virusberriostechegaray: ARTERITIS VIRAL EQUINA OIE 2013

ARTERITIS VIRAL EQUINA

Versión adoptada en la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE en mayo de 2013

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2013

C A P Í T U L O 2 . 5 . 1 0 .

RESUMEN

La arteritis viral equina (AVE) es una enfermedad vírica y contagiosa de los équidos causada por el

virus de la arteritis equina (VAE), un virus con ARN clasificado en el género Arterivirus, de la la

familia Arteriviridae. El virus de la arteritis equina se encuentra en poblaciones de caballos de

muchos países de todo el mundo. Aunque en el pasado se describían muy raramente, los brotes

confirmados de AVE parecen en aumento.

Descripción de la enfermedad: La mayoría de las infecciones contraídas de forma natural por el

VAE son subclínicas. Cuando aparecen, los signos clínicos de la AVE varían en extensión y

gravedad. La enfermedad se caracteriza principalmente por fiebre, depresión, anorexia, edema

distal, en especial en las patas y en el escroto y prepucio de los sementales, conjuntivitis, una

reacción cutánea de tipo urticario, abortos, y, en raras ocasiones, neumonía fulminante y enteritis o

neumoenteritis en potros jóvenes. Excepto por la mortalidad en potros jóvenes, la frecuencia de

casos con mortalidad en los brotes de AVE es muy baja. Por lo general, los caballos afectados se

recuperan por completo desde el punto de vista clínico. En un porcentaje variable de sementales

infectados se establece un estado de portador crónico, pero no en yeguas, caballos castrados ni

potros sexualmente inmaduros.

Identificación del agente: Clínicamente la AVE no puede diferenciarse de otras enfermedades

equinas de tipo respiratorio y sistémico. El diagnóstico de la infección por el VAE se basa en

pruebas de laboratorio y en el aislamiento del virus, la detección del antígeno vírico o su ácido

nucleico, o en la demostración de una respuesta de anticuerpos específicos. En los casos en que

se sospeche de la enfermedad, puede intentarse la detección e identificación del ácido nucleico del

VAE empleando distintas pruebas de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción

inversa (RT-PCR). La identidad de las cepas del VAE debe confirmarse mediante RT-PCR,

pruebas de neutralización, o por métodos inmunocitoquímicos, fundamentalmente por

inmunofluorescencia indirecta o por técnicas de avidina–biotina–peroxidasa.

Cuando la mortalidad se asocia a un brote sospechoso de AVE, debe comprobarse en una amplia

variedad de tejidos si presentan signos histológicos de panvasculitis, que es especialmente notable

en las arterias pequeñas de todo el cuerpo. Las lesiones vasculares características que se

presentan en el animal maduro no son una propiedad destacable en los abortos relacionados con

la AVE, cuyo diagnóstico se basa en el aislamiento del virus, la detección del ácido nucleico

mediante RT-PCR o poniendo de manifiesto antígenos del VAE mediante examen

inmunohistoquímico de distintos tejidos fetales y de la placenta.

Pruebas serológicas: Para la detección de anticuerpos contra el VAE se han utilizado varias

pruebas serológicas, como la neutralización vírica (NV), la fijación del complemento (FC), la

inmunofluorescencia indirecta, la inmunodifusión en gel de agar, el enzimoinmunoanálisis (ELISA),

y el inmunoanálisis de microesferas fluorescentes (MIA). Las pruebas actualmente más utilizadas

son la prueba de la NV potenciada con complemento y la técnica ELISA. La prueba de la NV es

muy sensible y específica y de probado valor en el diagnóstico de la infección aguda y en estudios

de seroprevalencia. Se han desarrollado varios métodos de ELISA, y aunque ninguno de ellos ha

sido validado tan ampliamente como la prueba de la NV, algunos parecen mostrar una

especificidad comparable y una sensibilidad casi equivalente. La prueba de la FC es menos

sensible que cualquiera la NV y que el ELISA, pero puede utilizarse para diagnosticar una infección

reciente.

Requisitos para las vacunas: Actualmente se dispone de dos vacunas comerciales contra la AVE

derivadas de cultivo de tejidos. Una es una vacuna con virus vivo modificado (MLV) que se prepara

a partir de un virus que se ha atenuado para los caballos mediante múltiples pases seriados en

cultivos primarios de células renales de caballo y de conejo y en una línea de células dérmicas

equinas. Se ha confirmado que es segura y protectora para caballos sementales y yeguas no

preñadas. No se recomienda la vacunación de potros menores de 6 semanas de edad y de yeguas

gestantes en los dos últimos meses de gestación. No existe evidencia de reversión del virus

vacunal a virulento ni de recombinación con cepas naturales del VAE después de su utilización en

el campo. La segunda vacuna es un producto inactivado y con adyuvante que se prepara con virus

obtenido de cultivo celular equino que puede usarse tanto en caballos reproductores como en no

reproductores. A falta de datos apropiados sobre seguridad, no se recomienda en la actualidad el

uso de la vacuna en yeguas gestantes.

A. INTRODUCCIÓN

Definición de la enfermedad y la etiología: La arteritis viral equina (AVE) es una enfermedad vírica contagiosa

de los équidos causada por el virus de la arteritis equina (VAE), un virus con ARN monocatenario y con polaridad

de mensajero, que es el miembro prototipo del género Arterivirus, de la familia Arteriviridae, orden Nidovirales

(Cavanagh, 1997). Hasta ahora solo se ha aislado un serotipo principal del virus. Algunas de las denominaciones

descriptivas que se usaron en el pasado para referirse a una enfermedad clínicamente muy semejante a la AVE

son linfangitis epizoótica de ojo rosado, fiebre tifoide y “rotlaufseuche”. El espectro de hospedadores naturales

del VAE parece restringido a los équidos, aunque existe alguna evidencia muy escasa de que también puede

incluir los camélidos del nuevo mundo, como las alpacas y las llamas (Weber et al., 2006). Este virus no

constituye un riesgo sanitario para los humanos (Timoney & McCollum, 1993).

Descripción de la enfermedad: Aunque la mayoría de los casos de infección aguda por el VAE son subclínicos,

algunas cepas del virus originan enfermedad con una gravedad variable (Timoney & McCollum, 1993). Los casos

típicos de AVE se pueden presentar combinados con todos los siguientes signos o cualquier combinación de los

mismos: fiebre, depresión, anorexia, leucopenia, edema distal, especialmente en las patas, escroto y prepucio de

los sementales, conjuntivitis, secreción oculares, edema supra y periorbital, rinitis, secreción nasal, reacción

cutánea local o generalizada de tipo urticario, un periodo de subfertilidad temporal en sementales afectados de

forma aguda, aborto, mortinatos y, raramente, neumonía, enteritis o neumo-enteritis fulminante en potros

jóvenes. Independientemente de la gravedad de los signos clínicos, los caballos afectados casi siempre se

recuperan por completo. La frecuencia de casos mortales en brotes de AVE es muy baja; en general, la

mortalidad solo se presenta en potros muy jóvenes, sobre todo en aquellos con infección congénita del virus

(Timoney & McCollum, 1993; Vaala et al., 1992) y muy raramente en caballos adultos que por lo demás, están

sanos.

Un porcentaje variable de sementales que resultan infectados de forma aguda más adelante se convierten en

portadores crónicos en el tracto reproductor y excretan el virus con el semen en cada eyaculación (Timoney &

McCollum, 1993). El estado de portador, que se ha observado que depende de los andrógenos, se ha hallado en

el semental pero no en la yegua, el caballo castrado ni el potro sexualmente inmaduro (Timoney & McCollum,

1993). Aunque la disminución temporal de la concentración de testosterona en la sangre empleando un

antagonista de la GnRH o mediante inmunización con GnRH parecería haber acelerado la resolución del estado

de portador en algunos sementales, todavía no se establecido del todo cuál es la eficacia de ninguna de las

estrategias de tratamiento. Se ha expresado preocupación por el hecho de que este tipo de enfoque terapéutico

pudiera utilizarse para enmascarar a propósito la existencia del estado de portador.

Las lesiones macroscópicas y microscópicas descritas en los casos mortales de AVE reflejan la extensa lesión

vascular que causa el virus (Del Piero, 2000). El VAE causa una vasculitis diseminada, principalmente de las

arteriolas y vénulas más pequeñas. Ello da lugar a edema, congestión y hemorragias, sobre todo en el tejido

subcutáneo de las extremidades y del abdomen, y un exceso de líquido peritoneal, pleural y pericárdico (Jones et

al., 1957). En casos mortales de AVE de potros jóvenes se ha descrito edema pulmonar, enfisema y neumonía

intersticial, enteritis e infartos esplénicos (Del Piero, 2000). No suele haber lesiones macroscópicas en los casos

de aborto, y en cuanto a las alteraciones microscópicas, si las hay, suelen observarse en la placenta, el hígado,

el bazo y los pulmones del feto.

Los factores que se consideran importantes en la epidemiología de la AVE son la variación fenotípica entre

cepas víricas, los mecanismos de transmisión durante las fases aguda y crónica de la infección, el estado de

portador del semental, la naturaleza y duración de la inmunidad adquirida y las tendencias cambiantes en la

industria equina. El VAE infecta a poblaciones de caballos de muchos países de todo el mundo (Timoney &

McCollum, 1993). Ha habido un aumento de la incidencia de la AVE en los últimos años que se ha relacionado

con el aumento de la frecuencia de desplazamientos de caballos y con el empleo de semen que ha sido

transportado (Balasuriya et al., 1998). La transmisión del VAE puede tener lugar por vía respiratoria, venérea o

congénita. La transmisión por vía respiratoria es más importante durante la fase aguda de la infección. El VAE

también se puede transmitir por vía venérea desde el semental infectado de forma aguda a la yegua o al

contrario, y por parte del semental portador.

El objetivo de los programas actuales de control de la AVE son prevenir la diseminación del VAE en poblaciones

de reproductores, con el fin de minimizar el riesgo de brotes de abortos y de muertes en potros jóvenes, así

como para establecer el estado de portador en potros y sementales (Timoney & McCollum, 1993). Estos

programas se basan en unas prácticas de manejo adecuadas y un programa de vacunación contra la

enfermedad dirigido de sementales reproductores y potros sexualmente inmaduros.

Diagnóstico diferencial: La AVE no puede diferenciarse clínicamente de muchas otras enfermedades equinas

respiratorias y sistémicas, entre las cuales las más frecuentes son las infecciones por influenza equina,

herpesvirus equinos tipo 1 y tipo 4, la infección por los virus de la rinitis equina A y B, y las infecciones por

adenovirus y estreptococos equinos, especialmente la púrpura hemorrágica. Esta enfermedad también tiene

similitudes clínicas con la anemia infecciosa equina, la infección por el virus de la encefalosis equina, la peste

equina africana, casos de infección por el virus Hendra, la infección por el virus Getah y la toxicosis causada por

la planta Berteroa incana (Timoney & McCollum, 1993).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO

Tabla 1. Pruebas de las que se dispone y sus finalidades

Método

Finalidad Determinar la ausencia de infección en la población Determinar la ausencia de infección en animales determinados

Determinar la eficiencia de las políticas de eliminación

Confirmar casos clínicos

Determinar la prevalencia de la infección –vigilancia

Determinar el estado inmunitario en animales determinados o en poblaciones postvacunación

Aislamiento del virus – +++ – +++ – –

Inmunodifusión en gel de agar – – – – – –

Fijación del complemento – – – +++ – –

Enzimoinmunoanálisis + ++ + ++ +++ +

Reacción en cadena de la polimerasa – +++ – +++ – –

Neutralización del virus + +++ + +++ +++ +++

Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el coste, la fiabilidad u otros factores limitan mucho su aplicación; – = no adecuado para esta finalidad. Aunque no todas las pruebas clasificadas como +++ o ++ han sido estandarizadas y validadas formalmente, su perfil sistemático y el hecho de que se hayan utilizado mucho sin resultados dudosos, las hace aceptables.

La detección e identificación del VAE a partir de muestras clínicas y de tejidos adecuados puede lograrse

mediante el aislamiento del virus en cultivo celular y con la detección del ácido nucleico del virus empleando

varios tipos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Ambos enfoques

diagnósticos son adecuados para confirmar casos clínicos de AVE así como para establecer la ausencia de

infección por el VAE en animales determinados. En este segundo contexto, se ha utilizado el aislamiento del

virus y RT-PCR en estudios de vigilancia y en el proceso destinado a que pueda tener lugar el desplazamiento

de animales. La detección de antígeno mediante el uso de distintas técnicas de inmunomarcaje también tiene

aplicación diagnóstica cuando se examinan tejidos procedentes de casos sospechosos de aborto, muerte en

potros jóvenes o caballos de más edad como consecuencia de la AVE.

El aislamiento del VAE puede intentarse en pocas líneas celulares, entre las cuales, la línea de células renales

de conejo RK-13 (ATCC CCL37 o RK13-KY1) han mostrado ser óptimas, especialmente cuando se analiza

semen de semental. En varios estudios comparativos exhaustivos se ha observado que el aislamiento del virus

tiene una sensibilidad equivalente a la RT-PCR para la detección del VAE en muestras tanto del animal enfermo

como tomadas post-mortem. Aunque muchos aislamientos del virus se llevan a cabo en pase inicial en cultivo

celular, el aislamiento vírico no es una prueba de diagnóstico rápida, contrariamente a lo que puede decirse de

las RT-PCR, que permiten obtener resultados el mismo día.

Para la detección del VAE se ha desarrollado una gran variedad de RT-PCR (de un solo paso, anidada y de

tiempo real). Lamentablemente, en muy pocas se han validado la sensibilidad y la especificidad de forma

adecuada, ni se han comparado estos parámetros con las que ofrece el aislamiento del virus. Es importante

destacar que la elección de kits de reactivos tanto para ácido nucleico como para la extracción y amplificación en

la prueba de la RT-PCR en tiempo real puede influir de forma importante en la sensibilidad y robustez

diagnósticas generales de la prueba (Miszczak et al., 2011).

La prueba de la inmunohistoquímica para el antígeno del VAE en cortes de tejido congelados o fijados se realiza

mejor empleando un suero policlonal monoespecífico contra el virus o un anticuerpo monoclonal (MAb) dirigido

contra la proteína vírica de la nucleocápsida (N) altamente conservada.

De las pruebas serológicas evaluadas para la detección de anticuerpos contra el VAE, se ha comprobado que la

neutralización del virus (NV) potenciada por el complemento es la más fiable para el diagnóstico de la infección

aguda por el VAE y para estudios de serovigilancia. De entre las numerosas pruebas de enzimoinmunoanálisis

(ELISA) que se han desarrollado, solo unas pocas ofrecen una sensibilidad y una especificidad comparables,

aunque no idénticas, a las de la NV. Una ventaja del ELISA específico del VAE es que permite obtener el

resultado el mismo día, mientras que la NV requiere 72 horas. Ninguna de las pruebas de las que se dispone

permite diferenciar de manera fiable los títulos de anticuerpos debidos a una infección natural de los debidos a la

vacunación.

1. Identificación del agente

a) Cultivo in vitro

Cuando se sospecha la aparición de un brote de AVE o cuando se intenta confirmar un caso de una

infección subclínica por el VAE, debe intentarse aislar el virus de hisopos nasofaríngeos o nasales

profundos, de hisopos conjuntivales, muestras de sangre no coagulada, y semen de los sementales que

sean posibles portadores del virus (Timoney & McCollum, 1993). Para aumentar la probabilidad de aislar el

virus durante un brote, se deben obtener muestras representativas lo antes posible después de la aparición

de la fiebre en los caballos afectados. Al intentar el aislamiento del virus a partir de células mononucleares

periféricas (PBMC), la sangre debe recogerse con el anticoagulante citrato o ácido etilendiaminotetracético

(EDTA). Dado que la heparina puede inhibir el crecimiento del VAE en células de riñón de conejo (línea

celular RK-13), su empleo como anticoagulante está contraindicado ya que puede interferir con el

aislamiento del virus a partir de sangre completa. Cuando en casos de mortalidad de potros o animales

mayores se sospeche que se trata de la AVE, se puede intentar el aislamiento del VAE de varios órganos,

especialmente de las glándulas linfáticas asociadas al tracto alimentario y órganos relacionados, y también

de los pulmones, el hígado y el bazo (McCollum et al., 1971). En brotes de aborto relacionados con la AVE

y/o en los casos de potros mortinatos los líquidos placentarios y fetales, así como gran variedad de tejidos

fetales (especialmente los de pulmón), placentarios y linforeticulares pueden ser una fuente productiva de

virus (Timoney & McCollum, 1993).

Los hisopos tomados para el aislamiento deben introducirse en un medio adecuado de transporte y, junto

con líquidos o tejidos recogidos para el aislamiento del virus y/o para pruebas por la reacción en cadena de

la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), deben enviarse al laboratorio refrigerados o congelados

en un contenedor con aislamiento; lo ideal es realizar este envío en un plazo máximo de 24 horas. si los

hisopos van destinados al examen directo mediante RT-PCR, el palito del hisopo no debe ser de madera,

porque podría contener sustancias, como conservantes, que podrían interferir con la PCR. Las muestras de

sangre no coagulada deben transportarse refrigeradas pero no congeladas. Cuando sea posible, las

muestras se enviarán a un laboratorio de probada competencia en pruebas relacionadas con esta infección.

Los hisopos nasofaríngeos en medio de transporte se procesan transfiriéndolos al recipiente cilíndrico de

una jeringa de 10 ml, se inserta el émbolo de la jeringa y todo el líquido que pueda extraerse se recoge en

un tubo estéril. Se pasa una alícuota del líquido por un prefiltro y a continuación se filtra por un filtro de

1 Disponible en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Arteritis viral equina, en EE.UU (para los datos de contacto, consúltese la página web de la OIE: http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference-laboratories/list-oflaboratories

membrana de 0,45 μm para jeringa, y se recoge de forma aséptica para inocularla posteriormente en un cultivo celular. Pueden recolectarse capas leucocitarias a partir de sangre no coagulada centrifugando a 600 g durante

15 minutos, y la capa leucocitaria extraída después del plasma se retira cuidadosamente. A continuación,

se extiende en forma de capa sobre una solución separadora de PBMC, Ficoll 1.077, y se centrifuga a

400 g durante 20 minutos. La interfase de PBMC (sin la mayor parte de los granulocitos) se lava dos veces

con solución salina tamponada con fosfato (300 g durante 10 minutos) y se vuelve a suspender en 1 ml de

medio mínimo esencial de Eagle (MEM) que contenga FCS al 2%. Se añade un volumen de 0,5 ml de la

suspensión celular lavada a monocapas de células RK-13 en frascos de 25 cm2 o placas multipocillo a las

cuales se añade medio de mantenimiento.

Aunque se ha descrito que no siempre se logra en casos naturales de infección por VAE (Timoney &

McCollum, 1993), el aislamiento del virus se debe intentar a partir de muestras clínicas o de tejidos

obtenidos durante la necropsia utilizando cultivos celulares de riñón de conejo, caballo o mono (Timoney et

al., 2004; Timoney & McCollum, 1993). Se pueden usar líneas celulares seleccionadas como RK-13 (ATCC

CCL-37), LLC-MK2 (ATCC CCL-7) y cultivos primarios de riñón de caballo o conejo, aunque el sistema de

elección son las células RK-13 (Timoney et al., 2004). Con el paso de los años, la experiencia nos ha

enseñado que los aislamientos primarios del VAE a partir de semen puede provocar más dificultades que

los procedentes de otras muestras clínicas o los de tejidos infectados, salvo que se utilice un sistema

adecuado de cultivo celular. El aislamiento primario del VAE en células RK-13 a partir del semen parece

influenciado por varios factores. Se obtienen aislamientos más frecuentes cuando se utilizan monocapas

confluentes de 3–5 días de edad, un inóculo grande en comparación con el área que presenta la superficie

celular en los frascos o placas multipocillo inoculados y, sobre todo, cuando se incorpora carboximetil

celulosa al medio (viscosidad del medio, 400–800 cps). Debe advertirse que la mayoría de las células RK-

13, incluyendo la ATCC CCL-37, están contaminadas con el virus de la diarrea vírica bovina, cuya

presencia parece aumentar la sensibilidad de este sistema celular para el aislamiento primario del VAE,

especialmente el obtenido de semen. En el caso de muestras de infectividad vírica baja, las tasas de

aislamiento del VAE pueden aumentar cuando se utilizan células RK-132 con una historia de elevado

número de pases (Timoney et al., 2004).

Se comprueba a diario si los cultivos inoculados presentan efecto citopático (ECP), que normalmente

aparece a los 2–6 días. En ausencia de ECP visible, los sobrenadantes de cultivo deben volver a inocularse

en monocapas celulares confluentes después de 4–7 días. Mientras que la inmensa mayoría de los

aislamientos del VAE se logran en el primer pase por cultivo celular, una pequeña parte de los mismos solo

se hace evidente en el segundo pase o en pases ulteriores in vitro (Timoney & McCollum, 1993). La

identidad de las cepas de VAE se puede confirmar por RT-PCT estándar o en tiempo real (Balasuriya et al.,

1998), en una prueba de neutralización unidireccional, o por un método inmunocitoquímico (Little et al.,

1995), por inmunofluorescencia indirecta (Crawford & Henson, 1973) o por la técnica de la avidina–biotina–

peroxidasa (ABC) (Little et al., 1995). Se ha utilizado un antisuero policlonal de conejo para identificar el

VAE en cultivos celulares infectados. También se han desarrollado anticuerpos monoclonales (MAb de

ratón contra la proteína de la nucleocápsida (N) y la glicoproteína principal de envoltura (GP5) del VAE, así

como un antisuero monoespecífico de conejo contra la proteína (M) de la envoltura no glicosilada

(Balasuriya et al., 1998), que permiten detectar varias cepas del virus en células RK-13 en un plazo de

apenas 12–24 tras la infección (Balasuriya et al., 1998; Little et al., 1995).

 Aislamiento del virus en el semen (Prueba prescrita para el comercio internacional)

Existen muchos indicios de que los sementales excretan constantemente a corto y largo plazo el VAE en el

semen, pero no en secreciones respiratorias ni en la orina; tampoco se ha puesto de manifiesto el virus en

la capa leucocitaria de la sangre (células mononucleares periféricas de la sangre) de dichos animales

(Timoney et al., 1987; Timoney & McCollum, 1993). La sangre de los sementales debe analizarse primero

mediante la NV, mediante un enzimoinmunoanálisis (ELISA) validado adecuadamente o mediante otros

procedimientos de pruebas serológicas. Se debe tratar de aislar el virus del semen de los sementales

seropositivos para anticuerpos anti VAE (por ejemplo, con un título de NV ≥1/4) que no tengan

antecedentes de vacunación contra la AVE, asegurándose también de que sean seronegativos (título de NV

<1 aislamiento="" caso="" de="" del="" el="" en="" inicial.="" la="" momento="" n="" recomienda="" se="" span="" tambi="" vacunaci="" virus="">

semen enviado, cuando no se dispone del estatus serológico ni del posible historial de vacunaciones del

semental donante. A ser posible, el aislamiento del virus a partir del semen debe intentarse con dos

muestras, que se pueden recoger el mismo día, en días consecutivos o a intervalos de días o semanas. No

hay indicios de que el resultado del aislamiento del virus de un semental particular esté influenciado por la

frecuencia del muestreo, el intervalo entre las tomas de muestras ni la época del año. El aislamiento del

VAE debe realizarse con preferencia en una porción del eyaculado completo recogido mediante una vagina

2 Dicha línea celular (RK-13) puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Arteritis viral equina, en

EE.UU (para los datos de contacto, consúltese la página web de la OIE: http://www.oie.int/en/our-scientificexpertise/

reference-laboratories/list-of-laboratories/). artificial o mediante un condón y un maniquí. Cuando no es posible obtener semen de este modo, un método alternativo menos deseable es tomar una muestra en el momento en que el semental se baja de la yegua tras el apareamiento. Se debe tener cuidado en no usar antisépticos ni desinfectantes en la limpieza de los genitales externos del semental antes de la recogida. Las muestras deben contener la fracción de la eyaculación rica en esperma con la que se asocia el VAE, ya que el virus no se presenta en la fracción preespermáticadel semen (Timoney et al., 1987; Timoney & McCollum, 1993). Inmediatamente después de la

recogida, el semen debe refrigerarse sobre hielo picado o bloques de congelador para trasladarlo al

laboratorio sin demora. Cuando se pueda producir alguna demora en la entrega del semen al laboratorio

para su análisis, se puede congelar a –20°C, o menos, durante un breve periodo de tiempo. No se ha

detectado que la congelación de las muestras disminuya el aislamiento del VAE del semen de un semental

portador. En situaciones en las que no sea factible determinar el estatus de portador del semental mediante

el aislamiento vírico o por RT-PCR, podrá comprobarse mediante su apareamiento con dos yeguas

seronegativas, en las cuales se comprobará si han seroconvertido frente al virus como muy tarde 28 días

después de la monta (Timoney & McCollum, 1993).

No es posible determinar de manera fiable si es portador un semental tratado con antagonista de la GnRH o

inmunizado con GnRH con el fin de modificar su actividad o comportamiento reproductor, ya que ello puede

interrumpir temporalmente la eliminación del VAE.

 Procedimiento analítico

i) Cuando las muestras de semen llegan al laboratorio, debe comprobarse si están congeladas,

refrigeradas o a temperatura ambiente. Debe examinarse cada muestra para asegurarse de que

contiene la fracción de la eyaculación rica en esperma. Algunos sementales pueden producir

volúmenes grandes de plasma seminal antes de eyacular las fracciones del semen espermática y en

gel. A menudo, esta fracción pre-espermática contiene muy poco esperma y puede ser negativa para

el VAE aunque el semental sea portador del VAE (Timoney et al., 1987). Para optimizar la detección

del virus, deben transferirse 50 μl de cada muestra de semen a un porta, que se cubrirá con un

cubreobjetos y se examinará al microscopio a 100x para determinar su contenido espermático. Los

eyaculados con una media inferior a cinco espermatozoides por cada diez campos examinados debe

considerarse que tienen un valor diagnóstico cuestionable. No obstante, vale la pena destacar que los

sementales que en ocasiones son oligospérmicos pueden ser positivos para el VAE incluso con un

recuento espermático bajo. Por otra parte, si dan un resultado negativo para el virus, en el informe

analítico de este tipo de semental deberá incluirse la observación de que no puede garantizarse la

ausencia del VAE en base al bajo recuento espermático de la muestra enviada. Además, las

muestras de eyaculado deben inspeccionarse visualmente, y debe registrarse su color y la posible

presencia de contaminación por partículas macroscópicas. Si el espécimen de semen está

contaminado con sangre, lo cual puede deberse a traumatismos en los genitales externos del

semental durante la recogida, deberá pedirse otra muestra, ya que el análisis de tales muestras de un

semental seropositivo puede comprometer la fiabilidad del resultado del aislamiento vírico debido a la

presencia de anticuerpos contra el VAE en el suero. De manera muy infrecuente, un eyaculado puede

tener un color amarillento debido a la contaminación por orina. Este tipo de muestras pueden ser

positivas para el virus de la rinitis equina tipo A.

ii) Aunque ya no se considere como un paso esencial, el pre-tratamiento del semen antes de su

inoculación en cultivo celular mediante sonicación a corto plazo (en tres ciclos de 15 segundos) facilita

el que la mezcla y la dispersión de la muestra sean eficaces.

iii) Después de eliminar el medio de cultivo se inoculan monocapas confluentes de células RK-13 de 3–

5 días, dispuestas en frascos de cultivo de tejidos de 25 cm2 o en placas multipocillo, con diluciones

decimales seriadas (10–1–10–3) del plasma seminal en un medio de mantenimiento para cultivo de

tejidos que contenga suero fetal bovino al 2% y antibióticos. Se utiliza un inóculo de 1 ml en frascos de

25 cm2 y se inoculan al menos dos frascos por cada dilución de plasma seminal. Cuando se utilizan

placas con pocillos múltiples, se prorratea el tamaño del inóculo y el número de pocillos inoculados por

dilución de la muestra. En cada prueba se deben incluir diluciones apropiadas de una muestra control

de semen positivo para el virus o de un virus utilizado como control de título conocido diluido en el

medio de cultivo.

iv) Los frascos se cierran, se vuelven a colocar las cubiertas sobre las placas multipocillo y se rotan

cuidadosamente para dispersar el inóculo cobre las monocapas celulares.

v) Los cultivos inoculados se incuban a continuación durante 1 hora a 37°C en un incubador aeróbico o

en un incubador con humedad y una atmósfera con un 5% de CO2, dependiendo de si se emplean

frascos o placas multipocillo.

vi) Sin extraer el inóculo ni lavar la monocapa celular, se recubre esta última con medio que contiene

carboximetil celulosa al 0,75% y antibióticos.

vii) Los frascos o las placas se incuban de nuevo a 37°C y se analizan microscópicamente para

comprobar si presentan ECP vírico, que por lo general se aprecia a los 2–6 días.

viii) En ausencia de ECP visible, pasados 5 a 7 días los sobrenadantes de cultivo se vuelven a inocular en

cultivos monocapas de células confluentes RK-13 de 3–5 días de edad. Después de eliminar el medio

con el que se cubren, las monocapas se tiñen con una solución de cristal violeta tamponada con

formalina al 0,1%.

La identidad de cualquier cepa vírica aislada debe confirmarse por RT-PCR estándar o en tiempo real

((Balasuriya et al., 1998; Gilbert et al., 1997; Balasuriya et al., 2002; Lu et al., 2007; Westcott et al., 2003;

Miszczak et al., 2011), por NV, inmunofluorescencia (Crawford & Henson, 1973), o por la técnica ABC,

utilizando un antisuero monoespecífico anti-VAE o MAb frente a las proteínas estructurales N o GP5 del

virus (Balasuriya et al., 1998; Del, se prueban diluciones Piero, 2000; Little et al., 1995).

En la prueba de neutralización unidireccional, diluciones decimales seriadas de la cepa vírica aislada se

exponen a un antisuero neutralizante con MAb o monoespecífico preparado contra la cepa Bucyrus que es

prototipo del VAE (ATCC VR 796) y también a un suero negativo para anticuerpos neutralizantes del virus.

Como controles de la prueba se realizan las titulaciones correspondientes al virus prototipo Bucyrus con los

mismos reactivos que contienen el anticuerpo de referencia. La prueba se realiza en frascos de 25 cm2 para

cultivo de tejidos o en placas multipocillo. Se inactivan durante 30 minutos cantidades apropiadas de

reactivos positivos y negativos a anticuerpos frente al VAE en un baño a 56°C y se diluyen 1/4 en solución

salina tamponada con fosfato, pH 7,2; a continuación, se distribuyen 0,3 ml del reactivo de anticuerpos

diluido en cinco tubos para cepa problema. Se realizan diluciones decimales seriadas (10–1–10–5) de cada

cepa vírica en MEM de Eagle que contenga suero fetal bovino al 10%, antibióticos y complemento de

cobaya recién diluido al 10%. Luego se añaden 0,3 ml de cada dilución de virus a los tubos que contienen

reactivos con y sin anticuerpos. Se agitan los tubos y la mezcla de virus y anticuerpos se incuba durante

1 hora a 37°C. Después, las mezclas se inoculan en cultivos confluentes en monocapa de células RK-13 de

3–5 días, en frascos de 25 cm2 o en placas multipocillo, utilizando dos frascos o pocillos por cada dilución

de virus. Cada frasco se inocula con 0,25 ml de la mezcla de virus y anticuerpos; cuando se utilizan placas

multipocillo se prorratea el tamaño del inóculo. Los frascos o placas inoculadas se incuban 2 horas a 37°C,

moviéndolas con cuidado cuando ha pasado la primera hora para dispersar el inóculo sobre la monocapa

celular. Sin extraer el inóculo ni lavar las monocapas celulares, estas se recubren con medio que contiene

carboximetil celulosa al 0,75% y se incuban 4–5 días a 37°C en una incubadora aerobia o en una

incubadora con humedad y una atmósfera con el 5% de CO2. Después de eliminar el medio, las monocapas

se tiñen con una solución de cristal violeta tamponada con formalina al 0,1%. Se cuentan las placas o

calvas producidas, y se determina el título de infectividad del virus tanto en presencia como en ausencia de

anticuerpos anti-VAE utilizando el método de Spearman–Kärber. La confirmación de la identidad de una

cepa se basa una reducción del recuento de placas de al menos 102 logs del virus en presencia del suero

positivo para anticuerpos contra la cepa Bucyrus del VAE.

La inmensa mayoría de las cepas de VAE de sementales portadores se logra aislar en el primer pase en

cultivo celular empleando el procedimiento analítico descrito (Timoney & McCollum, 1993). La existencia de

citotoxicidad no vírica o de contaminación bacteriana en las muestras no es un problema importante cuando

se trata de aislar este virus del semen de sementales. Si se observa citotoxicidad no vírica, normalmente

aparece en las monocapas inoculadas con la dilución 10–1 del plasma seminal y de manera mucho menos

frecuente, con la dilución 10–2. Para superar este problema se ha empleado con cierto éxito un tratamiento

del plasma seminal con polietilenglicol (peso molecular de 6000) (Fukunaga et al., 2000). El método descrito

implica añadir polietilenglicol a las diluciones 10–1–10–3 del plasma seminal hasta una concentración final

del 10% para cada dilución. Las mezclas se mantienen una noche a 4°C con movimiento suave y después

se centrifugan a 2.000 g durante 30 minutos, eliminándose el sobrenadante. Los precipitados se

resuspenden en el medio de mantenimiento de los cultivos a la décima parte del volumen de las diluciones

originales y las mezclas se homogenizan. A continuación, se centrifugan a 2.000 g durante 30 minutos y los

sobrenadantes se toman y se usan para inoculación. No hay evidencias que indiquen que el pretratamiento

del plasma seminal de este modo reduzca la sensibilidad del procedimiento para aislar el virus (Fukunaga et

al., 2000). Si la contaminación bacteriana de una muestra presenta algún problema, es preferible requerir la

repetición de la recogida del semen del mismo semental. Si eso no es posible, puede intentarse el control

de la contaminación mediante el pretratamiento de la muestra con un antibiótico que contenga medio de

transporte para el virus, conservándolo toda la noche a 4°C y realizando a continuación la ultracentrifugación

o resuspensión del precipitado antes de diluir e inocular el espécimen en cultivo celular.

Se ha documentado la imposibilidad de aislar el VAE a partir de sementales cuyo semen era positivo para

ácido nucleico del virus mediante según la RT-PCR. Al menos en un caso, la imposibilidad de detectar virus

infeccioso puede muy bien haberse debido a un nivel muy alto de actividad neutralizante en el plasma

seminal del semental, lo cual refuerza la utilidad de la RT-PCR como prueba complementaria al aislamiento

vírico para la detección del VAE.

b) Detección del antígeno

Cuando se asocia mortalidad a un brote sospechoso de AVE, debe examinarse una amplia variedad de

tejidos para comprobar si presentan signos histológicos de panvasculitis, que es especialmente destacada

en las arterias y vénulas pequeñas de todo el organismo, sobre todo en el ciego, el colon, el bazo,

glándulas linfáticas asociadas y la corteza suprarrenal (Crawford & Henson, 1973; Del Piero, 2000; Jones et

al., 1957). La presencia de una arteritis necrotizante diseminada que afecta a las células del endotelio y

mediales de los vasos afectados se considera un rasgo patognomónico de la AVE. Sin embargo, las

lesiones vasculares características presentes en el animal adulto no son un rasgo predominante en muchos

casos de aborto relacionado con el VAE.

El antígeno VAE puede identificarse en distintos tejidos de animales afectados por la AVE, tanto en

presencia como en ausencia de lesiones (Del Piero, 2000). Se han detectado antígenos en pulmón,

corazón, hígado y bazo, así como en placentas de fetos abortados (Del Piero, 2000). También se ha

estudiado el examen inmunohistoquímico de biopsias de piel como mecanismo de confirmación de la

infección aguda por el VAE. Aunque tiene cierta utilidad, no es del todo fiable para el diagnóstico de esta

enfermedad. El antígeno vírico se puede detectar en el citoplasma de células infectadas mediante

inmunofluorescencia empleando suero anti-VAE policlonal equino conjugado (Crawford & Henson, 1973), o

mediante la técnica ABC, empleando MAb de ratón contra las proteínas GP5 o N del virus (Del Piero, 2000).

c) Métodos moleculares

La RT-PCR estándar en dos pasos, la RT-PCR de un solo paso, la RT-PCR anidada y la RT-PCR en

tiempo real (rRT-PCR) son cada vez más aceptadas y utilizadas como alternativa o como prueba

complementaria al aislamiento vírico en cultivo celular para la detección del VAE en el material de

diagnóstico. Las pruebas basadas en la RT-PCR proporcionan un medio de indentificación del ARN

específico del virus en muestras clínicas; en concreto, filtrados de hisopos nasofaríngeos o nasales, capas

leucocitarias, semen fresco y extendido, orina, y muestras de tejido obtenidas post mórtem (Balasuriya et

al., 2002; Gilbert et al., 1997; Lu et al., 2007; Miszczak et al., 2011; Westcott et al., 2003). Se han elaborado

y evaluado la RT-PCR estándar, la RT-PCR anidada (RT-nPCR) y una rRT-PCR de TaqMan® en un solo

tubo para la detección de distintas cepas del virus en líquido de cultivo de tejidos, semen y secreciones

nasales (Balasuriya et al., 2002; Gilbert et al., 1997; Lu et al., 2007; Miszczak et al., 2011; Westcott et al.,

2003). Estas pruebas van dirigidas a seis marcos abiertos de lectura (ORF) diferentes en el genoma del

VAE (los ORF 1b, 3–7). Sin embargo, existe una variación considerable en la sensibilidad y especificidad de

las RT-PCR que incorporan diferentes pares de cebadores dirigidos a varios ORF. Se han obtenido

resultados comparables a los del aislamiento vírico con algunas –pero no con todas– la RT-PCR estándar

de un paso, la RT-PCR en dos pasos, la RT-nPCR o la rRT-PCR TaqMan® en un solo tubo (Balasuriya et

al., 2002; Gilbert et al., 1997; Lu et al., 2007; Miszczak et al., 2011). Si las comparamos con el tradicional

aislamiento vírico, estas pruebas basadas en la RT-PCR son frecuentemente más sensibles y

considerablemente más rápidas de realizar, pues la mayor parte requieren menos de 24 horas para su

realización. Además, las RT-PCR tienen la ventaja de no requerir virus viables para su realización. La rRTPCR

en un solo tubo para el VAE constituye un método simple, rápido y fiable para la detección e

identificación del ácido nucleico del virus en el semen y el líquido de cultivo de tejido equino (Balasuriya et

al., 2002; Lu et al., 2007; Miszczak et al., 2011). No obstante, existen indicios de que el tipo de kit comercial

utilizado para la extracción del ácido nucleico y también para la amplificación puede influir en gran medida

en la sensibilidad y robustez diagnósticas generales de la prueba (Miszczak et al., 2011). Esto se puso de

manifiesto empleando un método de extracción de ácido nucleico basado en perlas magnéticas, junto con

kits comerciales de RT-PCR específicos. La rRT-PCR en un solo tubo tiene las siguientes ventajas

importantes respecto a la RT-PCR estándar en dos pasos: 1) se elimina la posibilidad de la contaminación

cruzada entre muestras por productos previamente amplificados, puesto que el tubo que contiene la

muestra nunca se abre; y 2) disminuye la posibilidad de falsos positivos porque el producto de la rRT-PCR

se detecta con una sonda específica de secuencia. Sin embargo, debido a la gran sensibilidad de la RTPCR,

y en ausencia de precauciones adecuadas en el laboratorio, es posible la contaminación cruzada

entre las muestras, provocando de este modo falsos positivos. Por ejemplo, la RT-nPCR, a la vez que

proporciona una mayor sensibilidad para la detección del VAE, también aumenta la posibilidad de falsos

positivos (6). El riesgo de contaminación es mayor cuando se utiliza la prueba RT-nPCR porque el segundo

paso de amplificación por PCR incluye el producto de la primera RT-PCR. A fin de minimizar el riesgo de

contaminación cruzada, debe tenerse sumo cuidado, sobre todo durante los pasos de extracción de ARN y

la preparación de la reacción. Deben incluirse en cada prueba RT-PCR moldes positivos y negativos de

control y cuando resulte adecuado, ácido nucleico extraído del líquido de cultivo de tejido de células sanas.

Así pues, en la mayoría de circunstancias, la utilización de la RT-PCR de un paso o la rRT-PCR en tubo

único puede ayudar a evitar los problemas relativos a la contaminación cruzada.

La selección de los cebadores es crucial para la sensibilidad de la prueba RT-PCR, siendo preferible utilizar

los cebadores (y la sonda en el caso de la prueba rRT-PCR) diseñados preferentemente a partir de la

región más conservada del genoma o genomas del VAE. El análisis comparativo de las secuencias de

nucleótidos ha puesto de manifiesto que el ORF 1b (codifica la polimerasa vírica), el ORF 6 (Proteína M) y

7 (proteína N) están más conservados que el resto de los ORF entre las cepas del VAE analizadas hasta

ahora y procedentes de América del Norte y de Europa (Balasuriya et al., 2002; Lu et al., 2007; Miszczak et

al., 2011; Westcott et al., 2003). El gen más conservado entre las diferentes cepas del VAE es el ORF7, y

con los cebadores específicos para la ORF7 (así como la sonda para la rRT-PCR) se ha detectado una

variedad de cepas del virus de origen norteamericano y europeo (Balasuriya et al., 2002; Lu et al., 2007).

Es más, el uso de muchos pares de cebadores específicos de los ORF 1b ([directo: 5’-GAT-GTC-TAT-GCTCCA-

TCA-TT-3’ e inverso: 5’-GGC-GTA-GGC-TCC-AAT-TGA-A-3’]) y/o [directo: 5’-CCT-GAG-ACA-CTGAGT-

CGC-GT-3’ e inverso 5’-CCT-GAT-GCC-ACA-TGG-AAT-GA-3’]) (Gilbert et al., 1997), el ORF 6

([directo: 5’-CTG-AGG-TAT-GGG-AGC-CAT-AG-3’ e inverso: 5’-GCA-GCC-AAA-AGC-ACA-AAA-GC-3’])

(51) y el ORF 7 ([directo 5’-ATG-GCG-TCA-AGA-CGA-TCA-CG-3’ e inverso 5’-AGA-ATA-TCC-ACG-TCTTAC-

GGC-3’]) aumenta de forma significativa la posibilidad de detectar las cepas del VAE norteamericano y

europeo mediante la RT-PCR. Los dos pares de cebadores específicos del ORF 1b son adecuados para su

uso en una rRT-PCR (Gilbert et al., 1997). Si bien se ha encontrado que la RT-PCR es muy sensible para la

detección del ácido nucleico del virus en semen fresco, existen pruebas de que no es tan fiable cuando se

aplica con semen conservado mediante congelación o de muy baja infectividad vírica (Zhang et al., 2004).

Además de las citadas pruebas RT-PCR, se han descrito dos rRT-PCR TaqMan® en un solo tubo y

basadas en el uso de sondas fluorogénicas para la detección del ácido nucleico del VAE (Balasuriya et al.,

2002); cebadores ([directo: 5’-GGC-GAC-AGC-CTA-CAA-GCT-ACA-3’, inverso: 5’-CGG-CAT-CTG-CAGTGA-

GTG-A-3’] y sonda [5’FAM-TTG-CGG-ACC-CGC-ATC-TGA-CCA-A-TAMRA-3’] (Westcott et al., 2003);

cebadores [directo: 5’-GTA-CAC-CGC-AGT-TGG-TAA-CA-3’, inverso: 5’-ACT-TCA-ACA-TGA-CGC-CACAC-

3’] y sonda [5’FAM-TGG-TTC-ACT-CAC-TGC-AGA-TGC-CGG-TAMRA-3’]). No obstante, debe

advertirse que la variación genómica dentro de las cepas naturales del VAE puede disminuir la sensibilidad

de las pruebas RT-PCR y rRT-PCR, incluso en el caso de que los cebadores y las sondas se hayan

desarrollado a partir de la región más conservada del genoma del VAE (ORF 7 [Lu et al., 2007]). En

estudios filogenéticos de cepas del VAE de ciertas regiones/países se ha confirmado la existencia de

agrupaciones de cepas más estrechamente emparentadas entre ellas que con cepas víricas de puntos

geográficos muy alejados (Mankoc et al., 2007). En estas circunstancias, para la detección de estas cepas

del VAE genómicamente bien diferenciadas puede ser más adecuado utilizar cebadores validados que los

ya recomendados.

Al no existir un consenso generalizado respecto a un juego de cebadores universalmente admitido para la

detección del VAE, y puesto que no se puede determinar la infectividad real de una muestra con ninguna de

las pruebas RT-PCR, se aconseja el uso conjunto del aislamiento del virus junto con las pruebas RT-PCR o

rRT-PCR para identificarlo en muestras tomadas en animales enfermos o post mórtem, y cuando esté

indicado, para el análisis genómico o fenotípico de cepas víricas.

Se han clasificado cepas del VAE aisladas de diferentes regiones del mundo en grupos filogenéticos

mediante el análisis de secuencias de los genes de las proteínas de envoltura GP3, GP5 y M (los ORF 3,

5 y 6 respectivamente) y del gen de la proteína de la nucleocápsida (N) (ORF 7 [Balasuriya et al., 1998;

Zhang et al., 2010]). Se ha observado que el gen de la proteína GP5 es el más útil y fiable para ese

propósito (8, 54, 65). Las relaciones entre las cepas observadas mediante la secuenciación de nucleótidos

constituyen un instrumento molecular epidemiológico de utilidad para llegar al origen de brotes de AVE

(Balasuriya et al., 1998; Zhang et al., 2010).

2. Pruebas serológicas

Se ha estudiado la capacidad de varias pruebas serológicas de detectar anticuerpos contra el VAE, como la

neutralización (microneutralización [Senne et al., 1985], y reducción de placas o calvas ([McCollum, 1970]), la

prueba de la fijación del complemento (FC) (Fukunaga & McCollum, 1977), la inmunofluorescencia indirecta

(Crawford & Henson, 1973), la inmunodifusión en gel de agar (Crawford & Henson, 1973), el ELISA (Cho et al.,

2000; Hedges et al., 1998; Kondo et al., 1998; Nugent et al., 2000) y el inmunoanálisis de microesferas

fluorescentes (MIA (Go et al., 2008).

Es importante destacar que hasta ahora solo se ha reconocido un serotipo principal del VAE, representado por la

cepa prototipo Bucyrus (ATCC VR 796) (McCollum, 1970; Timoney & McCollum, 1993). Mediante protocolos

convencionales de inmunización se han preparado en caballos y en conejos antisueros anti-VAE no purificado.

Además, se han desarrollado en ratón anticuerpos monoclonales y en conejo anticuerpos monoespecíficos

contra la proteína de la nucleocápsida (N), la glicoproteína principal de la envoltura (GP5) y la proteína de la

envoltura no glicosilada (M) del VAE (Balasuriya et al., 1997).

Prueba de neutralización: La microneutralización potenciada con complemento es actualmente la prueba más

utilizada a nivel internacional para el diagnóstico de la infección por el VAE, para llevar a cabo estudios de

seroprevalencia y para analizar caballos y determinar si pueden ser desplazados. También se ha utilizado para

analizar sangre de corazón fetal como medio de diagnóstico retrospectivo de casos de abortos relacionados con

la AVE. Los anticuerpos neutralizantes contra el VAE persisten varios años tras la infección natural o la

vacunación con la vacuna viva modificada contra el VAE (Timoney & McCollum, 1993).

a) Prueba de la neutralización del virus (prueba prescrita para el comercio internacional)

La NV se utiliza para fines de diagnóstico para confirmar la infección en casos/brotes sospechosos de AVE

y para determinar en caballos, como por ejemplo sementales, si presentan infección por el VAE. El

procedimiento analítico de la NV de uso más difundido es el desarrollado por los Laboratorios del Servicio

Nacional Veterinario del Departamento de Agricultura de los EE. UU. (Senne et al., 1985). Es importante

obtener una muestra de sangre estéril para evitar que la contaminación bacteriana interfiera en el resultado

de la prueba. Se recomienda realizar la prueba en células RK-13 utilizando como virus de referencia la cepa

aprobada CVL-Bucyrus (Weybridge)3 (Edwards et al., 1999). La historia completa de pases de la cepa CVL

(Weybridge) no está documentada aunque deriva originalmente de la cepa Bucyrus prototipo del virus. Se

cutivan stocks del virus de referencia en la línea celular RK-13, se clarifican eliminando los detritos celulares

mediante centrifugación a velocidad baja y se guardan en alícuotas a -70 ºC. Se descongelan varias

alícuotas congeladas y se determina la infectividad del virus stock mediante titulación en células RK-13. La

sensibilidad de la prueba de la NV para detectar anticuerpos anti-VAE está muy influenciada por varios

factores, especialmente por el origen y la historia de pases de la cepa vírica utilizada (Edwards et al., 1999).

La cepa CVL-Bucyrus (Weybridge) y la cepa vacunal MLV muy atenuada del VAE son de sensibilidad

semejante para detectar sueros positivos de título bajo, especialmente en caballos vacunados contra AVE.

Se continúan realizando esfuerzos para lograr una mayor uniformidad en el protocolo de la prueba y los

resultados serológicos entre los laboratorios que utilizan la prueba NV u otras pruebas serológicas

comparables para esta infección. Se dispone de Sueros Estándar Aprobados por la OIE para el VAE4, que

pueden facilitar la estandarización, a nivel internacional, de la prueba de la microneutralización y del ELISA.

 Procedimiento analítico

i) Los sueros se inactivan mediante un baño de 30 minutos en agua a 56 °C (sueros control, solamente

una vez)

ii) En placas de microtitulación para cultivo celular con 96 pocillos de fondo plano, se realizan diluciones

a la mitad seriadas del suero problema inactivado (volúmenes de 25 μl) con medio de cultivo libre de

suero, comenzando con la dilución a 1/2 y utilizando filas duplicadas de pocillos para cada suero

problema. La mayoría de los sueros se analizan inicialmente a dilución 1/4 y 1/8 (dilución final del

suero, después de añadir a cada pocillo un volumen igual de la dilución apropiada del stock de virus).

Las muestras positivas a la dilución 1/8 se pueden volver a comprobar, si se desea, y titularse por

determinación por punto final. Deben incluirse en cada prueba controles individuales de suero, así

como controles negativos y positivos de título conocido alto y bajo.

iii) Se prepara una dilución del stock de virus que contenga de 100 a 300 DICT50 (dosis infectiva en el

50% del cultivo de tejidos) por 25 μl utilizando como diluyente medio de cultivo celular sin suero que

contenga antibióticos y complemento fresco de cobaya o de conejo a una concentración final del 10%.

iv) A cada pocillo con 25 μl de cada dilución de suero se añaden 25 μl de la dilución apropiada del stock

de virus, excepto en los pocillos de suero control respecto a la toxicidad y en los pocillos control

respecto a células de cada placa.

v) Se incluye una titulación por retroceso de la dilución de trabajo del stock de virus, utilizando cuatro

pocillos por cada dilución decimal, para confirmar la validez de los resultados de la prueba.

vi) Se cubren las placas y se agitan suavemente para facilitar la mezcla suero/virus.

vii) Las placas se incuban durante 1 hora a 37°C en una atmósfera húmeda enriquecida con un 0,5% de

CO2.

viii) Se prepara una suspensión de células RK-13 de cultivos de 3–5 días cuya concentración asegure la

formación de monocapas confluentes en los pocillos de las placas de microtitulación en un plazo

máximo de 18–24 horas tras la siembra.

ix) A cada pocillo se añaden 100 μl de la suspensión celular, se cubren las placas con sus tapas o se

sellan con cinta aislante y se agitan suavemente.

x) Se incuban las placas a 37°C en una atmósfera húmeda de 0,5% de CO2 en aire.

3 Puede obtenerse el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Arteritis viral equina, en el Reino Unido (para los datos

de contacto, consúltese la página web de la OIE http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference-laboratories/list-oflaboratories/).

4 Puede obtenerse el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Arteritis viral equina, en EE.UU., (para los datos de

contacto, consúltese la página web de la OIE: http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference-laboratories/list-oflaboratories/).la AVE. Los anticuerpos neutralizantes contra el VAE persisten varios años tras la infección natural o la