sábado, 30 de agosto de 2014

VIRUS 2014 Los virus como agentes inmunogénicos Patricio Berríos Etchegaray

Virus  2014

Patricio Berríos Etchegaray

Los virus como agentes inmunogénicos 

Al considerar a los virus como inmunógenos nos referiremos  específicamente a la inmunidad antiviral y a los antígenos virales.  Consecuentemente trataremos el diagnóstico viral serológico y la inmunoprofilaxis, mencionando los métodos serológicos de diagnóstico y las principales vacunas utilizados en  las enfermedades virales de los animales domésticos.

 Inmunidad antiviral

En la lenta pero persistente confrontación entre la selección viral y la emergencia de efectivos mecanismos defensivos en los hospederos, los virus alcanzarían un total éxito, en cuanto a adaptación se refiere,  cuando insertan sus genes en el genoma celular, transmitiéndose verticalmente a la progenie aunque sin producir alteraciones patológicas, tal sería el caso de los retrovirus de la leucosis aviar. Otros virus,  no tan bien adaptados, producen infecciones persistentes y recurrentes como es el caso del virus de la anemia infecciosa equina. En forma similar los virus herpes, como el virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina, establecen infecciones latentes que se reactivan en situaciones estresantes. En el otro extremo estarían los virus que producen infecciones agudas que pueden ser mortales para el hospedero, evidenciando una mala adaptación del virus.

Los mecanismos responsables de la inmunidad protectiva antiviral se clasifican en innatos y adaptativos. Estos mecanismos pueden ser inmune o no inmunes, específicos y no específicos.

Los mecanismos menos evolucionados son las defensas no inmunes que no son adquiridas porque que no dependen de un contacto previo entre el virus y el huésped susceptible, sino que están determinadas por factores genéticos y fisiológicos propios de una determinada especie o raza, edad, preñez o lactancia, estado de nutrición, o factores estresantes como el hacinamiento de los animales domésticos. Ejemplos: Ciertas razas de ovejas europeas son resistentes al virus de la lengua azul que es un orbivirus de la familia Reoviridae.  En cuanto a edad, se sabe que los animales muy jóvenes son más susceptibles a ciertas infecciones virales probablemente debido a la inmadurez de su sistema inmunológico, como es el caso de gatitos de semanas de edad que son muy susceptibles al retrovirus de la leucosis felina. Los neonatos felinos o caninos que presentan muchas células en división, a nivel digestivo o de miocardio, son muy sensibles a los parvovirus que causan la panleucopenia felina y la parvovirosis canina. Otros factores que condicionan una deficiente respuesta inmune se refieren a un mal estado nutricional, preñez o lactancia, y estrés causado por hacinamiento en el transporte o aglomeraciones en las crianzas; esta suerte de inmunosupresión es similar a la causada por el tratamiento con corticoides.

La inmunidad no específica  o innata se caracteriza por ser de amplio espectro o polivalente y de acción rápida. Estos factores de resistencia pueden ser periféricos o internos.

Las defensas inespecíficas periféricas se expresan en forma mecánica en la integridad de la piel y  mucosas, secreciones de mucus, y movimiento de los cilios  respiratorios que impiden la fijación de los virus a  receptores celulares del tracto respiratorio. Las defensas químicas inespecíficas se refieren a pH ácido intestinal, vaginal o del sudor. Las sales biliares también tienen una cierta actividad antiviral. Las defensas biológicas inespecíficas se refieren a la microflora bacteriana que actúa competitivamente con las bacterias patógenas.

Las defensas inespecíficas internas pueden ser humorales y celulares. Las humorales actúan a través del interferón y de inhibidores termoestables como mucoproteínas y b lipoproteínas, y de inhibidores termolábiles como el sistema del complemento. Las celulares actúan por intermedio de células fagocitarias, macrófagos y células “natural killer” (NK).

La inmunidad específica o adaptativa, de vital importancia en la lucha del organismo contra los virus, actúa mediante anticuerpos y linfocitos T citotóxicos.

Los mecanismos celulares antivirales están dirigidos hacia antígenos virales expresados tempranamente en la superficie de las células infectadas especialmente por virus envueltos, provocando la destrucción o lisis de la célula infectada.  Estos mecanismos son importantes en la resolución de la infección viral debido a que actúan antes que los viriones de progenie puedan ser liberados al medio extracelular.

La citolisis inmunológica de células infectadas por virus puede ser causada por cinco procesos: macrófagos en presencia de anticuerpos, células K y NK, citotoxicidad por linfocitos Tc y citotoxicidad celular mediada por anticuerpos y/o complemento.

Macrófagos. Los macrófagos del sistema retículoendotelial y los macrófagos alveolares reaccionan ante la infección viral sistémica, activándose y fagocitando a los virus que serán destruidos y eliminados. Los macrófagos alveolares  actúan sobre los virus respiratorios que afectan a animales sometidos a condiciones de hacinamiento. Algunos virus como el del distemper canino, son capaces de evadir la acción defensiva de los macrófagos, replicando en su interior, para posteriormente diseminarse en el organismo afectado.

Los macrófagos activados por interferón c, llamados fagocitos inmunes, pueden unirse a la célula blanco, a través de receptores para la porción Fc de los anticuerpos, y destruirla sin ingerirla. También pueden actuar sobre la célula mediante proteasas, lisozimas, arginasas y H2O2.

Células K.  Tienen receptores para el Fc de los anticuerpos, y a través de ellos se unen a la célula blanco infectada por virus.

Tanto los macrófagos como las células K juegan un papel importante en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) debido a que poseen receptores para el Fc del anticuerpo. Los anticuerpos confieren la especificidad a la reacción defensiva de citotoxicidad. La IgM no participa en la CCDA.

Células “natural killer” al igual que los macrófagos pueden ser activados por interferones. Su actividad es mayor durante los primeros días de la infección viral. Las células NK son capaces de destruir células tumorales y células infectadas por virus.

Complemento. El sistema del complemento se puede activar por complejos antígeno-anticuerpos, lo que conducirá a la destrucción de viriones y células infectadas por virus.

Interferón. La defensa inmune mediada por interferones es la más rápida frente a una infección viral. Los virus respiratorios inducen la pronta producción de grandes cantidades de interferones a y b luego de la infección intranasal, los que pueden durar hasta una semana y actuar bloqueando la replicación de otros virus respiratorios (rhinovirus).

La producción de interferones es fuertemente estimulada por virus con ARN de doble hebra como son lo reovirus. El virus actúa desreprimiendo un gen lo que hará que se produzca el interferón, el que va actuar indirectamente a través de una proteína que inhibe la replicación viral en forma inespecífica aunque especie (animal) específica. Además de la inhibición de la síntesis de ácido nucleico  y proteínas virales, el interferón puede actuar en etapas más precoces o tardías de la replicación viral, inhibiendo la penetración del virus a la célula, inhibiendo la descapsidación, inhibiendo la funcionalidad de las polimerasas virales e inhibiendo el ensamblaje y salida por gemación de retrovirus.

Interferencia viral. Es un estado de resistencia adquirido de resistencia celular antiviral, que es inducido por un virus denominado interferente. Además de la interferencia mediada por interferones se describen tres tipos de interferencia.

1. A nivel de adsorción del virus a la célula. En este nivel habría competencia por los receptores celulares entre virus homólogos. Ejemplos: entre virus Newcastle inactivado con LUV y virus no inactivado, en que los primeros pueden destruir a los receptores celulares con su neuroaminidasa; entre retrovirus que tienen receptores celulares comunes, como es el caso del virus de la leucosis aviar (ECP negativo) y el virus del sarcoma de Roux (ECP positivo). Un caso similar ocurre entre virus ECP negativo y virus ECP positivo del virus de la diarrea viral bovina. Este fenómeno de interferencia se ha aplicado al diagnóstico de la diarrea viral bovina.

2. Autointerferencia.  Se produce en un nivel intracelular, también por virus homólogos, en que uno de ellos es defectivo. En la estomatitis vesicular, causada por un rhabdovirus, los virus defectivos interfieren con la replicación de los viriones.

3. Interferencia heterológa o intrínsica. En este caso existe bloqueo de la transcripción viral por productos proteicos originados en la replicación del virus interferente que es heterólogo. Es clásico el caso del virus de la bronquitis infecciosa aviar (un coronavirus) que no produce ECP, y que interfiere con la replicación del virus de la enfermedad de Newcastle que si produce ECP. Situación que tiene aplicación diagnóstica.

Linfocitos T citotóxicos (T8). Los LcTc son muy eficientes en su actividad citotóxica, actúan directamente uniéndose a la célula blanco a la que lisan rápidamente luego de destruir los organelos y núcleo celular. El LcTc necesita reconocer primero al antígeno de histocompatibilidad mayor clase I (restricción I) y luego al antígeno viral (doble reconocimiento). El LcTc actúa secretando perforinas que se polimerizan y se insertan en la membrana celular produciendo canalículos y la posterior lisis osmótica del núcleo por endonucleasas. También pueden actuar liberando linfotoxinas al medio extracelular que alterarían la membrana celular.

Anticuerpos antivirales. Pertenecen a las clases IgM, IgG e IgA. Los anticuerpos dirigidos contra epítopes o determinantes antigénicos ubicados en la superficie del virión, neutralizan su capacidad infectante al bloquear su unión con receptores celulares complementarios y específicos. También pueden actuar como opsoninas facilitando la acción fagocitaria de los macrófagos sobre  virus.


Antígenos virales

En términos generales los virus presentan una gran diversidad antigénica. Los rinovirus en particular constituyen un número nada despreciable de tipos antigénicos o serotipos lo que ha dificultado hasta el día de hoy la producción de vacunas. El virus aftoso es un buen ejemplo de esta diversidad en que la aparición de subtipos antigénicos implica romper la inmunidad conferida por las vacunas antiaftosas. El caso más dramático de la variación antigénica es el virus de la inmunodeficiencia humana o SIDA, en que los cambios ocurren tan rápidamente de manera que en un mismo individuo se pueden encontrar virus totalmente diferentes a los que iniciaron la enfermedad.

La presión inmunológica selectiva favorece la aparición de nuevas variantes antigénicas. Tal es el caso del virus de la influenza humana, que sufre modificaciones antigénicas periódicamente. Estos cambios se pueden deber a mutaciones, como ocurre con los pequeños cambios o “drift” y a recombinación genética que es responsable de los grandes cambios antigénicos o “shift”, en que hay reordenamiento de los segmentos del ácido nucleico viral.

El conocimiento de los antígenos virales es de importancia taxonómica y permite diferenciar y tipificar a los virus por sus antígenos. La presencia de determinados antígenos en virus patógenos es de utilidad para realizar su diagnóstico y la preparación de vacunas.

En los virus los antígenos se encuentran distribuidos principalmente en estructuras externas como cápside, manto lipídico y proyecciones de superficie, y también en estructuras internas como la nucleoproteína. Por lo tanto los antígenos virales pueden ser externos e internos.

Antígenos virales externos. Se denominan antígenos tipo específicos.  Se encuentran en estructuras virales externas. Estos antígenos son neutralizados por anticuerpos específicos que en último término impiden la unión del virus con la célula blanco. Los diferentes serotipos virales se detectan por pruebas serológicas de seroneutralización e inhibición de la hemoaglutinación, entre otras.

Ejemplos de antígenos tipo específicos: En el virus aftoso la diversidad antigénica implica la presencia de siete tipos antigénicos (A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 y Asia 1) los que pueden presentar más de 60 subtipos que no tienen reacción inmunológica  cruzada entre ellos.  De  las cuatro proteínas del virus aftoso sólo la proteína 1 (PV-1) tiene importancia en la inmunoprofiláxis debido a que actúa como antígeno contra el que se producen los anticuerpos neutralizantes de la infecciosidad viral al bloquear la adsorción del virus a la célula susceptible. En el caso del virus de la influenza equina los antígenos externos de las proyecciones de superficie, hemoaglutininas y neuroaminidadas, permiten clasificarlo en dos subtipos: H7 N7 (A equino 1) y H3 N8 (A equino 2) los que no presentan reacción inmunológica cruzada. En el virus rábico la proteína G es la responsable de la virulencia y capacidad de adsorción del virus a la célula blanco, consecuentemente los anticuerpos seroneutralizantes antirrábicos se dirigen específicamente contra ella.

Antígenos virales internos.  Denominados antígenos grupo específico. Estos antígenos se presentan en virus que pertenecen a una misma familia  o género viral. Como ejemplos se citan la ribonucleoproteína de los orthomyxovirus que permite clasificar a los virus de la influenza en tres tipos A, B y C. Se diagnostican por la prueba de fijación del complemento. Los rotavirus presentan un antígeno interno común a todos los rotavirus que es diagnosticado por una prueba de ELISA diseñada para uso humano pero que se utiliza en rotavirus de animales debido a este antígeno común. El antígeno F de los paramyxovirus permite utilizar una vacuna contra el sarampión humano en la inmunización del distemper canino.

Cabe destacar que las enzimas virales también pueden actuar como antígenos virales  como es el caso de la ARN polimerasa o antígeno VIA (Virus infectious associated) del virus aftoso, que es de gran utilidad en el diagnóstico epidemiológico de la fiebre aftosa. La detección de anticuerpos anti antígeno VIA en la prueba serológica de precipitación en gel de agar, indica la replicación del virus aftoso en animales sanos pero que han sido infectados previamente.

En términos de su reacción con los antígenos virales, los anticuerpos se clasifican en:

Anticuerpos seroneutralizantes: se unen con los antígenos virales de superficie impidiendo su unión específica con receptores celulares. Son considerados  como anticuerpos protectivos.

Anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación: se unen específicamente con los determinantes antigénicos  virales hemoaglutinantes impidiendo su unión con los eritrocitos y consecutivamente inhibiendo la hemoaglutinación.

Anticuerpos precipitantes: al unirse con los determinantes antigénicos virales forman con ellos complejos Ag-Ac insolubles que precipitan siendo visibles por su opacidad en un medio de agar transparente.

Opsoninas: son anticuerpos que se combinan con un antígeno viral expresado en la superficie celular, y  son fácilmente fagocitados por células con función inmunológica que tienen receptores para la fracción Fc del anticuerpo.


Diagnóstico viral serológico

Una vez que se ha detectado la presencia de virus en muestras enviadas al laboratorio, a través de su inoculación en cultivos celulares, embriones de pollo o animales susceptibles, es necesario determinar su identidad antigénica mediante pruebas serológicas que contienen antígenos o sueros estándares lo que permite identificar antícuerpos o antígenos virales, respectivamente. Los antisueros pueden ser preparados con anticuerpos específicos policlonales o monoclonales.

La observación de viriones mediante microscopía electrónica permite solamente ubicar a los virus en determinadas familias virales de acuerdo con su morfología. La limitación de la microscopía electrónica en el diagnóstico viral se ilustra con el siguiente ejemplo. Si en muestras fecales sanguinolentas de origen canino se observan estructuras virales, pequeñas, no envueltas y con forma icosaédrica, es perfectamente factible pensar en parvovirus, sin embargo, en el perro existen dos parvovirus, 1 y  2, siendo el 2 o parvovirus canino tipo 2 (PVC-2) el agente causal de la parvovirosis canina o gestroenteritis hemorrágica. Por lo tanto el PVC-2 deberá ser identificado mediante una prueba serológica de inhibición de la hemoaglutinación utilizando un suero específico contra este serotipo.

Las pruebas serológicas deben ser específicas y sensibles, sencillas de realizar y de bajo costo. La especificidad se refiere a la probabilidad de una prueba serológica de identificar correctamente a los animales  que no están infectados, mientras que la sensibilidad es la probabilidad de identificar correctamente a los  animales infectados.

Una prueba serológica es específica  cuando determina exactamente el reactante que busca. La prueba es inespecífica cuando se equivoca e identifica un reactante en vez del verdadero, entregando un resultado denominado falso positivo.

Un prueba serológica es sensible cuando es capaz de detectar pequeñas cantidades del reactante problema. La prueba de precipitación es poco sensible; si el reactivo problema se encuentra en pequeñas cantidades la prueba se equivoca y entrega un resultado erróneo denominado falso negativo.

La interacción entre  antígeno y anticuerpo es específica, de alta afinidad y reversible dado que la unión está dada por fuerzas débiles no covalentes. Se define por una constante de equilibrio o de asociación que es una medida de la fuerza de la interacción, afinidad y avidez de la reacción. La reacción final es dependiente de la temperatura, pH y fuerza iónica del medio.


Pruebas serológicas

Las pricipales pruebas serológicas usadas en el diagnóstico viral son:

1.  Precipitación en gel de agar o inmunodifusion doble. En esta prueba los antígenos son solubles y al combinarse con  anticuerpos se forman complejos ag-ac insolubles que precipitan. La inmunodifusión doble o método de Ouchterlony se realiza en placas Petri con agar noble. En virología veterinaria se utiliza para el diagnóstico de la anemia infecciosa equina (“test” de Coggins),  hepatitis aviar con cuerpos de inclusión y leucosis enzoótica bovina. De gran utilidad ha sido la prueba antígeno VIA para determinar la presencia de anticuerpos dirigidos contra la enzima ARN polimerasa del virus aftoso.  La prueba de precipitación es específica aunque de baja sensibilidad. En la actualidad se usa la nefelometría  con rayos láser de helio  y neón para medir con exactitud la cantidad de complejos inmunes presentes en una prueba de precipitación. 

2.  Inhibición de la hemoaglutinación (IHA). En esta prueba los anticuerpos específicos se unen con las hemoaglutininas que presentan los orthomyxovirus, impidiendo la adsorción del virus con los eritrocitos y por lo tanto la hemoaglutinación. La prueba de IHA se utiliza para tipificar virus hemoaglutinantes como el de la  influenza equina y cuantificar la respuesta inmune sérica post vacunal.

El título IHA corresponde al valor inverso de la última dilución sérica que inhibe la hemoaglutinación viral.  En forma similar se puede utilizar la prueba de inhibición de la neuroaminidasa (NA) para determinar el tipo de NA presente en los orthomyxovirus. La prueba de IHA se puede realizar en tubos (macrométodo) o en microplacas (micrométodo).

3. Hemoaglutinación pasiva (HAP). La prueba de HAP se utiliza para estudiar virus no hemoaglutinantes. Estos virus tratados con formalina adquieren la propiedad de unirse a los eritrocitos. Los anticueros antivirales se unirán a los determinantes antigénicos pegados a los eritrocitos y actuarán como puentes de unión produciendo la hemoaglutinación indirecta. La prueba de HAP se utiliza para titular anticuerpos contra virus herpes de la rinoneumonitis equina y rinotraqueítis infecciosa bovina.

4Fijación del complemento (FC’). La prueba de FC’ se basa en la capacidad de los complejos ag-ac de unirse por medio de la fracción FC del anticuerpo  con el componente C-1q del sistema del complemento, activándolo. La reacción antígeno viral-anticuerpo específico no se  visualiza, para ello se agrega un sistema indicador o hemolítico compuesto por antígeno (eritrocitos) y anticuerpo (hemolisina) que permitirá detectar el consumo de C’ y consecuentemente  si  la reacción antígeno viral - anticuerpo antiviral es positiva o negativa. La prueba de FC’ se utiliza en la tipificación del virus aftoso y virus herpes equino tipo 1 causante del aborto viral o rinoneumonitis equina. También se puede utilizar para cuantificar la respuesta inmune sérica anti viral. 

5.  Seroneutralización (SN). En la prueba de SN los anticuerpos neutralizantes se unen al antígeno viral impidiendo que el virus se adsorba a los receptores celulares impidiendo por  lo tanto que el virus penetre a la célula e inicie la infección. Los anticuerpos seroneutralizantes sólo bloquean la unión del virus con la célula sin destruir al virus, de manera que los virus que se disocian de los anticuerpos mantienen su capacidad infecciosa.

La prueba de seroneutralización se puede realizar en dos procedimientos:

1. Dilución punto final seroneutralizante (DPFS): en esta prueba se enfrentan diluciones del suero en estudio con una cantidad fija de virus (100 DICT50). El título seroneutralizante corresponde al valor inverso de la última dilución sérica que neutraliza la actividad infectante del virus. Esta prueba se puede aplicar en cultivos celulares, embriones de pollo y animales susceptibles. En cultivos celulares se realiza en tubos o en microplacas. La DPFS se utiliza ampliamente en virología en el diagnóstico de la fiebre aftosa, rinoneumomitis equina, rinotraqueítis infecciosa bovina, entre otras.

2. Indice neutralizante (IN): en esta prueba se enfrentan diluciones del virus a una cantidad constante de un suero estándar (1/5). Como control se mezclan las diluciones del virus con medio de cultivo. El IN está dado por la diferencia entre los títulos infectantes obtenidos. IN entre 2,0 y 3,0 son considerados positivos El IN se utiliza preferentemente  para ganar tiempo en un diagnóstico debido a que no es necesario titular el virus como ocurre en la  DPFS.

Las pruebas de protección constituyen una forma de prueba de neutralización que se realiza  in vivo, inoculando diluciones decrecientes de un antisuero específico a grupos de animales, para luego inocularles (desafío) una dosis fija de virus infectante. Estas pruebas son terciarias ya que miden los resultados que la interacción antígeno anticuerpoo ejercen sobre la resistencia de los animales a contraer una enfermedad viral.

6.  Microscopía electrónica inmune. Al agregar anticuerpos específicos a una muestra preparada para microscopía electrónica, es más fácil visualizar las partículas virales que se aglomeran, además que tipifican rápidamente al virus en estudio. No es una técnica de uso rutinario.

7.  Inmunofluorescencia (IF).  La prueba de anticuerpos fluorescentes (AF) se aplica en la identificación de antígenos virales en tejidos o en cultivos celulares. Para ello se marcan los anticuerpos con una substancia fluorescente como el isothiocianato de fluoresceína y la rodamina. 

En la prueba directa de AF se coloca el anticuerpo marcado sobre la preparación con el antígeno desconocido y se observa en un microscopio de fluorescencia. La aplicación de LUV sobre la muestra positiva hace que los antígenos unidos al anticuerpo fluorescente emitan una radiación verde amarillo. Esta prueba se utiliza fundamentalmente para el diagnóstico rápido de la rabia animal y peste porcina clásica.

En la prueba indirecta de AF se determina la presencia de anticuerpos en el suero sanguíneo o antígenos virales en tejidos o cultivos celulares. Esta prueba utiliza una antiglobulina marcada con fluoresceína. La antiglobulina son anticuerpos dirigidos contra anticuerpos de una especie animal. La antiglobulina se unirá con el anticuerpo que se ha unido específicamente con el antígeno viral y emitirá una fluorescencia verde amarillo. La prueba indirecta permite observar una fluorescencia más brillante que en la prueba directa. Además permite determinar el isotipo del anticuerpo problema. La prueba de AF es muy rápida y en menos de 1 hora se puede llegar a un diagnóstico acertado.

8.  Inmunoperoxidasa (IP). En esta prueba inmunoenzimática los anticuerpos o las antiglobulinas se marcan con una enzima, fosfatasa alcalina o peroxidasas, lo que permite identificar antígenos virales en cortes de tejidos o cultivos celulares. La enzima más utilizada es la peroxidasa del rábano picante que actúa sobre el H2O2. Al agregar el substrato de la enzima la reacción positiva se manifiesta por un color café oscuro. La prueba de IP se realiza en forma directa e indirecta de la misma forma que en la prueba de AF, pero tiene la gran ventaja de utilizar un microscopio óptico de luz convencional. Esta prueba se ha aplicado al estudio de la diarrea viral bovina.

9. Enzimoinmunoanálisis (EIA). El enzimoinmunoanálisis se basa en dos fenómenos biológicos, la alta especificidad de un anticuerpo por un antígeno determinado y la amplificación por reacciones químicas producidas por enzimas. La EIA consiste en una reacción inmunológica y una reacción indicadora  de tipo enzimático que demuestra la presencia o ausencia de reacciones antígeno-anticuerpo.

La técnica de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, ELISA (del inglés “enzyme linked immunosorbent assay”,  permite detectar y cuantificar anticuerpos y antígenos virales. Esta prueba es tan sensible como el radioinmunoensayo aunque mucho menos costosa.  ELISA permite detectar anticuerpos o antígenos en muy bajas concentraciones (1 ng/ml). En la prueba indirecta de ELISA los anticuerpos se unen a una fase sólida, comúnmente los pocillos de una microplaca de poliestireno. Posteriormente se agrega el antígeno problema y luego de una incubación se agrega la antiglobulina marcada con una enzima, generalmente peroxidasa. Luego de agregar el substrato para la enzima, H2O2, la prueba se lee por el cambio de color del substrato. Rojo en el caso “kit” de ELISA utilizado para el diagnóstico de rotavirus animales. La lectura puede hacerse en forma cuantitativa por dilución del antígeno o a través de una lectura fotocolorimétrica. En la prueba indirecta de ELISA  se unen antígenos a la microplaca y se utiliza para la detección y cuantificación de anticuerpos virales.

La técnica de ELISA se ha desarrollado para un importante número de aplicaciones en medicina veterinaria, comercializándose diversos “kits” de diagnóstico viral para enfermedades como la rinotraqueítis infecciosa bovina, diarrea viral bovina y parainfluenza 3 bovina, entre otras. Por otra parte la metodología ELISA ha sido automatizada a nivel de instrumentos dispensadores, lavado, lectura espectrofotométrica y registro, lo que permite procesar cientos de muestra en un día

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