen las vacunas preparadas con cepas ts, abren buenas perspectivas en el uso de vacunas vivas contra la influenza equina (Brundage-Anguish y col., 1981).
Por otra parte, es necesario recordar que el gen del principal inmunógeno del virus influenza, la hemoaglutinina, ha sido clonado y expresado en Escherichia coli, constatándose que cada célula produce 108 moléculas de hemoaglutininas, las que podrían ser utilizadas en la preparación de vacunas subunitarias. Una vacuna subunitaria ha mostrado grandes posibilidades inmunoprofilácticas en experimentos realizados en ratones (Berríos, 1984b).
Calendario de vacunaciones
Howard en 1971, proponía un calendario de vacunación contra la influenza equina, que se iniciaba con dos dosis, como vacunación base, aplicadas con un intervalo de 3 meses; en el caso de animales mayores sin antecedentes de vacunación, este intervalo debería ser solamente de 2 semanas. En equinos menores de 2 años la revacunación debe hacerse dos veces al año, bastando una sola dosis en animales mayores.
Bürki en 1977 (Conferencia no publicada, Santiago, 26 septiembre, 1977), preconizaba vacunar a potrillos mayores de 3 meses, los que presentan un sistema maduro, a la vez que carecen de anticuerpos maternos (Oirschot y col., 1991) . Esta primera vacunación consistía en la aplicación de dos dosis con un intervalo de 9 semanas. La revacunación en equinos jóvenes, hasta 2 años de edad, sería en base semianual (dos veces al año), en julio y enero del hemisferio Norte, debido principalmente a que la mayoría de los brotes de influenza equina en Europa Central, habían ocurrido entre febrero y junio, y entre agosto y octubre. Mc Beath y col. (1983) preconizan una primo vacunación doble, con un intervalo de 4 a 6 semanas y una dosis de refuerzo a los 6 ó 12 meses.
Según Liu (1986) es recomendable aplicar una dosis de refuerzo ('booster') repetida con 2 a 3 meses de intervalo, seguido por vacunaciones anuales o semianuales. La primera vacunación se hacía a los 3 meses de edad, considerando la presencia de anticuerpos maternales; sin embargo, Liu y col. (1985) demuestran que los anticuerpos maternos persisten en el animal joven durante 2 a 4 semanas, considerándose como titulos de anticuerpos IHA de valor protectivo mínimo entre 16 y 32. Según estos autores pareciera que un 50% de los potrillos hijos de madres vacunadas un mes antes de la parición, estarían protegidos durante los dos primeros meses de vida.
De acuerdo a las indicaciones emanadas por un Comité Internacional Para las Enfermedades de los Equinos, la vacuna antiinfluenza equina debe aplicarse en base a un calendario que contemple una primo doble vacunación a los 3 y 4 meses de edad del potrillo, revacunándose cada 6 meses o una vez al año, y en situaciones críticas de contagio.
Influenza equina en Chile
Antecedentes generales
El primer brote de influenza equina descrito en Chile, ocurrió en junio de 1963 (Fuschlocher y col. , 1963). Anteriormente, en julio de 1957 se presentaron cuadros gripales en equinos de Santiago, los que coincidieron con una epidemia de influenza humana producida por la cepa A/Japón/305/57 (H2 N2) (Berríos, 1984a). Según Francisco Fuschlocher (Comunicación personal), en 1936 se presentó un brote de gripe equina con caraterísticas clínicas y epidemiológicas, de rápida diseminación, presentación aguda y escasa mortalidad, semejantes a las descritas para la influenza equina.
Con anterioridad a 1963 es difícil establecer fehacientemente la presencia de influenza equina al no existir el aislamiento viral que corrobore los antecedentes clínicos o epidemiológicos informados. En el continente americano es posible seguir la diseminación del virus H3 N8, el que se aisló por primera vez en Miami en 1963 (enero o febrero), en un brote de influenza equina, el que en junio del mismo año se diseminó a numerosos Estados del país del Norte y a Canadá. El virus se aisló en San Pablo, Brasil y en Uruguay (febrero, 1963). En 1965 este subtipo apareció en Europa, donde causó grandes epizootias en Inglaterra, Francia y Suiza y luego en Japón. Posteriormente, en el continente americano se ha aislado en México en 1967 (Cunha y González, 1967), y en San Pablo y Río de Janeiro en 1969 (Cunha, 1970). De acuerdo con esta cronología epidemiológica, es lícito pensar que el brote ocurrido en Chile, en junio de 1963, fue causado por el subtipo H3 N8.
Según Fain Binda (1990) la cepa H3 N8 ya circulaba antes de su aislamiento inicial en Miami (1963), hecho demostrado al encontrarse anticuerpos contra este subtipo en caballos de vida libre, en sueros obtenidos durante 1960 en Mongolia. El eslabón hipotético que conecta este hallazgo con la epizootia de influenza equina del año 1963, es la posibilidad que aves migratorias hayan vehiculizado el virus. En el caso de los caballos de Mongolia no se pudo demostrar ningún contacto de estos animales con el exterior.
La cepa equina H3 N8 tiene estrechas relaciones con cepas aviares: A/pato/Ucrania/1/63 y A/pato/ England/62; también se relaciona con la cepa humana A/Hong Kong/1/68, en este caso la relación está confinada a la hemoaglutinina H3. Por otra parte se ha descrito que la cepa H3 N8 comparte la neuroaminidasa con la cepa A/codorniz/Italia/1117//65 (H10 N8) (Fain Binda, 1990; Yasuda y col., 1991).
Brote de Influenza Equina. 1963
En el brote de influenza equina que se presentó inicialmente en la provincia de Santiago, según Fuschlocher y col. (1963) la enfermedad apareció en forma brusca a principios de junio de 1963, durando aproximadamente un mes, para cesar, también en forma brusca, después de las primeras lluvias prolongadas; aseverando además, que en los últimos 10 años este cuadro gripal no se había presentado con tanta intensidad. Los primeros casos que llegaron a la Clínica de la Escuela de Medicina Veterinaria (Interior Quinta Normal) provenían de la Vega Central. Los síntomas generales correspondían a hipertermia, fluctuando la temperatura entre 38,5 y 41,5ºC, taquipnea, taquicardia, anorexia, decaimiento, somnolencia; conjuntiva inyectada y epífora; siendo el aparato respiratorio el más afectado, observándose exudado nasal bilateral, mucoso o mucopurulento; tos seca intensa y a veces productiva; y sensibilidad en la región laringeana y traqueal. La enfermedad afectó indistintamente a animales de diferentes condiciones; sin embargo, en los de mayor edad, dedicados al trabajo de tracción, principalmente en caballos carreteleros, se presentaron complicaciones más graves como neumonías y fiebre petequial; describiéndose, además, siete casos con púrpura hemorrágica, y aborto en tres yeguas y una burra. El cuadro clínico evolucionó entre 7 y 10 días, con un pronóstico por lo general benigno.
En la presentación del trabajo de Fuschlocher y col., a la 5a Convención Nacional de Médicos Veterinarios realizada en octubre de 1963 en la ciudad de Valdivia, se discutieron algunas situaciones interesantes de recordar. Según Teodoro Posseck, la epizootia no se presentó exclusivamente en Santiago; al respecto, Rubén Maldonado manifestó que en el Club Hípico de Concepción, la aparición de la enfermedad, a fines del mes de junio, coincidió con la llegada de dos caballos procedentes de Santiago; propagándose en forma rápida, llegando a afectar aproximadamente 300 de los 400 caballos de la dotación del Club Hípico. Entre las complicaciones observadas se mencionó un caso de pleuroneumonía fatal, y aborto en dos yeguas confinadas en el Club. Por otra parte, Francisco Fuschlocher afirmó que lo notable de la epizootia es que había afectado intensamente a animales de trabajo, siendo que a la fecha solamente se había observado en caballos Fina Sangre de Carrera.
Finalmente, cabe consignar que en este brote de influenza equina no se aisló el virus causante, y que la época de aparición del brote coincidió con una epidemia de influenza humana (Fuschlocher y col., 1963). Además es justo recordar que otro documento que se refiere a este brote, es una comunicación interna de Ricardo Díaz Emparán titulada 'Estudio epizootiológico de la influenza equina en la población caballar del Regimiento Cazadores' (Of. 879, 1963).
Brote de influenza equina. 1977
Casanova y col. (1977) describen por primera vez en Chile el aislamiento y tipificación de un virus influenza equino, correspondiente al subtipo A/equi/l (H7 N7). El virus replicó con facilidad en huevos embrionados de gallina inoculados por vía alantoidea, obteniéndose títulos hemoaglutinantes 512 en el tercer y cuarto pasaje. La capacidad de provocar la muerte del embrión en forma regular se logró solamente después de 5 a 6 pasajes, obteniéndose títulos de 106, 2 DIE 50/ml y un tiempo de mortalidad embrionaria comprendido entre las 48 y 72 horas postinoculación. Las muestras positivas produjeron un efecto citopático al ser inoculadas en cultivos de fibroblastos de embrión de pollo, 4 días después de su inoculación en el tercer pasaje; los cultivos celulares con efecto citopático fueron capaces de hemoadsorber eritrocitos de cobayo. El virus aislado en este brote demostró reacción de identidad (160) con un suero patrón anti A/equi/1, siendo negativo frente al suero anti A/equi/2.
Los sueros de animales enfermos presentaron títulos bajos, en la prueba de inhibición de la hemoaglutinación, entre menores de 10 y 40, mientras que en los animales convalecientes los títulos fueron mayores, entre 320 y 2.560; en esta prueba se utilizó como antígeno hemoaglutinante el virus recientemente aislado. Según los autores, esta seroconversión fue considerada como alza diagnóstica, confirmándose que el virus causante del brote correspondía al subtipo A/equi/ 1 /Praga/57. El brote fue calificado como de inusitada intensidad, viéndose afectada una alta proporción de la población equina, sin distinción de edad o sexo; presentándose el cuadro con la sintomatología clásica de una afección respiratoria viral que se manifiesta por secreción nasal abundante y tos seca y persistente, acompañada de fiebre alta (Casanova y col., 1977).
Según Muñoz (1977) en este brote los animales más afectados fueron los menores de 5 años; la sintomatología fue más marcada, abarcando un mayor número de equinos. El rango de duración de los brotes fue de 10 a 30 días. Se analizaron 25 muestras de exudado nasal de equinos enfermos, 21 del Hipódromo de Chile (Santiago) y 4 del Departamento de San Carlos (Provincia de Nuble), aislándose 4 cepas de virus influenza A, en huevos embrionados de gallina, que se identificaron por IHA como estrechamente relacionadas con la cepa A/equi/1/Praga/56 (Heq 1 Neq 1), al detectarse títulos de 80 entre el virus A/equi/1/San Carlos/116/77 y el suero homólogo estándar; el virus control A/equi/1/Praga/56 presentó un título de 320; los títulos de los virus fueron menores de 10 frente al suero A/equi/2/Miami 63. El resultado fue semejante para las otras tres cepas, lo que indicaría una relación entre estas cepas en su antígeno H del virus A/equi/1/Praga/56. Se consideró como prototipo a la cepa A/equi/San Carlos/116/77, aislada en el Departamento de Virología del Instituto de Salud Pública de Chile. La neuroaminidasa de las cepas fue caracterizada por el Centro Internacional de Influenza para las Américas de Atlanta, Georgia, USA, como Neq 1, semejante a la cepa A/equi/1/Praga/56 (Heq 1 Neq 1) o H7 N7 (Muñoz y Col., 1979).
En el brote de 1977 se encuestaron 19 instituciones hípicas de la V, VIII y Región Metropolitana; en 14 se analizaron 8.283 animales que estaban bajo control médico veterinario, lo que correspondía aproximadamente al 1% de la población equina nacional (INE, 1976), de la cual sólo el 8,7% estaban vacunados con 1 ó 2 dosis de vacuna influenza equina. Entre 88 y 100% de los animales no vacunados presentaron síntomas clínicos de la enfermedad, excepto en un haras con un 62% de enfermos, en que el 38% restante había sido importado desde Alemania en diciembre de 1976. Es importante destacar que se detectó una diferencia significativa entre los animales vacunados (720) que recibieron una dosis de vacuna, los que enfermaron en un 85,9%, mientras que los que recibieron dos dosis se enfermaron con síntomas leves en un 64,1%. Las complicaciones posteriores fueron de tipo respiratorio y digestivas, y en menor grado, cardíacas y circulatorias, incluyendo edema de las extremidades; los 17 casos fatales detectados en este brote se debieron a complicaciones secundarias a la infección vírica (Muñoz y col., 1979).
Desde un punto de vista virológico las cepas obtenidas presentaron bajos títulos hemoaglutinantes (2 a 32), hecho que también se describió en la epizootia de influenza equina ocurrida en 1976 en Argentina (Fain Binda, 1977). Los títulos inhibidores de la hemoaglutinación presentaron valores entre 20 y 1.280, y de 20 a 320 en fijación del complemento. En la segunda muestra tomada aproximadamente 3 semanas después del brote, sólo el 36% de los sueros presentaron un alza diagnóstica o seroconversión positiva. En una tercera muestra, en todos los casos se observó un descenso entre 2 y 5 diluciones en los títulos IHA. Tanto el porcentaje de positividad como las medias geométricas fueron superiores en la muestra postepidémica, encontrándose una diferencia estadísticamente significativa (P
El Servicio Agrícola Ganadero, como medidas preventivas, recomendó vacunar y evitar la entrada de equinos provenientes de zonas endémicas vecinas. En este brote se consideró como posibles vías de entrada del virus al país, a través de caballos chilenos que hubiesen tenido contactos con caballos de Argentina en algún puesto fronterizo de San Fernando, o por un caballo de Ovalle, ciudad con gran movimiento de animales desde y hacia Argentina, que llegó al Hipódromo de Santiago, donde se le diagnosticó influenza equina; al día siguiente se presentó un caso de influenza en el 'stud' donde había estado el caballo; al día subsiguiente los 18 caballos del 'stud' presentaban influenza equina.
Esta epizootia de influenza equina se inició en julio de 1976 en Brasil, extendiéndose posteriormente a Uruguay, Argentina, Chile y Perú (Cunha y col., 1978; Fain Binda y Martin, 1977). La cepa causal fue el subtipo H7 N7 y tuvo una tasa de ataque cercana al 100% con letalidad e inducción de abortos muy baja; prácticamente no afectó a otras especies (Fain Binda, 1990). A Chile el virus llegó desde Argentina durante los últimos días de enero de 1977; entre el 3 y 7 de febrero se extendió a La Serena y Puero Montt, y en la primera semana de marzo se detectó en Chiloé continental, Coyhaique y Aysén. En presencia del brote se tomaron las siguientes medidas: Declaración de zona amagada, prohibición de animales en ferias y prohibición de eventos ecuestres y en general cualquier actividad que sometiera al animal a un estado estresante. Como tratamiento se recomendaron medidas dietéticas e higiénicas; reposo, abrigo, alimento en base a forrajes verde y blando, y agua a discreción, y la aplicación de medicamentos tales como vitamina C, antiinflamatorios y antipiréticos. Las pérdidas económicas se consideraron como cuantiosas, especialmente debido a los programas de carreras no realizados, al tratamiento y cuidados especiales de los animales enfermos, pérdida de 'training' en los caballos de carreras, y a muertes por complicaciones secundarias. En cinco instituciones hípicas se estimó una pérdida económica de aproximadamente $11.830.000 (Muñoz, 1977; Muñoz y col., 1979).
Con el fin de verificar la posibilidad que el virus de la influenza equina se transmite a la especie humana, se tomó una muestra sérica, en julio de 1977, a 32 personas que durante la epizootia de influenza equina estuvieron en estrecho contacto con los animales enfermos, tales como médicos veterinarios, enfermeros, cuidadores y preparadores, de los cuales 22 procedían del Hipódromo Chile, de Santiago y 10 del Club de Polo y Equitación San Cristóbal de Santiago, sin econtrarse títulos de anticuerpos para la cepa viral causante del brote (H7 N7) (Muñoz, 1977; Muñoz y col., 1979).
Brote de influenza equina. 1985
A mediados de diciembre de 1985 se ,presentó un cuadro clínico gripal en equinos del Area Metropolitana, el que se extendió posteriormente a otras zonas del país. La sintomatología clínica se caracterizó principalmente por decaimiento, presencia de exudado masal, alza térmica y tos; el virus que se aisló, se tipificó como H3 N8, semejante al virus A/equi/2 Miami/63 y se denominó A/equi/2/Santiago/86. La tipificación del aislado viral fue confirmada mediante seroconversión en 13 muestras pareadas de sueros, obtenidos de equinos durante el brote y 21 días después, determinándose un alza diagnóstica en la prueba de IHA al detectarse títulos de anticuerpos específicos para el subtipo A/equi/2, los que aumentaron desde menores de 8 hasta 32 y mayores o iguales a 256 en la segunda muestra. Circunstancialmente, al hacer este estudio se detectaron títulos altos de anticuerpos contra el subtipo A/equi/1 (H7 N7), en ambos muestreos, lo que haría presumir una infección subclínica que habrían sufrido los animales con anterioridad, ya que estos animales no habían sido vacunados durante el año 1985 (Berrios y col., 1986).
En el mes de marzo de 1986, en el laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, se estudió el suero de 8 asnos, provenientes de Ovalle, y que habían sufrido un cuadro gripal durante este brote, detectándose mediante la prueba de IHA anticuerpos específicos con títulos entre 16 y 32, en 4 animales contra el virus A/equi/1/Santiago/77 (H7 N7), y 6 con títulos entre 16 y 64 contra el A/equi/2 (H3 N8) (Ando, y col., 1986).
De acuerdo con lo informado por Andrés Ríos E. (Comunicación personal), en el Policlínico de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile se atendieron 24 casos de caballos carreteleros con sintomatología clínica de influenza equina, caracterizada por decaimiento, cansancio, pérdida de fuerza, mayor sudoración, menor ingesta de alimentos y aumento en el consumo de agua. La temperatura fluctuó entre 38,5 a 39,4ºC, presentándose tos espontánea no productiva en las primeras 36 horas y reflejo tusígeno aumentado. Las mucosas ocular y nasal con congestión moderada, sin cambios la bucal. No se presentó secreción ocular. Al segundo y tercer día la tos se hizo productiva; al principio serosa, y al tercer día mucopurulenta. Los ganglios submaxilares se presentaban sensibles y con un pequeño aumento de volumen. En la zona de laringe y faringe se apreció moderado calor en la zona, con cierto grado de dolor al tacto. A la auscultación, la tráquea presentó estertores roncantes en la zona alta, aunque en el 40% de los animales se presentó estertores en la zona baja. El pulmón en la zona media presentó proyección de soplo tubárico y en la zona media y baja, por contaminación secundaria, se presentaron estertores húmedos difusos; en la zona alta el murmullo vesicular estaba aumentado y la percusión más audible. No se detectaron casos de neumonía.
El brote de influenza equina de 1985 se inició en la segunda quincena de diciembre, durando hasta mediados de enero; extendiéndose desde Santiago hasta Rancagua, Talca y Linares. Según Fain Binda (1990) esta segunda onda epizoótica que afectó a los países latinoamericanos, se originó en Miami y llegó a fines de 1985 a esta parte sur del continente; en la cadena de transmisión continental siempre fue posible detectar el contacto directo entre animales pura sangre de carrera, fundamentalmente favorecido por su traslado a largas distancias para competiciones. En varios centros de investigación y diagnóstico virológico de Sudamérica se estudió la epizootia y se identificó el agente viral como A/equi/2/ (H3 N8). En todos los aislamientos hubo diferencias antigénicas con la cepa original H3 N8, lo que explicaría el brote a pesar de haberse vacunado recientemente. Knez (1986), (citado por Fain Binda, 1990), del Centro Nacional de Influenza, en Córdoba, Argentina, encuentra estas cepas relacionadas con las cepas Fontenblue/79 y Kentucky/80 (H3 N8, específicamente en el caso de los áislados en Córdoba y Santa Fe. Nocetto y col. (1989) encuentran que las cepas aisladas en La Plata, Argentina, son similares al A/equi/2 Solvallal79 (Hg N8) aislado en Suecia en 1979.
La tasa de ataque fue muy alta, con baja letalidad. Los síntomas clínicos y la ocurrencia de complicaciones inmediatas y mediatas fue más severa que en el brote de influenza equina causado por el subtipo A/equi/l (H7 N7) (Ando, 1986).
Brote de influenza equina. 1992
En la primera semana de enero de 1992, en Quillota, V Región, se presentó un cierto número de equinos con síntomas similares a los descritos para la influenza equina. Aparentemente el brote se inició coincidentemente con un concurso ecuestre en el que participaban caballos argentinos. A fines del mismo mes se presentaron casos con síntomas respiratorios en equinos Fina Sangre de Carreras en el Club Hípico de Satiago, ya en febrero la epizootia se había extendido al Sporting Club de Viña del Mar y a fines del mismo mes la enfermedad se presentó en forma más marcada en la masa caballar del Club de Polo San Cristóbal de Santiago. En el laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, se aisló y tipificó el agente causal de este brote, denominándose A/equi/2/Quillota, 1992, semejante al subtipo del virus influenza equina H3 N8. El diagnóstico virológico fue corroborado serológicamente al detectarse seroconversión en muestras séricas tomadas en animales al inicio de la enfermedad y 11 días después, con alza diagnóstica entre 8 y 128 (Celedón y col., 1992).
Este brote de influenza equina se caracterizó por su lenta difusión, afectando principalmente a animales de 2 años, los que presentaban secreción ceromucosa, tos persistente durante 3 semanas; temperaturas entre 40 y 40,5ºC y en algunos casos exudado mucopurulento. En términos generales el cuadro clínico fue menos severo que en el brote, causado también por el subtipo H3 N8, ocurrido en diciembre de 1985. El brote de este año, descrito principalmente en Santiago y Viña del Mar, se extendió a otras zonas del país, como Chillán (Armando Islas: Comunicación personal).
Como antecedente previo a este brote es preciso recordar que en Colombia en 1991 ocurrió un brote de influenza equina, describiéndose 23.844 casos con 10 animales muertos (Boletín Informaciones Sanitarias OIE Vol. 4, Nos 1-40).
Posibles casos de influenza equina ocurridos entre 1963 y 1990.
En 1969, en los últimos días de enero y primeros días de febrero, se presentó un brote de gripe equina, de cierta magnitud, que fue diagnosticado como tal solamente en base a la sintomatología clínica y al cuadro epidemiológico. No existen antecedentes escritos sobre esta epizootia (Berríos, 1984).
En 1973, en un estudio clínico y virológico de las afecciones respiratorias del equino (Ríos, 1973), se estudiaron 62 muestras de exudado nasal, de las cuales 31 correspondían a equinos clínicamente enfermos atendidos en el Policlínico de Animales Mayores de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile, y 31 a equinos clínicamente sanos provenientes del Matadero de San Pablo, Santiago. En los animales enfermos se observó una amplia sintomatología: secreción nasal bilateral mucosa, tos, reflejo tusígeno aumentado, murmullo vesicular más audible, disnea expiratoria y soplo tubario aumentado. La media en la duración del cuadro clínico fue de 8 días, siendo la tos el último signo en desaparecer.
De las 31 muestras de caballos enfermos, 23 (74,1%) resultaron positivas al ser inoculadas en huevos embrionados de gallina, demostrándose la replicación viral mediante hemoaglutinación, aunque sin llegar a tipificar el aislado viral. Los títulos hemoaglutinantes oscilaron entre 20 y 2.560. Solamente dos muestras de animales sanos fueron positivas con títulos hemoaglutinantes de 10 y 320. En cuanto a la serología, en los animales enfermos se detectaron 23 positivos en la prueba de IHA con títulos entre 20 y 640, mientras que en todos los sueros de los animales sanos se encontraron títulos positivos entre 40 y 1.280. Estos resultados se explican debido a que las muestras séricas de los equinos enfermos se tomaron durante el comienzo del cuadro clínico, y a que en el caso de los equinos clínicamente sanos, en que 100% presentó anticuerpos contra el virus hemoaglutinante aislado en el brote, ellos habrían sufrido la enfermedad en un período anterior, probablemente en el otoño de 1973 (Ríos, 1973).
Durante el estudio antes señalado, cuya parte virológica fue realizada en el laboratorio de Virología del Instituto de Investigaciones Veterinarias dependiente del Ministerio de Agricultura, ocurrió un hecho de notable significado epidemiológico, en que el autor del trabajo de tesis se enfermó de influenza, sufriendo un cuadro muy semejante al de los equinos, con temperatura de 40°C, rinitis, tos, disnea y aumento de volumen de los ganglios submaxilares y el consiguiente dolor y problemas en la deglución. El cuadro gripal le duró 5 días. Esta situación implicaría el contagio, entre equinos y el hombre (Kasel y Couch, 1969; Kaplan, 1982), con un virus probablemente de influenza equina, ya que este virus hemoaglutinante no se tipificó; sin embargo, avala fehacientemente el contagio, el hecho de haberse encontrado en el suero del paciente anticuerpos específicos con un título IHA de 2.560 en una muestra sérica tomada 14 días después de haber sufrido la infección (Ríos, 1973). El alto título de anticuerpos detectado en el paciente significa que tienen una alta especificidad con el virus actuante en los equinos, y ya sea éste de origen humano o equino, demostraría la infección interespecie, salvo que haya ocurrido una respuesta de tipo anamnésico en que la reinfección estimula la producción de anticuerpos contra un virus que hubiera infectado con anterioridad al paciente. Este virus tendría que haber sido un virus influenza asiático (H3 N2) que comparte la misma hemoaglutinina con el subtipo equino 2 (H3 N8). Al analizar este caso es conveniente recordar que el subtipo H3 N8 era el único virus influenza equino actuando en el continente americano desde 1963 hasta 1976 en que se aisló el subtipo H7 N7 (Fain Binda, 1990).
En 1990, el Servicio Agrícola y Ganadero en Magallanes dispuso .'declarar como zona amagada de influenza equina a la provincia de última Esperanza y una pequeña parte de la provincia de Magallanes en la XII Región de Chile, luego que se ha detectado y comprobado la existencia de una enfermedad que afecta a los caballares denominada influenza equina'. Una información dada a conocer por el director del SAG, indica que 'la enfermedad, caracterizada por una propagación rápida y generalizada, no es grave en sí misma; sin embargo, puede provocar grandes trastornos en hipódromos, rodeos y faenas, ya que impide el entrenamiento y trabajo de los caballos'. Se prohibe el traslado de equinos en todas sus formas desde y hacia la zona amagada, recomendándose la vacunación en lugares de concentración de caballares con revacunación de estos animales a los 6 meses si la enfermedad persiste. El punto cuarto del comunicado del SAG señala que 'se autorizará el traslado de equinos fuera de la zona amagada siempre que éstos hubiesen sido vacunados con una anticipación mínima de 15 días a la fecha de la solicitud, hecho que deberá acreditarse a satisfacción del Servicio Agrícola y Ganadero (El Mercurio, 3 de marzo de 1990). No existen otros antecedentes que avalen la presentación de la influenza equina en la zona austral de Chile (A. Casanova. Comunicación personal).
Estudios realizados en Chile sobre influenza equina
Además de los trabajos relacionados con el aislamiento del virus de la influencia equina y descripción de los brotes de la enfermedad en Chile, se han realizado estudios referentes a técnicas de diagnóstico, adaptación del virus a cultivos celulares, caracterización bioquímica de las cepas chilenas y respuesta postvacunal frente a diversas vacunas influenza equina.
Técnicas diagnósticas
Uno de los primeros estudios tuvo como objetivo determinar si los resultados son semejantes cuando se emplean las modalidades de macrométodo, en tubos, o micrométodo en la prueba de IHA, utilizando eritrocitos de gallina o de equino; para ello se utilizaron sueros de equinos vacunados contra la influenza equina y la cepa A/equi/1/Santiago, Chile/77 (H7 N7), determinándose que los títulos de anticuerpos ínhibidores de la hemoaglutinación, medidos en macro y micrométodo se encuentran correlacionados, ya sea empleando eritrocitos de gallina (r = 0,76; p
En 1989 se estudió la relación entre las pruebas de IHA y seroneutralización en cultivo celular, con las dos cepas del virus influenza equina actuantes en el país, cultivadas en las líneas celulares MA-104 y RFE, y en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo, en pasajes sucesivos y alternados con inoculaciones en saco alantoideo de huevos embrionados de gallina (Moya, 1989). Ambas cepas produjeron efecto citopático en los tres cultivos celulares; sin embargo, la cepa A/equi/1/Santiago, Chile/77 (H7 N7) presentó un título máximo hemoaglutinante igual a 128 y un título infeccioso de 102.1 DICT 50/ml. Con la cepa A/equi/2/Santiago, Chile/85 (H3 N8) no se logró obtener títulos infecciosos mínimos para realizar la prueba de seroneutralización viral, por lo tanto no se usó en el estudio.
Al analizarse los títulos de anticuerpos específicos antivirus A/equi/1/Santiago, Chile/77 en 169 sueros equinos, 97 de ellos con títulos 0 ≥ 8, y 72 con títulos IHA
Con el fin de facilitar el diagnóstico serológico de la influenza equina se compararon las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación y hemólisis radial simple (HRS) en gel de agarosa y en gel de ion agar, en una muestra de 150 sueros positivos y 60 negativos en IHA para influenza equina, utilizándose las dos cepas chilenas A/equi/1/Santiago, Chile/77 (H7 N7) y A/equi/2/Santiago, Chile/85 (H3 N8) (Vega, 1991).
Los títulos promedios entre IHA y HRS (en gel de agarosa) no presentaron diferencias para ambos subtipos, teniendo la HRS una sensibilidad de 100% y una especificidad de 65% para el A/equi/1, y una sensibilidad de 96% con una especificidad de 82% para el A/equi/2, respecto a la prueba de IHA. En cuanto a la tendencia al cambio de resultado en el diagnóstico, mediante la prueba de McNemar se obtuvo X2 = 19,04 para el A/equi/1, y X2 = 0,941 en el subtipo A/equi/2; siendo en el primer caso significativo, aceptándose que existe tendencia al cambio en el diagnóstico serológico, mientras que en el segundo tiende a permanecer. Las correlaciones entre los títulos para estas pruebas alcanzaron a r = 0,63 y r = 0,59 para ambos subtipos (P
Entre las pruebas de IHA y HRS (en gel de ion agar) se detectaron diferencias en los títulos promedios (P 2 = 36 para el A/equi/1 y un X2 = 4,9 para el A/equi/2, existiendo por lo tanto una tendencia al cambio de diagnóstico serológico. Las correlaciones entre los títulos de anticuerpos detectados por estas pruebas se alcanzaron a R = 0,77 y r = 0,58 para los subtipos respectivos, ambas significativas.
La comparación entre las pruebas de HRS en gel agarosa y en gel de ion agar revela diferencias en ambos subtipos, con una sensibilidad de la HRS en gel de ion agar respecto a HRS en gel de agarosa de un 99 y 97% para los subtipos respectivos; mientras que la especificidad alcanzó a un 44 y 85%, respectivamente. Con la prueba de Mc Nemar se obtuvo un X2 = 13, 47 para el A/equi/1, y X2 = 0,75 para el A/equi/2, siendo solamente significativo en el primer caso. Las correlaciones entre los títulos obtenidos fueron significativas con un r = 0,58 para el subtipo A/equi/1 y r = 0,75 para el A/equi/2. Se concluye que la prueba de hemólisis radial simple en gel de agarosa puede ser utilizada como una prueba de rutina de laboratorio para el diagnóstico de la influenza equina, presentando ventajas en cuanto a la rapidez y el múmero de sueros que se pueden estudiar; por otra parte, la prueba de hemólisis radial simple en gel de ion agar puede ser también utilizada, puesto que presenta una correlación positiva para ambas cepas, aunque menor que la de hemólisis radial simple en gel de agarosa (Vega, 1991; Celedón y col., 1991).
Adaptación del virus influenza equino en cultivos celulares
Los virus de las influenzas no producen un efecto citopático en cultivos celulares. El virus de la influenza humana ha sido adapatado en cultivos celulares de riñón canino (línea celular MDCK (Davies y col., 1978).
Von Pette y Teufel, en 1966, lograron adaptar un virus influenza equino en cultivos celulares de riñón de pollo, evidenciándose los primeros indicios de daño celular a partir del 5º pasaje seriado (Billik, 1979).
En Chile, Casanova y col. (1977) describen que las muestras positivas de influenza equina produjeron efecto citopático en cultivos celulares de fibroblastos de pollo en el primer pasaje, manifestando este efecto 8 días después de la inoculación. En los pasajes sucesivos este lapso disminuye hasta llegar a 4 días después del tercer pasaje. Todos los cultivos que presentaron ECP, fueron capaces de hemoadsorber eritrocitos de cobayo.
Billik en 1979, describe que la evolución en la adapatación del virus influenza equino, cepa chilena del subtipo H7 N7, a cultivos celulares de fibroblastos de embrión de pollo evidenciada a través de efecto citopático, se manifiesta en forma progresiva a partir del 4º pasaje hasta el 7º, disminuyendo el tiempo de incubación para la aparición de dicho efecto; sin embargo, el ECP comenzó a disminuir desde el 8º pasaje hasta desaparecer paulatinamente. Cabe señalar que la inoculación de embriones de pollo con el líquido sobrenadante de estos cultivos celulares (pasajes 8º al 10º) poseían la capacidad de infectar y matar los embriones, lo que indicaría la presencia de virus infeccioso sin capacidad de producir ECP en cultivos celulares. La replicación del virus influenza equino en cultivos celulares se corroboró mediante la técnica de hemoadsorción.
Caracterización de las cepas chilenas del virus influenza equino
Palominos en 1987 investigó las principales características morfológicas, físicas,- bioquímicas, serológicas y culturales de las cepas del virus influenza equina A/equi/1/Santiago, Chile, 77 (H7 N7) y A/equi/2/Santiago, Chile/85 (H3 N8), concluyendo que ambas cepas presentan un marcado pleomorfismo, con pequeñas proyecciones de superficie y un diámetro entre 80 y 120 nm (Figuras 4 a y b). Las dos cepas fueron sensibles a la acción de solventes lipídicos, temperatura de 56° C por 30 minutos y pH 3,0. El pH 9,0 no las afectó. La cepa A/equi/1 presentó un título de 108,6 DIEP 50/ml y un título hemoaglutinante de 256; la cepa A/equi/2 un título de 107,2 DIEP 50/ml y un título HA de 128.
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| Figura 4a . Partícula viral de forma irregular (cepa A/equi/1/Santiago/77) (H7 N7), con proyecciones de superficie de la envoltura lipídica (Tinción negativa 87.920 X). (Palominos, 1987) | Figura 4b. Partículas virales de la cepa A/equi/2/Santiago/85 (H3 N8), alargadas, con proyecciones de superficie (Tinción negativa 87.920 X) (Palominos, 1987) |
En este trabajo se prepararon antisueros específicos inoculando gallos adultos vía intramuscular, con líquido alantoideo de huevos embrionados de gallina, inoculados con las cepas del virus influenza equino aisladas en Chile, obteniéndose títulos IHA de 64 para el virus A/equi/1 , y 16 para el A/equi/2; con los sueros de referencia homólogos se obtuvieron títulos IHA de 32 para las dos cepas, mientras que con los heterólogos no se observó inhibición de la hemoaglutinación. El índice neutralizante fue de ≥ 6,5 para el virus A/equi/l, y ≥ 4,5 para el virus A/equi/2.
Ambas cepas produjeron efecto citopático en cultivos celulares de riñón fetal ovino y fibroblastos de embrión de pollo, en su primer pasaje; en la línea celular MDBK de riñón fetal bovino, en el segundo pasaje, y en la línea celular de riñón fetal equino (Gaggero, 1984) en el tercer pasaje. El efecto citopático se caracterizó por la aparición de gran cantidad de células desprendidas (Figura 5). La especificidad de este efecto viral fue comprobado al inhibirlo mediante la inoculación de mezclas de virus y suero específico. La replicación viral fue confirmada por hemoadsorción (Figura 6) (Palominos, 1987).  |  |
| Figura 5. Células de riñon fetal ovino infectadas con la cepa A/equi/1/Santiago/77 (H7 N7). Se observa efecto citopático caracterizado por gran cantidad de células desprendidas, a las 24 horas después da la inoculación (100 X) (Palominos, 1987). | Figura 6. Prueba de hemoadsorción positiva. 48 horas después de la inoculación de células de riñón fetal ovino con la cepa A/equi/1/Santiago/77 (H7 N7). Se observa eritrocitis absorbidos a la superficie de las células (100 X) (Palominos, 1987). |
En 1978, en el Laboratorio Provac, Ltda. se preparó una vacuna contra la influenza equina utilizando la cepa A/equi/1 Santiago, Chile/77 propagada en huevos embrionados de gallina, inactivada con formalina y usando hidróxido de aluminio como coadyuvante. El control de inactivación se efectuó en huevos embrionados de gallina, y los controles de potencia, toxicidad y tolerancia se realizaron en animales de laboratorio. Al medir la respuesta inmune en cobayos previamente inmunizados con la vacuna experimental, los títulos de anticuerpos IHA fluctuaron entre 128 y 256. La prueba de potencia se realizó inmunizando 30 equinos de 2 a 10 años de edad y la respuesta postvacunal se midió mediante la titulación de anticuerpos IHA, encontrándose diferencias significativas entre los títulos IHA pre y postvacunales (p
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| Figura 7. Títulos de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación expresados en medias geométricas (MG). (Pinto y col., 1987) |
Rabajille (1979) en un estudio diseñado para conocer las variaciones que pueden experimentar las distintas fracciones proteicas sanguíneas en respuesta a una vacunación viral (Influenza equina) y su relación con los títulos IHA, analiza la respuesta inmune luego de aplicar una dosis de la vacuna comercial antiinfluenza equina (FluvacR) bivalente, en 29 equinos Fina Sangre de Carrera, obteniendo los siguientes títulos en MG de anticuerpos IHA frente al virus influenza equina cepa A/equi/1/Santiago, Chile/77 (H7 N7) en su pasaje 21).
| 0 día | = | 3,55 |
| 7 días | = | 31,99 |
| 15 días | = | 113,50 |
| 30 días | = | 52,70 |
Los títulos de anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación fluctuaron entre 256 y 1.024, y fueron detectados a los 15 días postvacunación; a los 30 días los títulos eran de 16 a 128 (Rabajille, 1979; Palacios, 1979).
Billik (1979) en un muestreo serológico realizado en 1978, estudió mediante la prueba de IHA el suero de 177 equinos entre 5 y 10 años de edad, sin antecedentes de vacunación contra la influenza equina, aunque afectados en el brote epizoótico de 1977, obtuvo un total de 58 animales positivos (32,8%) con títulos IHA 20. De acuerdo con estos antecedentes en el mismo año, 24 equinos fueron sometidos a tres inmunizaciones con una vacuna comercial cuádruple antiinfluenza equina (IFFAMerieux) la que contiene las cepas A/equi/1/Praga/56, A/equi/2/Miami/63 y dos cepas A/equi/2 aisladas en Francia.La primera dosis de refuerzo se aplicó a los 2 meses de la dosis inicial; la segunda dosis de refuerzo se aplicó 5 meses después. Los resultados se expresan en el gráfico 1, observándose que en el tiempo cero de la experiencia (12 meses después de ocurrido el brote de 1977) la MG fue de 27 con títulos IHA que fluctuaban entre 20 y 160. A los 14 días de la primera vacunación se detectó el mayor incremento de los títulos de anticuerpos IHA entre 40 y 320, con una MG de 139, valores que descendieron a los 28 días con títulos IHA entre 20 a 160, y una MG de 45. A los 63 días la MG había descendido a 31. La respuesta serológica consecutiva a la segunda dosis no superó el aumento inicial, debido probablemente a que el intervalo entre su aplicación con respecto a la primera fue corto. Según Burki (Comunicación personal) la aplicación de una dosis de refuerzo debe efectuarse por lo menos con una diferencia de 2 a 3 meses. A los 14 días postsegunda vacunación se obtuvieron los títulos máximos con títulos entre 20 y 320 y una MG de 56; títulos IHA entre 20 y 80 (MG = 15) se mantenían después de 219 días.
 |
| Gráfico 1 . Medidas geométricas de los títulos inhibidores de la hemaglutinación obtenidos después de cada vacunación (Billik, 1979) |
La segunda dosis de refuerzo se aplicó 5 meses después, obteniéndose títulos IHA entre 20 y 320 (MG = 74) a los 14 días después de la vacunación, valores superiores a los obtenidos en la primera dosis de refuerzo, aunque inferiores a los obtenidos en la primera vacunación (Billik, 1979; Celedón y col., 1981).
Con el objetivo de precisar si la respuesta inmune postvacunal es influida por los títulos de anticuerpos IHA previos, los 24 equinos utilizados en la experiencia anteriormente descrita, se dividieron en dos grupos: a) animales con títulos IHA
En 1990 se estudió la respuesta serológica frente a una vacuna antiinfluenza equina bivalente, comercial (CabolanR del Laboratorio Veterquímica, Santiago, Chile) que contiene las dos cepas chilenas del virus influenza equino, inactivadas con formalina y adsorbidas en hidróxido de aluminio. Con este fin se vacunaron 10 equinos Fina Sangre Ingleses y 10 mestizos, de edad entre 3 y 20 años, en buen estado y estabulados en el Haras Nacional. Estos animales no tenían antecedentes de vacunación previa, aunque estuvieron expuestos al virus A/equi/2 Santiago, Chile/85 (H8 N8), incluso los mayores de 10 años al virus A/equi/1/Santiago, Chile/77 (H7 N7). Como testigos se utilizaron 6 caballos de 5 a 14 años, los que no fueron vacunados. La experiencia duró 28 meses (Keller y col., 1990).
La vacuna se aplicó en cuatro dosis de 1 ml por vía intramuscular, de acuerdo al programa recomendado por Mayr y col. (1984) para caballares adultos, que consiste en: primera vacunación a cualquier edad y en yeguas en todas las fases de gestación; segunda vacunación a las 8 semanas después de la primera; tercera vacunación a los 6 meses después de las segunda, y una dosis de refuerzo cada 9 meses. Los resultados se entregan en el cuadro 1. Al comparar los títulos IHA iniciales (día cero) entre los animales testigos y los vacunados, no se encontró diferencias significativas (P > 0,05). En la comparación de los títulos IHA iniciales y de los equinos controles, con los obtenidos 14 días después de cada una de las vacunaciones, se encontraron diferencias significativas (P
CUADRO 1 TÍTULOS DE ANTICUERPOS INHIBIDORES DE LA HEMOAGLUTINACIÓN EN 20 EQUINOS VACUNADOS CON VACUNA ANTIINFLUENZA EQUINA (CABOLAN)
| - | Subtipo | (Tiempo en semanas después de la vacunación) | ||||||||
| 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 26 | 35 | 39 | ||
| I Vacuna | A/equi/1 | 14* | 149 | 70 | 37 | 32 | - | - | - | - |
| A/equi/2 | 19 | 197 | 113 | 53 | 92 | - | - | - | - | |
| II Vacuna | A/equi/l | 32 | 160 | - | 149 | - | 70 | 75 | 30 | - |
| A/equi/2 | 92 | 184 | - | 130 | - | 92 | 61 | 28 | - | |
| III Vacuna | A/equi/1 | 30 | 143 | 149 | 171 | 149 | 121 | - | - | 92 |
| A/equi/2 | 28 | 184 | 106 | 106 | 130 | 121 | - | - | 75 | |
| IV Vacuna | A/equi/1 | 92 | 422 | - | 320 | - | 299 | 149 | - | 243 |
| A/equi/2 | 75 | 211 | - | 139 | - | 113 | 92 | - | 121 | |
| * Títulos medios geométricos (Keller y col. 1990). | ||||||||||
Otros estudios
En 1979, Palacios y Rabajille realizaron un estudio para conocer la respuesta hemática posterior a una vacunación contra la influenza equina, en 29 equinos Fina Sangre de Carrera entre 2 y 2,5 años de edad, en buen estado de salud y en período de entrenamiento normal. En cada animal se tomaron muestras con y sin anticoagulante, a los 0, 7, 15 y 30 días postvacunación. Como controles se utilizaron las muestras prevacunación y los títulos inhibidores de la hemoaglutinación. En cada muestra de sangre se determinó el volumen globular aglomerado, cuenta total y diferencial de leucocitos y relación neutrófilolinfocito; además de un estudio morfológico linfocitario en base a la clasificación de Grundmann y la titulación de anticuerpos IHA (Palacios, 1979). En las muestras sanguíneas también se determinaron proteína sérica total (Biuret) y sus fracciones mediante electroforesis en papel, inmunoglobulinas totales (turbidez con sulfato de zinc) y fibrinógeno plasmático por medio de precipitación por calor.
Los resultados obtenidos indican una disminución significativa del VGA, leucocitos totales y neutrófilos segmentados en el día 7 postvacunación, los que luego retornan a valores cercanos a los del día inicial. A los 30 días se apreció un alza significativa de los linfocitos y una disminución significativa en la relación N:L. No se encontró una variación significativa de neutrófilos baciliformes, monocitos, eosinófilos y basófilos a través del tiempo.En el estudio morfológico de los linfocitos, se observó un aumento significativo de los linfocitos foliculares, alcanzando su mayor valor el día 15; y un descenso significativo de los linfocitos sinuoidales al mismo tiempo (Palacios, 1979). Además, se observó una disminución significativa de la relación albúmina/globulina a los 7 días postinmunización, con disminución de la fracción albúmina y aumento de la fracción gammaglobulina. La concentración de inmunoglobulinas totales experimentó un aumento significativo en el día 30, mientras que los títulos de anticuerpos IHA alcanzaron sus valores más altos el día 15. El fibrinógeno plasmático no sufrió variación (Rabajille, 1979).
En 1983, Smith investigó la presencia de anticuerpos contra el virus parainfluenza tipo 3, virus influenza equina (subtipo H7 N7) y virus herpes equino tipo 1 de la rinoneumonitis equina, en 305 muestras de suero de equinos Fina Sangre de Carrera del Hipódromo Chile, separados en dos grupos, uno constituido por 205 muestras al azar y el otro por 50 muestras pareadas provenientes de equinos que habían presentado problemas respiratorios. Se evidenció un 15,2% de positividad contra el virus influenza equino, con títulos IHA entre 2 y 32, determinándose que sólo un 4,87% de los animales poseía títulos protectivos. No se observó seroconversión en las muestras pareadas. La inmunidad de masa frente al virus influenza equino (H7 N7) se consideró insuficiente y por lo tanto los equinos de este hipódromo estarían susceptibles a sufrir afecciones respiratorias causadas por el subtipo H7 N7, y por los virus PI-3 y VHE-1 contra los cuales no se detectaron anticuerpos específicos (Smith y col., 1986).
En 1984, Moreira realizó un estudio serológico en 200 sueros de pequeños rumiantes del Zoológico Nacional del Parque Metropolitano de Santiago, muestreándose 19 cabras Anglo-Nubian (Capra Hircus), 32 ciervos dama blanco (Dama dama var. albina), 10 ciervos dama negro (Dama dama var. melánica), 25 llamas (Lama glama), 30 muflones corso (Ovis musimon), 30 ovejas karakul (Ovis aries) y 54 ovejas somalí (Ovis aries steatopigas). Los sueros se estudiaron con la prueba de IHA frente a los virus influenza equina A/equi/1/Santiago, Chile/77 (H7 N7), virus influenza humana A/Santiago/725/81 (H3 N2) y A/Santiago/743/83 (H1 N1) y a los virus parainfluenza 3 (cepas bovina y humana). Solamente se evidenciaron sueros positivos frente a la cepa H3 N2 en 17 ovejas somalí, dos muflones corso y dos ovejas karakul. Además se encontraron anticuerpos específicos contra la cepa H1 N1 en dos llamas. Concluyéndose que estos animales no han sido infectados por los virus PI-3 y virus influenza equina (H7 N7) durante el período de muestreo y los 12 meses previos, mientras que el virus influenza humana (H3 N2 y H1 N1) han estado presentes en algunos pequeños rumiantes.
En el laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile se ha podido constatar, en el trabajo rutinario de diagnóstico serológico, que las cepas chilenas A/equi/1 y A/equi/2 tienen un comportamiento diferente biológico en el embrión de pollo manifestado por: muerte del embrión (postinoculación en caso alantoideo) entre las 36 y 48 horas postinoculación, en el caso de la cepa A/equi/1/Santiago/77; con respecto a la cepa A/equi/2/Santiago/85 la patogenicidad para el embrión es menor, ya que la muerte embrionaria ocurre después de las 76 horas de la inoculación, encontrándose ambriones sobrevivientes aún hasta el sexto día postinoculación. Ambas cepas con 25 pasajes previos en saco alantoideo de huevos embrionados. En cultivos celulares MA-104 se detecta multiplicación viral, apareciendo antígenos virales a las 4 horas postinoculación, haciéndose máximo a las 8 horas, en ambas cepas. En el caso de la cepa A/equi/2/Santiago/ 1985 este efecto se mantiene en las células, al menos por 72 horas, aunque sin efecto citopático de lisis. La cepa aislada recientemente A/equi/2/Quillota/92 en su sexto pasaje no mata al embrión hasta después del quinto día de inoculados (Celedón, M. Comunicación personal).
Conclusiones
Se concluye que la influenza equina es una enfermedad viral que se ha presentado, sin lugar a dudas, en Chile y el continente americano desde 1963 hasta nuestros días. Esta enfermedad ha provocado sufrimiento en los animales afectados, preocupación y dedicación de profesionales y personal relacionados con la hípica; dedicación en tiempo y recursos económicos en investigación para conocer y resolver la situación sanitaria planteada, y lo que es más importante, graves pérdidas económicas, aunque no bien cuantificadas, en la hípica nacional y extranjera.
Los graves brotes de influenza equina detectados en Chile, en 1963, 1977 y 1985, han sido coincidentes con grandes ondas epizoóticas de carácter continental, lo que implica la transmisión del virus a través de animales en fase de eliminación del virus, lo que podría haberse evitado con una adecuada vigilancia epidemiológica y estrictas medidas de cuarentena.
Con respecto a las vacunas inactivadas contra la influenza equina, son muchas las evidencias que respaldan su eficiencia. En Chile, en 1977, prácticamente no se vacunaba contra esta enfermedad; sin embargo, existen antecedentes que permiten aseverar la utilidad de una rápida vacunación al conocerse la existencia de la influenza equina en Argentina u otros países del continente, obviamente siempre y cuando los subtipos antigénicos del virus influenza equina correspondan con los de las vacunas aplicadas. En el brote de 1985 se pudo constatar que todavía no existía una clara conciencia sobre la utilidad de vacunar al menos una vez al año. Sin embargo, pareciera ser que en este brote, los animales vacunados presentaron una enfermedad más suave que la observada en el brote de 1977, al menos en Chile; por otra parte, en los animales vacunados ocasionalmente, la enfermedad se presentó, aunque con características diferentes a la del brote de 1977, probablemente debido a posibles variaciones antigénicas del virus actuante H3 N8.
Las características epidemiológicas del brote de 1992, aún no bien determinadas, permiten, sin embargo, concluir que los programas de vacunaciones, realizados en forma sistemática, y acompañados de un estudio serológico de los niveles de anticuerpos específicos contra el virus de la influenza equina en sus dos subtipos, son efectivos para prevenir la enfermedad en forma sustancial; éste ha sido el caso del Hipódromo Chile, donde se ha vacunado en forma regular en base a un programa que contempla las sugerencias internacionales, las condiciones locales y el estado inmunitario de los animales (M. Miranda, Comunicación personal).
Como colofón de esta revisión sobre la situación de la influenza equina en Chile, entre 1963 y 1992, se recomienda estudiar la respuesta postvacunal a nivel de inmunidad humoral local (IgA secretoria), analizar los posibles cambios antigénicos del virus mediante técnicas modernas y la contingencia de la transmisión de infecciones con estos virus entre el hombre y los equinos.
Agradecimientos
Es de implícita justicia, agradecer la dedicación y eficiencia de aquellos alumnos de tesis que participaron en gran parte de los estudios nacionales realizados sobre influenza equina. A todos ellos nuestro profundo reconocimiento.
En particular, agradecemos al Sr. Rodrigo A. Guerrero V., alumno del V semestre de la Escuela de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, por sus brillantes adaptaciones del virus influenza y proyecciones de superficie.
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EXCELENTE INFORMACIÓN, RECORDÉ SUS AMENAS CLASES EN CHILLAN.
ResponderEliminarEDGAR BELTRAN P.