DIAGNÓSTICO DE VIRUS INFLUENZA EN MAMÍFEROS Y AVES. OPS/OMS 2010

INTRODUCCIÓN

Influenza es una enfermedad infecciosa que afecta a las aves y mamíferos y es causada por los virus influenza. Estos virus pertenecen a la familia Ortomixoviridae la cual incluye el genero Influenza que comprende tres tipos A, B y C y el genero Togotovirus (virus de garrapatas). Los virus influenza son virus ARN de simple cadena de polaridad negativa y genoma segmentado. Tienen un diámetro de 120 nm con apariencia pleomorfica y poseen una envoltura lipoproteica. De la superficie viral se proyectan dos tipos de glicoproteínas: la hemaglutinina (HA o H) y la neuraminidasa (NA o N), estas glicoproteínas confieren propiedades biológicas muy importantes al virus tales como: la inducción de inmunidad en el huésped y facilitar el proceso infeccioso a nivel celular. Basada en la antigenicidad de estas glicoproteínas los virus influenza han sido subdivididos en 16 subtipos de H (H1-H16) y 9 N (N1-N9). En la denominación de los virus influenza incluye el tipo (A o B), la especie de huésped (excepto los virus humanos), el sitio geográfico donde fue identificado el virus, el número de aislamiento, el año y en paréntesis el subtipo de H y N, por ejemplo: A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1). Todos los subtipos de virus influenza A han sido encontrados en aves acuáticas y pueden afectar la aves domesticas causando generalmente infecciones asintomáticas o muy leves. Sin embargo algunas variantes de los subtipos H5 y H7 son de altamente patogénicos (HPAI) causando enfermedad sistémica en aves silvestres y domesticas. Estas variantes pueden afectar al hombre y potencialmente pueden causar pandemias. La infección por los virus influenza en el humano puede cursar con manifestaciones clínicas leves siendo los síntomas más comunes escalofrío, fiebre, dolor de cabeza dolores musculares, dolor de garganta y tos. En los casos más severos los virus influenza pueden causar neumonía. Los virus influenza son transmitidos típicamente por aerosoles producidos por la tos o estornudo. En aves a través de la contaminación de agua y fomites con secreciones nasales o heces. El virus puede inactivarse rápidamente por la luz solar desinfectantes o detergentes. La población humana ha sido afectada durante los últimos 90 años por los subtipos de virus influenza A H1N1, H2N2 y H3N2 causando epidemias de enfermedad respiratoria estacional cada año en la población, siendo los subtipos H1N1 y H3N2 prevalentes en los últimos 40 años. Las epidemias emergen debido a la ocurrencia de mutaciones puntuales en las dos glicoproteínas superficiales H y N inducidas por presión inmunológica de la población, la acumulación de mutaciones dan lugar a la emergencia de nuevas variantes antigénicas que no son reconocidas por las defensas del huésped que han sido inducidas por las variables previas. Estos cambios continuos en la antigenicidad de los virus influenza son denominados “drift antigénico”. La transmisión de los virus influenza A de humanos a aves y cerdos puede ocurrir ocasionalmente y en esta ultima especie puede ocurrir la reasociación de genes de virus influenza cuando el animal esta co-infectado por 2 virus influenza A de diferentes especies y así se genera un nuevo subtipo Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 6 viral con potencial pandémico, este fenómeno de reasociación de genes virales es denominado “shift antigénico”. En contraste a las epidemias, las pandemias ocurren por la emergencia de una nueva subtipo de virus influenza A contra la cual no existe inmunidad en la población. Un nuevo subtipo de virus influenza puede emerger por adaptación de subtipos aviares o mamíferos para su transmisión al humano o por la reasociación genética de virus animales y humanos en cerdos como se menciono anteriormente En el siglo XX ocurrieron pandemias en 1918-1919 causada por el virus H1N1, en 1957 por la cepa H2N2 y en 1968 por la cepa H3N2. En abril del 2009 se identifico una nueva cepa de virus Influenza A H1N1 que emergió por la reasociación genética de virus influenza A de humano, cerdo y aves. La Organización Mundial de la Salud (OMS) lanzó la Alerta de Pandemia fase 5 el 28 de abril del 2009, indicando que el nuevo virus se había diseminado en varias regiones del mundo y para Junio se elevo a la fase 6 indicando Pandemia Global. Durante el 2009-2010 el 90% de las infecciones de influenza fueron asociadas al subtipo H1N1 pandémico y más de 214 países confirmaron casos, se estima que ocurrieron aproximadamente 61 millones de casos, 274.000 hospitalizaciones y 12.470 muertes. En la actualidad existen evidencias que el virus esta entrando en un patrón de transmisión estacional por lo que la OMS declaro entrar en la fase Post Pandémica el 10 de agosto del 2010. El virus influenza subtipo H1N1 porcino clásico ha venido afectando la población porcina a nivel mundial desde 1930. Otros subtipos que infectan comúnmente son el cerdo H3N2 y H1N2 variantes europeas y americanas Los virus influenza suina comúnmente son introducidos en un rebaño por un cerdo infectado y permanece endémico por medio del movimiento de animales y la mezcla de infectados con susceptibles. La infección pude transcurrir en forma sintomática o manifestaciones clínicas leves caracterizadas por: anorexia, depresión, fiebre tendencia de acumularse en pilas y los signos respiratorios se hacen evidentes con el movimiento. La co-circulación de múltiples subtipos de virus influenza A en aves, porcinos y humanos, la emergencia y endemicidad de la cepa (H5N1) altamente patogénica en el Sureste asiático así como la emergencia de la cepa pandémica H1N1 y la transmisión ocasional de variantes aviares y humanas en poblaciones de porcinos constituyen un riesgo significativo para la emergencia de nuevos subtipos de virus influenza A con potencial pandémico. Esta situación representa un reto muy importante para el diagnostico e identificación oportuna de subtipos de virus influenza A emergentes. El presente documento reúne todos los protocolos de las técnicas de laboratorio tanto serológicas, virológicas, y moleculares, como también los estudios de patogenicidad disponibles para el diagnóstico de la Influenza, abarcando las cepas aviares y suinas incluyendo la pandémica H1N1 2009. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 7

1. PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE VIRUS INFLUENZA EN MAMÍFEROS Y AVES Los procedimientos de diagnostico del virus influenza se pueden clasificar en: 1. Diagnostico virológico basados en detección del agente viral por: aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados, detección de antígeno y amplificación parcial del genoma viral por RT-PCR. 2. Diagnostico serológico basados en la detección y medida de niveles de anticuerpos en sueros pareados utilizando las técnicas de inmunodifusión en agar (IDA), ensayo inmuno enzimático (ELISA) o inhibición de la hemaglutinación (IHA). Las técnicas convencionales de aislamiento e identificación viral así como la determinación de anticuerpos son muy sensibles y especificas sin embargo tienen la desventaja que requieren una o más semanas para su obtener resultados además se debe disponer de instalaciones físicas de contención biológica nivel 3 o 4 para el manejo de subtipos de virus emergentes. En los últimos años se han desarrollado estuches comerciales de ELISA en formato captura de antígeno que permiten la detección de antígeno de virus influenza A en las muestras clínicas. La mayoría de los estuches usan anticuerpo monoclonal contra la nucleoproteína (NP), pueden realizarse sin equipo especial de laboratorio y los resultados pueden estar disponibles en 15-20 minutos. La mayor desventaja es la falta de sensibilidad y no han sido validados para todas las aves y mamíferos Actualmente se dispone de métodos moleculares de RT-PCR y secuenciación genómica que son métodos rápidos con alta sensibilidad y especificidad que permiten detectar el virus directamente en la muestra clínica así como su caracterización genética y su manipulación requieren contención biológica nivel 2 utilizando normas de seguridad nivel 3. Sin embargo la técnica de RT-PCR desarrollada para los subtipos y variantes circulantes puede tener una reducida o no sensibilidad para la detección de nuevos subtipos o variantes debido a la alta variabilidad genética especialmente en los genes de la H y N, por lo que deben diseñarse y validarse nuevos protocolos con partidores (primers) y sondas basados en las secuencias genéticas de cepas de virus influenza A emergentes. Basada en estas observaciones se recomienda que los laboratorios de diagnostico de influenza tengan disponibles las técnicas convencionales y las moleculares para asegurar un diagnostico confiable. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves *HA= hemaglutinación.. **CCs = Centros Colaboradores de Influenza de la OIE Positivo IHA para tipo y subtipo Negativo Pasaje para incrementar titulo Detección de virus influenza Muestra Clínica Cosechar los fluidos embrionários Inocular en huevos Incubar a 33-34º C 48 hrs Incubar 4º C durante toda la noche Determinar la actividad HA* Negativo Pasaje del fluido Positivo < 1:8 > 1:8 Almacenar una aliquota IHA para tipo y subtipo Pasaje para aumentar el titulo Inocular células MDCK Incubar a 33-34º C por 10 dias HA los días 3, 5 & 10 Negativo Lavar para remover los GR****, realimentar y reincubar Positivo HA Amplificación genómica RT-PCR o rt RT-PCR Influenza A, (gen de la Matrix) suino: H1 clásica, H3, H1 pandémica Aves: IAAP/Eurasia H5 y H7 Negativo Pasaje por huevos embrionados o células Positivo Referir a CCs OIE para caracterización genética Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves 2. COLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS El éxito del diagnostico de laboratorio de pende de la calidad de la muestra y de las condiciones de preservación y transporte al laboratorio. Las muestras para la detección del virus influenza deben ser tomadas generalmente durante los primeros 3 días del inicio de la enfermedad. En humanos y mamíferos el virus influenza causa infecciones respiratorias mientras que en aves puede causar infección del tracto respiratorio y gastrointestinal por lo que el tipo de muestras recomendadas son las siguientes: Tipo de muestras para diagnostico 1. Mamíferos y aves vivas: - Tracto respiratorio alto: hisopado nasal, orofaringe, traquea - Aves: hisopado cloacal, heces. Es recomendable colectar hisopados cloacales de aves vivas o carcasas frescas 2. Mamíferos muertos: - Tracto respiratorio alto bajo: lavado bronqueo-alveolar, hisopado traqueal, pulmón 3. Aves muertas - Cerebro, corazón, pulmón, bazo, hígado, riñón - Material requerido para la toma de muestras: 1. Hisopos estériles de poliéster o dacron con palillo de plástico o aluminio 2. Viales estériles de 1-3 ml de plástico con tapa de rosca 3. Instrumental quirúrgico para colecta de tejidos 4. Medio de transporte viral comercial o preparado en el laboratorio de la siguiente manera: Medio de transporte viral 1 litro de PBS o medio de cultivo celular suplementado con: i. Seroalbumina bovina ………………………………….. 0,5% ii. Penicilina G ……………………………………….…… 2X 106U/lt, iii. Polimicina B …………………………………….……… 2X106 U/lt, iv. Gentamicina …………………………………………… 250 mg/lt v. Nistatina …………………………………………...…… 0,5 X106 U/lt vi. Ofloxacina HCL …………………………..…………… 60 mg/lt vii. Sulfametazole ……………………………….………… 0,2g/lt Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 10 Esterilizar por filtración, distribuir en los viales en volúmenes de 2-3ml y almacenar en refrigeración Preparación para la colección de muestras: 1. Rotular los viales con el número de campo, tipo de muestra y la fecha de toma. 2. Llenar la información contenida en la ficha de campo, la cual debe incluir como mínimo: tipo de animal especie, tipo de muestra, localidad y fecha. 3. Use equipo de protección personal para la toma de muestras: mascaras N95, guantes de latex, bata, lentes y gorro. Procedimiento para colección de muestras: 1. Hisopados nasales: a. Insertar el hisopo en la cavidad nasal paralelo al paladar en dirección dorsal medial evitando tocar la piel. b. Retirar el hisopo lentamente con rotación frotando la mucosa nasal. c. Utilizar el mismo hisopo para colectar la muestra de la otra cavidad nasal. d. Colocar el hisopo en el medio de transporte viral y partir el palillo y cerrar herméticamente el vial. 2. Hisopado de la orofaringe a. Frotar vigorosamente la mucosa de la faringe posterior b. Colocar el hisopo en el medio de transporte viral y partir el palillo y cerrar herméticamente el vial 3. Hisopados traqueales: En aves vivas: a. Inserte el hisopo y frote cuidadosamente la pared de la traquea b. Colocar el hisopo en el medio de transporte viral y partir el palillo y cerrar herméticamente el vial En aves sacrificadas el hisopado puede colectarse después de remover el pulmón y la traquea. a. Usando guantes sostenga la traquea e inserte el hisopo a la máxima longitud y frotar vigorosamente la pared b. Colocar el hisopo en el medio de transporte viral y partir el palillo y cerrar herméticamente el vial Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 11 4. Hisopados cloacales de aves vivas: a. Insertar el hisopo profundamente en el conducto y frote vigorosamente la pared. El hisopo debe contener restos fecales b. Colocar el hisopo en el medio de transporte viral y partir el palillo y cerrar herméticamente el vial 5. Muestras fecales: a. Colectar Con el hisopo muestras de heces frescas depositadas en el campo por aves silvestres o en las jaulas aves domesticas. b. Colocar el hisopo en el medio de transporte viral y partir el palillo y cerrar herméticamente el vial. 6. Muestras de tejido: a. Asépticamente remover el tejido fresco separar un trozo con tijeras estériles b. Colocar el trozo de tejido en un recipiente con tapa de rosca previamente rotulado c. Cada tejido debe ser colectarse en recipientes separados 7. Suero a. En mamíferos y aves vivas enfermas colectar una muestra de sangre 3-5 ml de sangre en la fase aguda de la enfermedad (<7 -20="" -="" 1.="" 12="" 13="" 15="" 2.500="" 2.="" 3.="" 3373="" 4.="" 48-72="" 4="" 70="" a="" absorbente="" aftosa="" al="" ambiente:="" as="" asegurar="" aves="" b.="" blica="" bolsa="" botas="" c.="" cada="" caja="" carlo="" centrifugar="" centro="" certificado="" cierre="" coagulo="" col="" colocar="" como="" con="" congelamiento="" congelar="" conservarse="" contaminadas="" contenido="" conteniendo="" convaleciente="" cubrir="" d="" dar="" de="" debe="" deben="" dejar="" del="" descartar="" descongelamiento="" desinfecci="" desinfecte="" despu="" detallada="" detecci="" diagn="" diagnostico="" durante="" el="" em="" empaque="" en="" enviadas="" equipo="" est="" evitarse="" fase="" feros="" fiebre="" goma="" guantes="" hasta="" hielo="" horas="" iata="" indicado="" infectividad="" influenza="" inmediatamente="" instrucciones="" la="" laboratorio.="" laboratorio="" largos="" las="" lentes="" lista="" mam="" mantenidas="" mas="" mascara="" material="" menos.="" minutos="" mono="" muestra="" muestras="" n="" naciones="" o="" ops="" otra="" p="" panamericano="" papel="" paquete="" para="" perdida="" periodos="" personal="" pl="" por="" precauciones="" preparar="" preservaci="" procedimientos="" protecci="" proteja="" puede="" que="" realizado="" recipiente="" recomienda="" reducir="" refrigeraci="" reo="" retraer="" ril="" rmica="" rotular="" rpm="" s="" salud="" sangre="" se="" seco="" semana="" semanas="" ser="" siguiendo="" sobre="" son="" stica="" stico="" suero="" suficiente="" superficies="" t="" terrestre:="" tico.="" todo="" transferir="" transportadas="" transporte="" uestras="" un="" una="" unidas:="" utilice="" veterinaria="" vial="" virus="" y="">
 3. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL Introducción Las muestras clínicas tales como heces, secreciones respiratorias y tejidos están contaminadas con flora normal y puede contener detritus celulares que pueden interferir en la multiplicación viral, por lo que deben tratarse con antimicrobianos y clarificarse por centrifugación antes de la inoculación en cultivos celulares o huevos embrionados. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad 2. Centrifuga refrigerada 3. Vortex 4. homogenizadores o morteros 5. Equipo de protección personal: guantes, bata de laboratorio, mascaras Materiales 1. Gradillas 2. Tubos con tapa de rosca estériles 5 y de 15 ml 3. Viales de 2ml con tapa de rosca 4. Pipetas serológicas de 1, 5, 10 ml 5. Marcador 6. Alcohol de 70% 7. Hipoclorito al 5% Reactivos 1. Medio de transporte viral 2. Solución de antibióticos (100 U/ml penicilina y 100 g/ml estreptomicina) 3. Alumndum o arena estéril Recomendaciones de bioseguridad 1. Utilizar equipo de protección personal: guantes, bata, mascara y guantes Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 14 2. Realizar todo el proceso de preparación de las muestras en el gabinete de bioseguridad ya que se pueden crear aerosoles conteniendo patógenos del tracto respiratorio 3. Aplicar las normas de bioseguridad universal cuando manipule muestras y utilizar precauciones especiales si se sospecha de virus influenza de alta patogenicidad o nuevos subtipos virales. 4. Sustituir en lo posible el material de vidrio por material de plástico descartable. 5. Eliminar recipientes pipetas y puntas contaminadas en bolsas para autoclave. 6. Descontaminar inmediatamente los desechos líquidos conteniendo material infeccioso con hipoclorito de sodio o por autoclave. 7. Centrifugar utilizando soportes con tapa de seguridad. Abrir los tubos de centrifuga en el gabinete de bioseguridad. 8. Desinfectar las superficies de trabajo después de la finalizar el análisis o después de un derrame accidental. 9. Evite las contaminaciones cruzadas: • Nunca procese muestras clínicas y virus adaptado en el laboratorio al mismo tiempo • Nunca procese muestras clínicas humanas, de mamíferos o aves en el mismo laboratorio Preparación de las muestras de hisopados 1. Mezclar la muestra en el vortex, remover el hisopo presionando contra la pared del tubo y descartarlo en un recipiente conteniendo solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 5%) 2. Transferir la muestra con una pipeta estéril a un tubo de 5ml previamente rotulado. 3. Añadir 50 ul de la mezcla antibióticos a cada muestra 4. Centrifugar a 2.500 rpm por 20-30 minutos 5. Transferir el sobrenadante con una pipeta estéril a un vial de 2ml previamente rotulado 6. Conservar la muestra en refrigeración hasta ser inoculada (24 horas) 7. Almacenar la muestra a -70°C después de su inoculación para estudios posteriores Preparación de muestras tejidos 1. Cortar el tejido en pequeños trozos (1x1mm) utilizando tijeras estériles 2. Almacenar a 70ºC el tejido remanente para estudios posteriores 3. Colocar el tejido en un mortero conteniendo aproximadamente 1/2 gr. de alumndum o arena estéril, añadir 1-2 ml de medio de transporte viral y macerarlo. 4. Transferir el sobrenadante con una pipeta estéril a un tubo de centrifuga previamente rotulado Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 15 5. Centrifugar a 2500 rpm por 30 minutos 6. Transferir el sobrenadante con una pipeta estéril a un vial previamente rotulado 7. Conservar la muestra en refrigeración hasta ser inoculada (24 horas) 8. Almacenar la muestra a -70°C después de su inoculación para estudios posteriores. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 16 4. AISLAMIENTO VIRAL DE HUEVOS EMBRIONADOS DE GALLINA Introducción El aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados y la subsecuente identificación mediante técnicas inmunológicas o genéticas son los métodos mas sensibles para el diagnostico de infecciones virales cuando dispone de muestras de buena calidad. Una de las mayores ventajas es que se dispone del virus a nivel del laboratorio para futuras investigaciones sobre la composición antigénica y caracterización genética, preparación de vacunas y estudios de resistencia antiviral. Los huevos embrionados de gallina fueron uno de los primeros métodos utilizados en el aislamiento viral y continúan siendo uno de los métodos mas sensibles para el aislamiento de virus influenza aviar, no siendo así para todos los virus de influenza humana o cerdos por lo que se recomienda utilizar además cultivos celulares para asegurar mayor sensibilidad en el diagnostico. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad 2. Centrifuga refrigerada 3. Ovoscopio 4. Incubador a 35-37 5. Vortex 6. Equipo de protección personal: guantes, bata de laboratorio, mascaras Materiales 1. Huevos embrionados de gallina de 9-10 días libres de patógenos o de anticuerpos para virus influenza 2. Perforador de huevos 3. Jeringas de tuberculina 4. Agujas de calibre 22 x1 ½ pulgada 5. Pinzas 6. Gradillas 7. Tubos con tapa de rosca estériles 5 y de 15 ml 8. Viales de 2ml con tapa de rosca 9. Pipetas serológicas de 1, 5, 10 ml. 10. Recipiente para descartar material punzo penetrante 11. Goma 12. Marcador 13. Alcohol de 70% Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 17 Recomendaciones de bioseguridad 1. Utilizar equipo de protección personal: guantes, bata, mascara y guantes 2. Realizar todo el proceso de inoculación de embriones y cosecha de líquidos embrionarios en el gabinete de bioseguridad 3. Aplicar las normas de bioseguridad universal cuando manipule muestras clínicas o coseche líquidos embrionarios. Utilizar precauciones especiales si se sospecha de virus influenza de alta patogenicidad o nuevos subtipos virales. 4. Sustituir en lo posible el material de vidrio por material de plástico descartable y elimine el material contaminado en bolsas para autoclave. 5. Descontaminar inmediatamente los desechos líquidos conteniendo material infeccioso con hipoclorito de sodio o por autoclave.. 6. Realizar la centrifugación utilizando soportes con tapa de seguridad. Abrir los tubos de centrifuga en el gabinete de bioseguridad. 7. Desinfectar las superficies de trabajo después de la finalizar el análisis o después de un derrame accidental. 8. Evite las contaminaciones cruzadas: • Nunca procese muestras clínicas y virus adaptado en el laboratorio al mismo tiempo • Nunca procese muestras clínicas humanas, de mamíferos o aves en el mismo laboratorio Procedimiento Inoculación de huevos 1. Examinar los huevos en el ovoscopio para verificar la viabilidad, localizar el embrión y marcar la cámara de aire. Descartar los huevos infértiles 2. Colocar los embriones en una bandeja y rotularlos con el numero de la muestra (3 huevos por muestra) 3. Desinfectar los huevos con alcohol de 70% y abrir un pequeño orificio perforando la cáscara a nivel de la cámara de aire 4. Aspirar 0,8 ml de la muestra en la jeringa de tuberculina con la aguja calibre 22 1½ pulgada 5. Mantener el huevo cerca del ovoscopio para visualizar el embrión y la cavidad alantoidea, insertar la aguja por la perforación y dirigirla hacia la membrana amniótica e inocular 0,1 ml de la muestra en la cavidad amniótica. Retirar ligeramente la aguja e inocular 0,1ml en la cavidad alantoidea. 6. Inocular los otros dos huevos de la forma señalada anteriormente 7. Eliminar la jeringa y aguja en un recipiente descartable para material punzante. 8. Cerrar las perforaciones de la cáscara con goma 9. Incubar los huevos inoculados a 33-34°C por 2-3 días. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 18 Cosecha de los líquidos amniótico y alantoideo 1. Colocar los huevos inoculados a 4°C durante toda la noche. 2. Rotular un tubo de 15 ml por cada huevo con el número de la muestra inoculada. 3. Desinfectar los huevos con alcohol de 70% 4. Romper y remover la cáscara del huevo en la cámara de aire usando pinzas estériles. Remover la membrana alantoidea. 5. Aspirar el líquido alantoideo usando una pipeta de 10 ml y transferirlo al tubo de 15 ml previamente rotulado. 6. Aspirar el líquido amniótico usando una jeringa y aguja y transferirlo a un tubo previamente rotulado. Debido a que el volumen de líquido amniótico es muy pequeño, se recomienda mezclar los líquidos de los 3 huevos inoculados con la misma muestra. 7. Centrifugar los líquidos cosechados a 3.000 rpm por 5 minutos para remover exceso de sangre o tejido 8. Evaluar el crecimiento viral usando la técnica de hemaglutinación (HA) Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 19

5. AISLAMIENTO DE VIRUS INFLUENZA EN CULTIVOS CELULARES Introducción Los cultivos celulares son utilizados en la mayoría de los laboratorios para el diagnostico virológico por aislamiento e identificación viral. La línea celular de riñón de perro Madin-Derby (MDCK) esta reconocida por tener alta sensibilidad para los virus influenza humanos y de mamíferos. Equipo 1. Gabinete de flujo laminar 2. Incubador de CO2 a 37ºC 3. Centrifuga refrigerada 4. Vortex 5. Equipo de protección personal: guantes, bata de laboratorio, mascaras Materiales 1. Frascos de cultivo celular T-75 2. Frascos de cultivo de TC-25. 3. Tubos de cultivo celular 4. Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml 5. Tubos de 10-15 ml 6. Viales de 2 ml 7. Filtros millipore 0,20 µm Reactivos 1. Cultivos celulares MDCK. American type culture Collection. Cat. # ATCC CCL 34 a. Monocapa confluente de células MDCK en frascos TC-75 b. Monocapa confluente de de células MDCK en frascos TC-25 2. Medio Eagle de Dulbeco modificado (D-MEM) Gibco. Cat. # 11965-092 3. Solución madre de penicilina-estreptomicina (penicilina G 10.000 U/ml, sulfato de estreptomicina 10.000 µg/ml) Gibco BRL Cat. # 15140-023 4. Suero fetal bovino. Laboratorios Hyclone Inc. Cat. # A-1111-L 5. Sero albumina bovina fraccion V Gibco BRL Cat. # 15260-011 6. Tripsina EDTA (tripsina 0,05%, 0,53 nM EDTA.4Na. Gibco Cat. # 25300-054 7. Tripsina TPCK tratada. (tipo XIII de páncreas de bovino) 8. Tampón HEPES 1M Gibco BRL Cat # 15630-023 9. Especimenes clínicos Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 20 I. Preparación de medios y otros reactivos: 1. Medio D-MEM con L- Glutamina suplementado: A 500 ml de D-MEM añadir: Solución madre de antibióticos 5ml (concentración final 100 U/ml de penicilina G y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina) Sero albúmina bovina 12,5 ml (concentración final 0,2%) Tampón HEPES 12,5 ml (concentración final 0,2%) Para el medio de crecimiento celular, añada 10ml de suero fetal bovino (SFB) a 90 Ml de D-MEM suplementado Para el medio de crecimiento viral, añada 0,5 ml de Tripsina TPCK (de una solución madre conteniendo 2mg/ml) a 500 ml de D-MEM suplementado sin suero (concentración final 2 µg/ml) Solución madre de Tripsina TPCK • Disolver 20 mg de Tripsina TPCK en 10 ml de agua desmineralizada • Esterilizar por filtración (millipore de 0,2 µm) • Distribuya en volúmenes de 0.5 ml y almacene a -20ºC II. Preparación de cultivos celulares en frascos TC-25 Utilizando un frasco de cultivo celular TC-75 con monocapa confluente de células MDCK, preparar los frascos de cultivo celular TC-25 de la siguiente manera: 1. Eliminar el medio de cultivo y añadir 5 ml de tripsina-EDTA precalentada a 37ºC 2. Distribuir la tripsina-EDTA en toda la monocapa celular moviendo el frasco suavemente por 1 minuto. Remover la tripsina usando una pipeta estéril 3. Añadir 1ml de tripsina EDTA y distribuirla en toda la monocapa. Incubar a 37ºC hasta que la monocapa de células se desprenda de la superficie (5-10 minutos) 4. Añadir 1 ml de suero fetal bovino para inactivar la tripsina-EDTA. 5. Añadir 8 ml de D-MEM suplementado y 10% de SFB. Pipetear suavemente para resuspender los agregados celulares 6. Transferir los 10ml de la suspensión de células a un frasco conteniendo 90 ml de D-MEM suplementado y 10% de SFB. Esta suspensión celular debe contener aproximadamente 150 células/ml 7. Transferir 6 ml de la suspensión celular a los frascos de cultivo TC-25 y conservar el remanente en frascos TC-75 para el pasaje celular. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 21 8. Incubar los frascos a 37ºC Observación: los cultivos de células MDCK pueden perder sensibilidad con el pasaje continuo, por lo tanto el laboratorio debe mantener en nitrógeno líquido un stock de células con bajo pasaje. Se recomienda: • Descongelar nuevas células cada 15-20 pasajes para mantener la sensibilidad en el diagnostico. • Evaluar periódicamente la sensibilidad usando un control positivo de titulo conocido • Evaluar periódicamente la contaminación por micoplasma. III. Inoculación de cultivos celulares con muestras clínicas Recomendaciones de bioseguridad 1. Utilizar equipo de protección personal: guantes, bata, mascara y guantes 2. Realizar todo el proceso de inoculación de las muestras en el gabinete de bioseguridad ya que se pueden crear aerosoles conteniendo patógenos del tracto respiratorio 3. Aplicar las normas de bioseguridad universal cuando manipule muestras clínicas y utilizar precauciones especiales si se sospecha de virus influenza de alta patogenicidad o nuevos subtipos virales. 4. Sustituir en lo posible el material de vidrio por material de plástico descartable y elimine el material contaminado en bolsas para autoclave. 5. Descontaminar inmediatamente los desechos líquidos conteniendo material infeccioso con hipoclorito de sodio o por autoclave.. 6. Desinfectar las superficies de trabajo después de la finalizar el análisis o después de un derrame accidental. 7. Evite las contaminaciones cruzadas: • Nunca procese muestras clínicas y virus adaptado en el laboratorio al mismo tiempo • Nunca procese muestras clínicas humanas, de mamíferos o aves en el mismo laboratorio Procedimiento 1. Evaluar la monocapa celular en el microscopio a la magnificación de 40X 2. Decantar el medio de crecimiento en un recipiente con desinfectante y lavar la monocapa celular tres veces usando 6 ml de D-MEM suplementado conteniendo 2 µg/ml de Tripsina TCPK 3. Inocular 200 µl de cada espécimen en un frasco de cultivo ce células usando puntas de pipeta estériles Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 22 4. Dejar adsorber el inoculo por 30 minutos a 37ºC 5. Añadir 6 ml de D-MEM suplementado conteniendo 2 µg/ml de Tripsina TCPK 6. Incubar a 33º en incubador de CO2. 7. Observar el efecto citopático (ECP) diariamente 8. Cosechar los cultivos que presenten 3+ o 4+ de ECP. Cosechar todos los cultivos el día 6 o 7 si no hay ECP. Colectar el sobrenadante y añadir sero albúmina bovina a la concentración final de 0,5%. 9. Evaluar el crecimiento viral usando la técnica de hemaglutinación (HA) como se describe mas adelante. Si la HA es negativa, realizar hasta 2 pasajes antes de reportar como negativo. Si es positivo realizar la identificación del tipo y subtipo viral por la técnica de IHA o RT-PCR. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 23

6. IDENTIFICACIÓN DE VIRUS INFLUENZA POR LA TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) Una de las glicoproteínas superficiales del virus influenza denominada HA tiene la propiedad de aglutinar glóbulos rojos de algunas especies de animales, por lo que esta propiedad de hemaglutinación es utilizada para la detección de crecimiento viral en huevos embrionados y cultivos celulares. La interferencia en la unión de la HA a los receptores presentes en la superficie de los glóbulos rojos por anticuerpos específicos para la HA constituye el principio de la técnica de inhibición de la hemaglutinación (IHA). La técnica de IHA es altamente especifica y sensible, pero se requiere disponer de antisueros específicos para los 16 subtipos de HA del virus influenza los cual deben ser tratados previamente para eliminar inhibidores inespecíficos y debe estandarizarse la cantidad de antígeno en cada reacción. Equipo 1. Baño de maría a 33°C 2. Baño de maría a 56°C 3. Centrífuga Reactivos 1. Enzima destructora de receptores (RDE) de Vibrio cólera 2. Antisueros de referencia para las HA. Se recomienda disponer como mínimo de los siguientes antisueros a. H1a … A/PR/8/34 (H1N1) b. H1b… A/FM/1/47(H1N1) c. H1c… A/swine/1A/30 (H1N1) d. H1d… A/swine/ 2009 (H1N1) Pandémica e. H3a…. A/Hong Kong/68 (H3N2) f. H3b… A/equine/Miami/63 H3N2) g. H3c… A/duck/Ukraine/63 (H3N2) h. H5 … A/tern/so.Af/61 (H5N3) i. H7a ….A/equine/Prague/56/ (H7N7) j. H7b…. A/FPV/Rostock/34 (H7N1). Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 24 3. Glóbulos rojos (pollo, pavo, cobayo, humanos grupo O) en solución de Alsever’s 4. Agua destilada estéril 5. Solución buffer fosfato salino (PBS) 0,01M pH 7.2 A 75 ml de H2O desmineralizada añadir y disolver cada uno de los siguientes químicos: a. Preparar una solución madre buffer fosfato 25X i. Fosfato de sodio dibasico (Na2HPO4 ) ……………………. 2,74 g ii. Fosfato de sodio monobasico (NaH2PO4 X H2O)…………… 0,79 g iii. H2O desmineralizada ........................................................... 100 ml A 800 ml H2O desmineralizada añadir: b. Preparación de PBS 1X i. Cloruro de sodio (NACL)…………………8,9 g. Agitar hasta disolver ii. Solución madre buffer fosfato 25X ……40 ml. agitar iii. H2O desmineralizada hasta 1000 ml iv. Ajustar el pH si es necesario con 1N NaOH o 1N HCL 6. Solución de Alsever’s A 800 ml H2O desmineralizada añadir: a. A 900 ml de H2O destilada los siguientes componentes químicos disolviendo bien cada uno: i. Dextrosa………………………………….20,5gr agitar hasta disolver ii. Citrato de sodio (Na3C6H5O7 2H2O )… . 8,0 gr agitar hasta disolver iii. Cloruro de sodio (NaCl) ......................4,2 gr agitar hasta disolver iv. Citrato acido (C6H8O7) ..........................0,55 gr. agitar hasta disolver v. Añadir H2O desmineralizada hasta completar 1000 ml y agitar vi. Ajustar el pH a 6,1 ± 0,1 con 1N NaOH o 1N HCL vii. Esterilizar por filtración y almacenar a 4ºC Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 25 7. Solución salina fisiológica (NaCl) 0,85% a. Solución madre 20 X: i. Cloruro de sodio (NaCl)………………… 170 gr ii. H2O desmineralizada …………………….900 ml agitar hasta disolver iii. Añadir H2O desmineralizada agua hasta completar 1000 y agitar iv. Esterilizar en autoclave a 121ºC y almacenar 4ºC b. Solución de trabajo 1X: i. Solución madre 20 X…………………………………..50 ml ii. H2O desmineralizada …………………………………950 ml Materiales 1. Pipetas serológicas y pro-pipetas 2. Pipetas ajustables de 10-200, 200-1000µl) 3. Pipeta multicanal) 4. Puntas universales 5. Gradillas y tubos 6. Microplacas de 96 cavidades en fondo en “V” para glóbulos rojos de pollo y pavo o en “U” para glóbulos rojos humanos y cobayo 7. Tubos de centrifuga de 50 ml 8. Toallas absorbentes Recomendaciones de bioseguridad 1. Utilizar equipo de protección personal: guantes, bata, mascara y guantes 2. Realizar todo el proceso de análisis de líquidos embrionarios en el gabinete de bioseguridad ya que se pueden crear aerosoles conteniendo patógenos del tracto respiratorio 3. Aplicar las normas de bioseguridad universal cuando manipule productos de cultivo viral y utilizar precauciones especiales si se sospecha de virus influenza de alta patogenicidad o nuevos subtipos virales. 4. Sustituir en lo posible el material de vidrio por material de plástico descartable y elimine el material contaminado en bolsas para autoclave. 5. Descontaminar inmediatamente los desechos líquidos conteniendo material infeccioso con hipoclorito de sodio o por autoclave.. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 26 6. Desinfectar las superficies de trabajo después de la finalizar el análisis o después de un derrame accidental. 7. Evite las contaminaciones cruzadas: • Nunca procese muestras clínicas y virus adaptado en el laboratorio al mismo tiempo • Nunca procese muestras clínicas humanas, de mamíferos o aves en el mismo laboratorio Procedimiento I. Lavado y estandarización de glóbulos rojos: 1. Filtrar el 5-10 ml de la suspensión de glóbulos rojos en Alsever´s usando una gasa estéril colectándola en un tubo de centrifuga de 50ml 2. Centrifugar a 1.500 rpm por 10 minutos 3. Aspirar el sobrenadante removiendo cuidadosamente la capa de glóbulos blancos 4. Añadir 50 ml de PBS pH 7.2) y mezclar suavemente hasta suspender el paquete celular 5. Centrifugar a 1.500 rpm por 10 minutos. Aspirar el sobrenadante 6. Repetir el lavado con PBS (pH 7.2) 2 veces 7. Resuspender el paquete celular en 12ml de PBS (pH 7.2) , transferir la suspensión a un tubo de centrifuga de 15 ml 8. Centrifugar a 1.500 rpm por 10 minutos 9. Estimar el volumen del paquete celular y remueva el sobrenadante cuidadosamente 10. Multiplique el volumen del paquete celular por 24, este valor dará el volumen de PBS (pH 7.2) necesario para preparar una suspensión de glóbulos rojos al 4% 11. La suspensión de glóbulos rojos al 4% es usada para preparar la suspensión al 0,5% de glóbulos rojos de pollo o suspensión de glóbulos rojos al 0,75% de glóbulos rojos de cobayo o humanos grupo O. II. Ajuste de la concentración de la suspensión de glóbulos rojos usando el hemocitometro: 1. Preparar una dilución 1:100 de suspensión de glóbulos rojos al 4% añadiendo 0,5 ml de la suspensión a 49,5 ml de PBS (pH 7.2) 2. Colocar 10 µl de la suspensión en el canal del hemocitometro y dejar dispersar la suspensión 3. Cuente el número de células presentes en los 4 cuadrados de las esquinas de la unidad 4. Calcule el volumen final de la suspensión usando la siguiente formula: a. Vol. final 0,5% = # de células X volumen inicial de la suspensión de glóbulos rojos de pollo 160 Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 27 O b. Vol. final 0,75% = # de células X volumen inicial de la suspensión de glóbulos rojos de cobayo o humano 240 III. Tratamiento de sueros de referencia para eliminación de inhibidores inespecíficos Los sueros contra subtipos de virus influenza producidos en animales contienen inhibidores inespecíficos que son removidos mediante el tratamiento con RDE. 1. Reconstituir el antisuero de referencia según el volumen indicado en el rotulo utilizando H2O desmineralizada estéril. Almacenar a -20ºC 2. Reconstituir el RDE en 25 ml de solución salina 0,85%. Distribuir en volúmenes de 1ml. Almacenar a -20ºC 3. Añadir 3 volúmenes de RDE por 1 volumen de suero (0,9 ml RDE+0,1ml de suero) 4. Incubar a 37ºC durante toda la noche 5. Incubar a 56ºC por 30 minutos para inactivar la RDE 6. Dejar enfriar el suero a temperatura ambiente y añadir 6 volúmenes de solución salina 0,85%.para hacer una dilución 1:10 IV. Identificación de aglutininas inespecíficas presentes en el suero de referencia. 1. Rotular una microplaca de 96 cavidades utilizando una columna A-H con los sueros de referencia 2. Distribuir 50 µl de PBS (pH 7,2) en los pozos de la última columna A12-H12 para control de glóbulos rojos 3. Distribuir 25 µl de PBS (pH 7,2) en el resto de la placa exceptuando la primera columna A1-H1. 4. Añadir 50 µl de de la dilución del suero de referencia (1:10) en los pozos de la primera columna A1-H1 5. Preparar diluciones seriadas transfiriendo 25 µl desde los pozos de la primera columna a los pozos sucesivos hasta la columna 11. Descartar los últimos 25 µl 6. Añadir 50 µl de suspensión de glóbulos rojos a todos los pozos de la placa 7. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 20-30 minutos si se usa suspensión de glóbulos rojos de pollo o pavo o por 60 minutos para las suspensiones de glóbulos rojos de cobayo o humano Interpretación: Si los glóbulos rojos sedimentan el suero es aceptable para la prueba de IHA. La presencia de aglutininas se evidencia cuando los lóbulos rojos no sedimentan en cuyo caso deben adsorberse las aglutininas. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 28 V. Absorción de aglutininas de los antisueros de referencia 1. Añadir 1 volumen de un paquete de glóbulos rojos a 20 volúmenes de antisuero de referencia tratado con RDE. 2. Mezclar e incubar a 4°C por 1 hora mezclando a intervalos de 15 minutos para suspender los glóbulos rojos 3. Centrifugar a 1.200 rpm por 10 minutos 4. Remover cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un vial estéril 5. Repetir el paso IV para identificar la ausencia de aglutininas. 6. Repetir la absorción con glóbulos rojos hasta la remoción total de aglutininas. VI. Titulación de los antígenos de referencia y virus aislados por la técnica de hemaglutinación (HA). 1. Seleccionar microplacas en “V” para la IHA con glóbulos rojos de pollo o pavo y microplacas en “U” para la HA con glóbulos rojos de cobayo o humanos grupo O 2. Rotular la placa con los antígenos control y virus aislados a ser titulados 3. Añadir 50 µl de PBS (pH 7,2) en los pozos de la placa excepto la primera columna 4. Añadir 100 µl de antígeno control y virus aislados en los pozos de la columna A1-G1. Dejar los posos de la línea H1-H12 para control de glóbulos rojos 5. Diluir en forma seriada transfiriendo 50 µl de antígeno control y virus aislados de la primera columna a los pozos siguientes y descarte los últimos 50 µl. 6. Añadir 50 µl de glóbulos rojos a todos los pozos de la placa y mezclar bien 7. Incubar a temperatura ambiente por 20-30 minutos si se usa suspensión de glóbulos rojos de pollo o pavo o por 60 minutos para las suspensiones de glóbulos rojos de cobayo o humano La hemaglutinación ocurre cuando los glóbulos rojos permanecen en suspensión después que los controles han sedimentado completamente, esta observación es registrada como “+”. Cuando ocurre sedimentación parcial se registra como “+/-“. Si hay ausencia de aglutinación los glóbulos rojos sedimentan formando un botón compacto semejante al botón formado por en los controles de glóbulos rojos y en este caso se registra “-“. Los glóbulos rojos de cobayo y humanos tienden a formar un halo y para verificar la aglutinación se puede inclinar la microplaca y observar la velocidad del flujo de los glóbulos rojos en los controles de glóbulos rojos en relación al observado con los antígenos y virus aislados. La mayor dilución de antígeno en la que se observe aglutinación completa de glóbulos rojos es considerada el titulo hemaglutinante de los antígenos de referencia y los aislados de virus. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 29 VII. Preparación de la solución de antígenos y virus aislados y su re-titulación La técnica de inhibición de hemaglutinación (IHA) utiliza 4 unidades hemaglutinates (UHA) hemaglutinates/dilución de suero de referencia. Se define como unidad aglutinante la cantidad de antígeno o virus necesaria para aglutinar un volumen igual de glóbulos rojos. 1. Determinar el volumen de antígeno de referencia y virus aislados que es necesario para realizar la prueba de IHA, por ejemplo: 1 ml de antígeno se necesita para las diluciones de 5 sueros en 8 cavidades y a cada cavidad se añaden 25 µl de antígeno por lo tanto 5 sueros x 8 cavidades x 25 µl de antígeno o virus aislado = 1ml. Prepare 1 ml adicional para la re-titilación. 2. Debido a que se necesitan 4 UHA/25 µl o 8 UHA/50 µl de antígeno o virus aislado, calcular la dilución dividiendo el titulo HA por 8 por ejemplo si el titulo HA del antígeno o virus aislado es 160, la 8 UHA/50ul estarán contenidas en la dilución 1:20 del antígeno o virus aislado. Las proporciones serán: 1 parte de antígeno o virus aislado y 19 partes de PBS (pH 7,2) 3. Preparar la dilución de antígenos de referencia y virus aislados conteniendo 8 UHA/50 µl en el volumen requerido para la prueba de IHA 4. Realizar la re-titulación siguiendo el procedimiento descrito en el paso IV Interpretación: La dilución del antígeno control y virus aislados contiene 4 UHA/25 µl o 8 UHA/50 si se observa HA en los primeros 4 pozos de la reacción de re-titilación. Si no contiene las UHA la dilución debe ajustarse añadiendo antígeno o virus aislado para aumentar o diluyendo para reducir las UHA. Ejemplo: si el titulo es 16 UHA el antígeno control o virus aislado debe diluirse el doble, si por el contrario el titulo es 3UHA quiere decir que la dilución solo tiene 4UHA/50 µl por lo que debe añadirse otro volumen de antígeno o virus aislado para ajustar la 8UHA/50 µl. Repetir la re-titulación como se indico anteriormente para confirmar la presencia de las UHA deseadas. VII. Prueba de Inhibición de la hemaglutinación (IHA) para la identificación de virus aislados. Cada virus aislado debe confrontarse con diluciones seriadas de los antisueros de referencia 1. Rotular las microplacas considerando la reacción de cada uno de los antisueros de referencia con cada uno de y los antígenos control y virus aislados. 2. Añadir 25 µl de PBS (pH 7,2) en todos los pozos de la placa excepto en la primera línea (A1- A11) 3. Añadir 50 µl de PBS (pH 7,2) en los posos de la columna 12 (A12-H12) para control de glóbulos rojos Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 30 4. Añadir 50 µl de cada antisuero de referencia tratado con RDE en los pozos correspondientes de la primera fila (A1-A11) 5. Preparar diluciones seriadas en base 1:2 transfiriendo 25 µl de antisuero desde la primera fila a los pozos siguientes. Descarte los últimos 25 µl de la línea H1-H12 6. Añadir 25 µl de antígeno o virus aislado conteniendo 4UHA/ µl a cada una de las diluciones de los antisueros de referencia. 7. Mezclar bien e incubar por 15 minutos a temperatura ambiente (22-25°C) 8. Añadir 50 µl de suspensión estandarizada de glóbulos rojos y mezclar bien. 9. Incubar por 15-30 minutos a temperatura ambiente (22-25°C) 10. Registre el titulo IHA Interpretación: Si ocurre reacción antígeno/anticuerpo la hemaglutinación de los glóbulos rojos es inhibida. Utilizar los símbolos “+” para HA, “+/-“ parcial y “-“ para IHA. El titulo es la dilución más alta del antisuero de referencia que inhibe totalmente la hemaglutinación. Se identifica el tipo y subtipo de virus influenza si el virus aislado reacciona con uno de los antisueros de referencia mostrando un titulo IHA > o = a 4 diluciones que con los otros antisueros. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 31

7. IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS INFLUENZA A POR LAS TÉCNICA DE AMPLIFICACIÓN GENÉTICA PARCIAL POR LA ENZIMA POLIMERASA (RT-CPR) Las técnicas de amplificación genómica parcial por la enzima polimerasa (PCR) convencional o en tiempo real rt-PCR son técnicas poderosas que esta disponible en un numero creciente de laboratorios que puede utilizarse para la identificación rápida de una gran variedad de patógenos. Debido a que el genoma de los virus influenza es tipo ARN de polaridad negativa, se debe sintetizar un ADN complementario (ADNc) antes de la reacción de amplificación usando la enzima transcriptaza reversa (RT). La amplificación logarítmica de un segmento de DNA ocurre en una reacción térmica cíclica (25-30 ciclos) a 92ºC para desnaturalización del ADN, 42º para el anillaje de los partidores a la secuencia complementaria en el templete y 72ºC para la síntesis y extensión de la cadena de ADN por la enzima polimerasa. Los componente de la reacción incluyen: el template ADN, promotores (primers) de oligonucleótidos (18-30 nucleótidos) delanteros y reversos, deoxinucleótidos (dNTPs: A, C, G, T) y Taq polimerasa ADN. La detección del producto de la amplificación se puede realizar al final de la reacción de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa o en tiempo real (rt RT-PCR) en el cual el amplicon puede visualizarse según progresa la reacción utilizando oligonucleótidos marcados (sondas) con moléculas fluorescentes. Debido a que las secuencias genéticas difieren entre tipos/subtipos de los virus influenza, solo es posible diseñar los partidores y sondas que pueden detectar específicamente el tipo o el subtipo de virus. El gen de la matrix (M) es el menos variable de todos los genes, por lo que puede ser utilizado para la detección de todos los virus influenza A, mientras que los genes de la H y N son utilizados para la identificación de subtipo y variantes que están circulando en la población. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 32 I. Extracción del acido nucleico usando el estuche Mini Qiagen QIAamp Viral RNA Las estructuras celulares y proteínas presentes en muestra son lisadas usando un agente desnaturalizarte (buffer de lisis) con la inactivación simultanea por RNAasas, con lo cual el ARN viral es liberado a la solución. El ARN se une a la membrana QIAamp con la asistencia del ARN de transferencia (carrier) y los contaminantes: proteínas e inhibidores de nucleasas son eliminados durante el lavado con los tampones de lavado. El ARN purificado es eluido de la membrana usando un buffer de elución El Mini. Qiagen QIAamp Viral RNA es usado para la extracción de ARN viral de suero, plasma, cultivo celular, aspirado o hisopado respiratorio. Reactivos 1. Tampón Lisis AVL (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit., Cat. # 52904 / Cat. #52906) 2. Etanol (96-100%), Molecular Biology Grade, Sigma Cat.# E7023 3. Tampón lavado AW1 (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit., Cat. # 52904 / Cat. #52906) 4. Tampón lavado AW2 (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit., Cat. # 52904 / Cat. #52906) 5. Tampón elución AVE (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit., Cat. # 52904 / Cat. #52906) 6. Control positivo – cultivo de Virus 7. Control Negativo – Agua estéril (Sigma Cat.# W4502) Preparación de reactivos 1. Tampón de lisis. Trabajar en el área de extracción de ácidos nucleicos a. Verificar si el buffer de lisis AVL tiene precipitado. Si observa precipitado, incube el buffer a 80°C hasta que el precipitado se disuelva. b. Añadir 1 ml de buffer de lisis al tubo que contiene el ARN de transferencia (carrier), mezclar hasta disolver. c. Transferir el contenido al frasco de tampón de lisis y mezcle bien d. Registrar la fecha de preparación y almacene a 4°C El tampón de lisis AVL es estable hasta por 6 meses almacenado a 4°C 2. Tampón de lavado AW 1 a. Añadir 25 ml de etanol (95-100%) al buffer de lavado AW1 y mezcle bien. b. Rotular el frasco indicando que el alcohol fue añadido y registre la fecha de preparación c. Almacenar a temperatura ambiente El buffer de lavado AW 1 es estable hasta por 1 año Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 33 3. Tampón de lavado AW 2 a. Añadir 30 ml de etanol (90-100%) al tampón de lavado AW2 y mezcle bien d. Rotular el frasco indicando que el alcohol fue añadido y registre la fecha de preparación e. Almacenar a temperatura ambiente El buffer de lavado AW2 es estable hasta por 1 ano Recomendaciones • Todo el proceso de extracción de ácidos nucleicos debe realizarse en la cabina de bioseguridad • Las soluciones tienen acida de sodio como preservativo altamente toxico y puede causar explosión al contacto con plomo o cobre. • Usar guantes de látex durante todo el proceso de extracción de ácidos nucleicos. • Descarte los tubos y puntas en una bolsa para autoclave • El material contaminado con la muestra clínica debe descartarse en un recipiente con desinfectante. Equipo 1. Mezclador Vortex 2. Microcentrífuga 3. Reloj 4. Pipetas ajustable de 20-200 µl 5. Pipeta ajustable de 200- 1000 µl 6. Gabinete de bioseguridad Materiales 1. Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml libres de ARNasas/ADNasas 2. Tubos de microcentrífuga de 0,5 ml libres de ARNasas/ADNasas 3. Puntas de pipetas 20 µl con filtro libre de ARNasas/ADNasas 4. Puntas de pipetas 200 µl con filtro libre de ARNasas/ADNasas 5. Puntas de pipetas 1000 µl con filtro libre de ARNasas/ADNasas 6. Columnas (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit.) 7. Tubos colección (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit.) 8. Recipiente con desinfectante 9. Bolsas de autoclave Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 34 Procedimiento 1. Rotular 2 tubos de microcentrífuga de 1,5 ml por cada muestra clínica. Rotular 2 tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada control (uno positivo y uno negativo) y separarlo en dos gradillas. 2. Colocar en una gradilla 3 tubos de colección por cada muestra y control 4. Rotular una columna por cada muestra y cada control y colocarlos en la primera columna con tubos de colección 5. Añadir 560 µl de tampón de lisis AVL un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por cada muestra y controles y cerrar cada tubo para evitar contaminación cruzada 6. Añadir 140 µl de la muestra y controles en los tubos correspondiente. Cerrar cada tubo antes de moverse al tubo siguiente. Añadir los controles después de las muestras 7. Mezclar en el vortex por 15 segundos 8. Incubar a temperatura ambiente (15-25°C) por 10 minutos 9. Centrifugar los tubos por 10 segundos 10. Añadir 560 µl de etanol (956-100%) a cada tubo 11. Mezclar el vortex por 15 segundos 12. Centrifugar los tubos por 15 segundos 13. Transferir 630 µl del las muestras y controles ala columna correspondiente/tubo de colección 14. Centrifugar las columnas/tubo de colección a 8.000 rpm por 1 minuto 15. Transferir la columna a un nuevo tubo de colección y descartar tubo de colección con el filtrado en la bolsa para autoclave 16. Repetir los pasos 13-15 17. Añadir 500 µl de tampón de lavado AW1 A cada columna 18. Centrifugar las columnas/tubo de colección a 8.000 rpm por 1 minuto 19. Transferir la columna a un nuevo tubo de colección y descartar tubo de colección con el filtrado en la bolsa para autoclave 20. Añadir 500 µl de tampón de lavado AW2 A cada columna 21. Centrifugar las columnas/tubo de colección a 13.000 rpm por 3 minutos 22. Transferir la columna al tubo de microcentrífuga correspondiente y descartar tubo de colección con el filtrado en la bolsa para autoclave 23. Cuidadosamente añadir 60 µl de tampón de elución AVE a cada columna aplicando el tampón directamente a la membrana de la columna evitando tocarla. 24. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto y centrifugar a 8.000 rpm por 1 minuto 25. Separar el ARN en volúmenes de 20 µl en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml y almacenar a -20°C Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 35

II. RT RT-PCR PARA DETECCIÓN DE INFLUENZA A, H1N1 PANDÉMICA. PROTOCOLO DE LA OMS. La detección cualitativa de virus influenza A, influenza A suina y H1 pandémica en especimenes del tracto respiratorio de humanos, cerdos y cultivos celulares utilizando RT-PCR en tiempo real (rt RTPCR) fue diseñado por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos y Centro Colaborador de la OMS. Este protocolo puede o no detectar algunas cepas suinas H1. Este protocolo de rt RT-PCR ha sido optimizada utilizando un panel específico de oligonucleótidos partidores y sondas de hidrólisis (Taqman), el estuche Invitrogen SuperScript™III Platinum® OneStep Quantitative en los siguientes sistemas de termocicladores de tiempo real: – Applied BiosystemsTM(7000, 7300, 7500, etc.), – BioRad (iQTM o iQ5TM ) – Stratagene QPCR instruments (MX4000 MX3000 o MX3005) Especimenes aceptables Lavado bronco-alveolar, aspirados o lavados traqueales, nasofaríngeos, oro-faríngeos, hisopados nasales, nasofaríngeos y oro-faríngeos. Los hisopados deben ser de poliéster o dacron con palillos de plástico o aluminio. Serán rechazadas las muestras colectadas con hisopos de algodón y palillos de madera. También será motivo de rechazo las muestras que no han sido conservadas a 2-4°C o congeladas a -70°C Equipo 1. Gabinete de bioseguridad 2. Microcentrífuga 3. Vortex 4. Termociclador en tiempo real con formato de 96 cavidades. Reactivos 1. Estuche cuantitativo de RT-PCR de un paso con sondas de hidrólisis (e.g Taqman® kit Invitrogen SuperScript™III Platinum® One-Step).Quantitative Kit. (cat# 11732-020 or 11745- 100). 3. Agua destilada grado molecular (Libre de RNase y DNase) 4. Oligonucleótidos partidores (primers) delantero y reverso (40μM) 5. Sondas marcadas (10μM) 6. Controles positivos Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 36 Partidores y Sondas Secuencias 5’>3’ Concentración final Infl A delantero GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C 40 μM Infl A reverso AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA 40 μM Infl A1 sonda TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG 10 μM Infl AS delantero GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG 40 μM Infl AS reverso GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC 40 μM Infl A2 sonda CYA CTG CAA GCC CA”T” ACA CAC AAG CAG GCA 10 μM SH1 delantero GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA 40 μM SH1 reverso CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC 40 μM SH12 sonda CA GAA TAT ACA “T”CC RGT CAC AAT TGG ARA A 10 μM RnasaP delantero AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 40 μM RnasaP reverso GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 40 μM RnasaP1 sonda TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG 10 μM 1 Las sondas TaqMan® están marcadas en terminal 5'-con la molécula reportera 6- carboxyfluorescein (FAM) el quencher, Blackhole Quencher 1 (BHQ1) (Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA) en el terminal 3'. 2 Las sondas TaqMan® están marcadas en terminal 5'-con la molécula reportera 6- carboxyfluorescein (FAM) y quencher interno modificado en el residuo T con BHQ1, con una modificación en el terminal 3’ para prevenir la extensión con la Taq polimerasa. Materiales 1. Marcador de laboratorio punta ultrafino 2. Gradillas refrigeradas para tubos de 1.5 ml, de 0,2ml para soportes de 96 cavidades para reacción de PCR 3. Pipetas ajustables de 1- 20μl, 20- 200μl y puntas con filtro 4. Tiras de tubos de 0,2ml para PCR 5. Tiras de tapas para tubos 6. Tubos de micro centrifuga de 1,5ml libres de nucleasas estériles 7. Guantes sin polvo Procedimiento Recomendaciones 1. Mantener áreas separadas para realizar la reacción el manejo de ácidos nucleicos. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 37 2. Mantener equipos y materiales separados dedicados a las reacciones y manejo de ácidos nucleicos (pipetas microcentrífugas, puntas de pipeta, guantes batas de laboratorio. 3. Cambie de guantes entre muestra y cada vez que usted sospeche que estén contaminados. 4. Mantener tapados los tubos de las reacciones 5. Descontamine las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% o “DNAzap™” o “RNase AWAY®” para minimizar la contaminación de ácidos nucleicos Preparación de reactivos 1. Descongele los partidores (primers) y las sondas mezclar y centrifugar brevemente y colocar en un bloque refrigerado 2. Colocar la mezcla maestra y enzima en un bloque refrigerado. Descongelar el vial de reacción 2X mezclar y centrifugar brevemente Cada reacción de rt RT-PCR incluye: 1. ARN de las muestra es analizado con el siguiente grupo de iniciadores y sondas: a. Influenza A, b. Influenza A suina Universal, c. H1 suino pandémico, d. RNAsaP como control positivo interno para acido nucleico humano. 2. Control Negativo (sin templete) (CN) y control positivo (CP) para todo el grupo de iniciadores y sondas 3. Control negativo de muestras (CM) para validar el proceso de extracción y la integridad de los reactivos Preparación de la reacción 1. Rotular un tubo de microcentrífuga de 1.5 para cada iniciador/sonda 2. Determinar el número de reacciones (N) en cada corrida incluyendo CN, CP y CM. Es necesario hacer un exceso de la mezcla considerando los errores de pipeteo a. Si el numero n = 14 entonces N= n+1 b. Si el numero es mas de 15 N= n+ 2 3. Mezcla maestra de PCR: calcule la cantidad de cada reactivo que debe ser añadido para cada iniciador sonda de la siguiente forma: Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 38 Reactivo Volumen Agua libre de nucleasas 5,5 µl X N Partidor delantero 0,5 µl X N Partidor reverso 0,5 µl X N Sonda 0,5 µl X N SuperScript™ III RT/Platinum® Taq Mix 0,5 µl X N Mezcla maestra de PCR 2X 12,5 µl X N Volumen total 20ul µl X N 4. Después de añadir el agua, mezclar las mezcla maestras mediante pipeteo (no mezcle en el vortex) 5. Centrifugar 5 segundos para colectar el contenido en el fondo de tubo. Colocar el tubo en un bloque de refrigeración 6. Preparar una tira de reacciones o una placa de 96 tubos en un bloque de refrigeración 7. Dispensar 20 µl de cada mezcla en cada tubo de la reacción como se muestra a continuación: M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A B I As I As I As I As I As I As I As I As I As I As I As I As C IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S D RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 E I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A F I As I As I As I As I As I As I As I As I As I As I As I As G IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S IH1S H RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP 8. Añadir 5 µl de agua libre de nucleadas en los tubos de CN 9. Tapar todos los tubos de la reacción y llevarlos al área de extracción de ácidos nucleicos y colocarla en un bloque de refrigeración 10. Mezclar en el vortex por 5 segundos los tubos conteniendo el ARN de la muestras 11. Añadir 5 µl de cada muestra en los tubos rotulados de cada muestra como se indica a continuación: Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 39 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 B CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 C CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 D CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 E M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 CE CP F M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 CE CP G M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 CE CP H M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 CE CP 12. Tapar los tubos de cada columna después de añadir la muestra 13. Repetir los pasos 10-12 para todas las muestras 14. Añadir 5 µ del ARN control positivo 15. Centrifugar brevemente las tiras de tubos del la reacción y colocarla en el bloque de refrigeración Condiciones de amplificación El volumen de la reacción es 25 µl. Programar el termociclador de la forma siguiente: Transcripción reversa 50°C 30 minutos Inhibición de la Taq 92°C 2 segundos Amplificación por PCR 45 ciclos 95°C 15 segundos 55°C 30 segundos Interpretación 1. El CN no debe inhibir la fluorescencia por lo que no debe exhibir curvas a lo largo de la línea basal. Si esto ocurre con uno o mas partidores/sondas indica contaminación por lo tanto se invalida la reacción y debe repetirse. 2. Todas las muestras deben exhibir curvas de reacción RP a lo largo de la línea base o antes del ciclo 37 lo cual es indicativo de la presencia de suficiente ARN para el gene RNAasa humano indicando buena calidad del espécimen. Esta reacción puede o no pude estar presente en muestras de cerdos o muestras procedentes de cultivo celular o huevos embrionados 3. Las reacciones de control positivo para Infl. A, Infl. A Suino, H1 suino y RP deben exhibir curvas antes de los 40 ciclos. Si no ocurre se invalida la reacción y debe repetirse la reacción. 4. Si los controles cumplen con los requisitos se considera valida la reacción. Un espécimen es presuntivamente positivo para Influenza A/H1 si ambos Infl A y/o el respectivo subtipo H1 exhiben curvas por encima de la línea base dentro de los 40 ciclos 5. Cuando todos los controles cumplen con los requerimientos, un espécimen es considerado negativo si no exhibe curva por encima de la base en 40 ciclos. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 40 III. RT RT-PCR PARA DETECCIÓN DE INFLUENZA A, H5 AVIAR Y H7 AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD. PROTOCOLO DE RECOMENDADO POR LA OIE La detección cualitativa de virus influenza A, H5 y H7 de alta patogenicidad en especimenes del tracto respiratorio de humanos, aves domesticas y cultivos celulares utilizando RT-PCR en tiempo real (rt RT-PCR) fue diseñado por Spackman y Col. (2002). Ha sido optimizada utilizando un panel especifico de oligonucleótidos partidores y sondas de hidrólisis y el estuche de QIAGEN OneStep RT-PCR Este protocolo puede o no detectar algunas cepas aviares H5 y H7 de alta patogenicidad americanas o H5 y H7 de baja patogenicidad Equipo 1. Gabinete de bioseguridad 2. Microcentrífuga 3. Vortex 4. Termociclador en tiempo real con formato de 96 cavidades. Reactivos 1. Qiagen one step (cat # 210210 o 210212). Contenido del estuche: a. QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme (contains the QIAGEN products Omniscript Reverse Transcriptase, Sensiscript ReverseTranscriptase, and HotStarTaq DNA Polymerase) b. QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer,* 5x c. Q-Solution, 5x d. dNTP Mix, 10 mM each e. RNase-free water 1.9 ml 2 x 1.9 ml f. Instrucciones 1 2. Agua destilada grado molecular (Libre de RNase y DNase) 3. Oligonucleótidos partidores (primers) delantero y reverso 4. Sondas marcadas 5. Controles positivos Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 41 Especificidad Partidores y Sondas Secuencias 5’>3’ Concentración final Infl A M+ 25 delantero AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TCG 10 μM Inf A M - 124 reverso TGC AAA AAC ATC TTC AAG TCT CTG 10 μM Infl A1 Sonda + 64 FAM-TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA -TAMRA 0,3 μM H5 H5+ 1456 delantero ACG TAT GAC TAT CCA CAA TAC TCA G 10 μM H5 H5 - 1685 reverso AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC 10 μM H51 Sonda H5+1637 FAM- TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA-TAMRA 0,3 μM H7 H7 + 1244 delantero ATT GGA ACA GAG ACG CAA TG 10 μM H7 H7 – 1342 reverso TTC TGA GTC CGC AAG ATC TAT TG 10 μM H7 Sonda H7 1281 FRM-TAA TGC TGA GCT GTT GGT GGCA-TAMRA 0,3 μM 1 Las sondas TaqMan® están marcadas en terminal 5'-con la molécula reportera 6-carboxyfluorescein (FAM) y el quencher carboxymetilrodamina (TAMRA) en el terminal 3’ Materiales 1. Marcador de laboratorio punta ultrafino 2. Gradillas refrigeradas para tubos de 1.5 ml, de 0,2ml para soportes de 96 cavidades para reacción de PCR 3. Pipetas ajustables de 1-20 μl, 20- 200μl y puntas con filtro 4. Tiras de tubos de 0,2ml para PCR 5. Tiras de tapas para tubos 6. Tubos de micro centrifuga de 1,5ml libres de nucleasas estériles 7. Guantes sin polvo Recomendaciones de seguridad 1. Mantener áreas separadas para realizar la reacción el manejo de ácidos nucleicos. 2. Mantener equipos y materiales separados dedicados a las reacciones y manejo de ácidos nucleicos (pipetas microcentrífugas, puntas, guantes batas de laboratorio. 3. Cambie de guantes entre muestra y cada vez que usted sospeche que estén contaminados. 4. Mantener tapados los tubos de las reacciones 5. Descontamine las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% o “DNAzap™” or “RNase AWAY®” para minimizar la contaminación de ácidos nucleicos Procedimiento Preparación de reactivos Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 42 1. Descongele los partidores y las sondas mezclar y centrifugar brevemente y colocar en un bloque refrigerado 2. Colocar la mezcla maestra y enzima en un bloque refrigerado. Descongelar el vial de reacción 2X mezclar y centrifugar brevemente Cada reacción de rt RT-PCR incluye: 1. ARN de las muestra es analizado con el siguiente grupo de partidores y sondas: a. Influenza A, b. Hemaglutinina H5 asiática alta patogenicidad c. Hemaglutinina H7 alta patogenicidad 2. Control Negativo (sin templete) (CN) y control positivo (CP) para todo el grupo de iniciadores y sondas 3. Un control negativo de muestras (CM) para validar el proceso de extracción y la integridad de los reactivos Preparación de la reacción 1. Rotular un tubo de microcentrífuga de1.5 para cada partidor/sonda 2. Determinar el número de reacciones (N) en cada corrida incluyendo CN, CP y CM. Es necesario hacer un exceso de la mezcla considerando los errores de pipeteo a. Si el numero n = 14 entonces N= n+1 b. Si el numero es mas de 15 N= n+ 2 3. Mezcla maestra de PCR: calcule la cantidad de cada reactivo que debe ser añadido para cada partidor/sonda de la siguiente forma: Reactivo Volumen Concentración final Agua libre de nucleasas 5,75 µl X N Tampón 5X 5 µl X N 1X MgCl2 1,25 X N 3,75 mM/25 µl dNTP’s (10mM c/u) 1 µl X N 400 µM c/dNTP/25 µl Inhibidor de RNasa (13,3 U/ µl) 0,5 µl X N 6,6 U/25 µl Partidor delantero 0,5 µl X N 10 µM /25 µl Partidor reverso 0,5 µl X N 10 µM l/25 µl Sonda 0,5 µl X N 0,3 µM/25 µl Enzimas 2,0 µl X N - Volumen total 17ul µl X N Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 43 4. Después de añadir el agua, mezclar las mezcla maestras mediante pipeteando (no mezcle en el vortex) 5. Centrifugar 5 segundos para colectar el contenido en el fondo de tubo. Colocar el tubo en un bloque de refrigeración 6. Preparar una tira de reacciones o una placa de 96 tubos en un bloque de refrigeración 7. Dispensar 20 µl de cada mezcla en cada tubo de la reacción como se muestra a continuación: M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A B H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 C H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 E I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A I A F H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 G H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 8. Añadir 8 µl de agua libre de nucleadas en los tubos de CN 9. Tape todos los tubos de la reacción y llevarla al área de extracción de ácidos nucleicos y colocarla en un bloque de refrigeración 10. Mezcle en el vortex por 5 segundos los tubos conteniendo el ARN de la muestras 11. Añadir 8 µl de cada muestra en los tubos rotulados de cada muestra como se indica a continuación: M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 B CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 C CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 E M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 CP F M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 CP G M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 CP 12. Tapar los tubos de cada columna después de añadir la muestra 13. Repetir los 10-13 para todas las muestras 14. Añadir 8 µl del ARN control positivo Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 44 15. Centrifugar brevemente las tiras de tubos del la reacción y colocarla en el bloque de refrigeración Condiciones de amplificación El volumen de la reacción es 25 µl. Programar el termociclador de la forma siguiente: Transcripción reversa 50°C 30 minutos 94°C 15 minutes Amplificación Infl A 45 ciclos 94°C 2 segundos 60 °C 20 segundos Amplificación H5 40 ciclos 94°C 1 segundo 57°C 20 segundos 72°C 5 segundos Amplificación H7 40 ciclos 94°C 2 segundos 58 °C 20 segundos Interpretación 1. El CN no debe inhibir la fluorescencia por lo que no debe exhibir curvas a lo largo de la línea basal. Si esto ocurre con uno o mas partidores/sondas indica contaminación por lo tanto se invalida la reacción y debe repetirse 2. Las reacciones de control positivo para Infl. A, H5 y H7 deben exhibir curvas antes de los 40 ciclos. Si no ocurre se invalida la reacción y debe repetirse la reacción. 3. Si los controles cumplen con los requisitos se considera valida la reacción. Un espécimen es presuntivamente positivo para Influenza A/H1 o influenza A/H7 si ambos infl. A y/o el respectivo subtipo H exhiben curvas por encima de la línea base dentro de los 40 ciclos 4. Cuando todos los controles cumplen con los requerimientos, un espécimen es considerado negativo si no exhibe curva por encima de la base en 40 ciclos. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 45 8. DIAGNOSTICO SEROLÓGICO DE VIRUS INFLUENZA El diagnostico serológico de influenza en mamíferos y aves debe realizarse en dos pasos a menos que se conozca los subtipos circulantes en el país. El primer paso seria la detección de anticuerpos para cualquier virus influenza subtipo A y el segundo paso es determinación de anticuerpos contra el subtipo de H del virus en las muestras positivas detectadas en el primer paso. La detección de anticuerpos para cualquier virus influenza tipo A la reacción antígeno anticuerpo utiliza antígenos preparados de la proteína de Matrix (M) o la nucleoproteína (NP). La técnica inmunodifusión en agar (IDA) es la técnica mas ampliamente utilizada en la mayoría de los laboratorios veterinarios, es altamente específica y sencilla pero de sensibilidad limitada. La técnica inmuno enzimática (ELISA) es más sensible pero más compleja y requiere equipo de laboratorio. Varios estuches comerciales en formato indirecto o de captura están disponibles en el mercado pero su sensibilidad debe validarse para las distintas especies de animales. La detección de anticuerpos contra el subtipo de H se realiza por la técnica de inhibición de la hemaglutinación para lo cual se debe disponer en el laboratorio de antígenos de referencia al menos de los siguientes virus • Aviar: H5N1, H5N9, H7N7, H7N3, • Suino H1N1 clásico, H3N2 y H1N1 pandémico En caso de obtener muestras de suero positivas para las H antes mencionadas se debe determinar el tipo de N enviándola al los laboratorios de referencia de la OIE Algoritmo para el diagnostico serológico Negativo Positivo Suero problema Prueba de inmunodifusión en agar (Identifica anticuerpos para virus influenza tipo) Prueba de IHA (Identifica anticuerpos contra el subtipo de H) Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 46

9. TÉCNICA DE INMUNODIFUSIÓN EN AGAR (IDA) UTILIZANDO EL ANTÍGENO DE LA NP PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS PARA INFLUENZA TIPO A La técnica de IDA se basa en la migración del antígeno y el anticuerpo en un medio de agar. El medio tiene una alta concentración de sales de facilita la precitación del complejo antígeno-anticuerpo. Como todos los virus influenza A tiene proteínas de la matrix (M) y la nucleoproteína (NP), similares estos antígenos son utilizados para determinación de anticuerpos para influenza A para lo cual deben prepararse antígenos concentrados preparados para uno o ambos antígenos. Reactivos 1. Preparación de gel de agarosa al 1% o gel de agar al 8%: a. Cloruro de sódio (NaCl) …………….. 80 gr. b. Fenol 5gr c. Agarosa (Sigma II) 10 gr. o Oxoid agar Nº 112,5 gr. d. Agua destilada………………………… 1 lt Disolver el sodio y el fenol en agua destilada y ajustar el pH a 7,5 con NaOH 1N. Añadir la agarosa o el agar y disolver por calentamiento. Dispense en volúmenes de 20ml y deje solidificar a temperatura ambiente. 2. Antígeno de Influenza A Aviar para la IDA. 3. Antígeno de Influenza A porcina para la IDA 4. Antisuero de influenza A para IDA 5. Suero control positivo. Equipo y materiales 1. Lámpara o lupa 2. Molde: cortador de siete pocillos (uno central rodeado por 6 pocillos igualmente separados. Los pocillos tienen un diámetro de 5,3 mm y con una separación de 2,4 mm entre todos ellos). 3. Trampa de vacío 4. Mechero Bunsen 5. Placas de Petri o laminas de microscopio 2,3x 7,3 cm. 6. Cámara húmeda 7. Pipeta ajustables de 20-200 µl 8. Puntas de pipeta universales 9. Material de vidrio (frasco, pipetas serológicas etc.) Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 47 Procedimiento 1. Calentar el agar hasta fundir y dispense hasta un espesor de 2-3 mm en placa petri o laminas de microscopio. 2. Cortar en el agar orificios de 5 mm utilizando un molde y remover la agarosa utilizando la trampa de vacío. El patrón del molde debe permitir colocar el antígeno y el suero adyacentes 3. Añadir 50 µl de cada uno de los reactivos 4. Incubar a temperatura ambiente en una cámara húmeda cerrada durante 24-48 horas 5. Las líneas de precipitación se observan sobre una superficie oscura y una fuente de luz Interpretación Un resultado es positivo cuando una línea de precipitación se forma entre el antígeno positivo y la muestra de suero contiguos. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 48

10. TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS PARA SUBTIPO DE HEMAGLUTININA (H) El diagnostico serológico por IHA es un procedimiento útil cuando no se dispone de especimenes para el aislamiento viral o el RT-PCR. Se requiere de sueros pareados uno colectado en la fase aguda de la enfermedad y otra el la fase convaleciente (2-3 semanas del inicio de la enfermedad). El diagnostico se basa en el incremento del titulo de anticuerpos en 4 o mas diluciones entre ambos sueros. Un suero único no permite hacer el diagnostico debido a que los humanos y animales pueden contener anticuerpos previos para los subtipos de virus circulantes. Equipos, materiales y reactivos ver paginas 15-16 Antígenos virales de referencia: 1. H1a A/PR/8/34 (H1N1) 2. H1b A/FM/1/47(H1N1) 3. H1c A/swine/1A/30 (H1N1) 4. H1d A/swine/ 2009 (H1N1) Pandémica 5. H3a A/Hong Kong/68 (H3N2) 6. H3b A/equine/Miami/63 H3N2) 7. H3c A/duck/Ukraine/63 (H3N2) 8. H5 A/tern/so.Af/61 (H5N3) 9. H7a A/equine/Prague/56/ (H7N7) 10. H7b A/FPV/Rostock/34 (H7N1) Procedimiento I. Preparación de suspensión estandarizada de glóbulos rojos según se describe en la pagina 26 II. Tratamiento de sueros: 1. Tratar los sueros problema con RDE para eliminar inhibidores inespecíficos como se describe en la página 27 2. Adsorber los sueros con glóbulos rojos para remover aglutinas como se describe en la pagina 28 III. Titulación y re-titulación de los antígenos de referencia la técnica de hemaglutinación (HA) según se describe en la pagina 28 IV. Determinación de titulo de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 49 1. Rotular las microplacas con cada uno de los sueros problema a confrontar con cada uno de y los antígenos de referencia. 2. Añadir 25 µl de PBS (pH 7,2) en todos los pozos de la placa excepto en la primera línea (A1- A11) 3. Añadir 50 µl de PBS (pH 7,2) en los posos de la columna 12 (A12-H12) para control de glóbulos rojos 4. Añadir 50 µl de cada antisuero problema en los pozos correspondientes de la primera fila (A1-A11) 5. Preparar diluciones seriadas en base 1:2 transfiriendo 25 µl de antisuero desde la primera fila a los pozos siguientes hasta la columna 11. Descarte los últimos 25 µl de la línea H1- H12 6. Añadir 25 µl de antígeno de referencia conteniendo 4UHA/25 µl a cada una de las diluciones de los antisueros problema. 7. Mezclar bien e incubar por 15 minutos a temperatura ambiente (22-25°C) 8. Añadir 50 µl de suspensión estandarizada de glóbulos rojos y mezclar bien. 9. Incubar por 15-30 minutos a temperatura ambiente (22-25°C) 10. Registre el titulo IHA Interpretación: Si ocurre reacción antígeno/anticuerpo la hemaglutinación de los glóbulos rojos es inhibida. Utilizar los símbolos “+” para HA, “+/-“ parcial y “-“ para IHA. El titulo del suero problema es la dilución más alta que inhibe totalmente la hemaglutinación del antígeno de referencia. Procedimientos de Diagnóstico del Virus Influenza en Mamíferos y Aves Salud Pública Veterinaria – Centro Panamericano de Fiebre Aftosa - OPS/OMS 50

11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Department of communicable disease and response. Global influenza programme. WHO/CDS/CSR/NCS/2002 2. Erica Spackman, Dennis A. Senne, T. J. Myers, Leslie L. Bulaga, Lindsey P. Garber, Michael L. Perdue, Kenton Lohman, Luke T. Daum, and David L. Suarez. Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay for Type A Influenza Virus and the Avian H5 and H7Hemagglutinin Subtypes. J. CLIN. Microbiol. 2002, p. 3256–3260 Vol. 40, No. 9 3. WHO real time RT-PCR (rtRTPCR) protocol for detection and characterization of Influenza Pandemic H1 (version 2009) 4. WHO south Asian Region Guidelines on laboratory diagnosis of Avian Influenza SEE/CD/171 5. Avian influenza OIE Terrestrial Manual 2009 chapter 2.3.4: 1-20 6. Swine influenza OIE Terrestrial Manual 2009 Chapter 2.8.8: 1128 -1138 7. World Organization for animal health (OIE). Biosafety guidelines for handling pandemic H1N1 2009 influenza viruses in veterinary diagnostic Laboratories 2009 8. WHO laboratory biosafety guidelines for handling specimens containing avian influenza virus, 2009. 9. General guidelines for international shipment of samples for laboratory diagnosis OIE/FAO 2009 10. OFFLU teleconference –laboratory diagnosis of Pandemic H1N1 2009 in swine May 2009