viernes, 3 de junio de 2011

Glicoproteína del virus rábico: Estructura, inmunogenicidad y rol en la patogenia Andrés Ross B., Myriam Favi C. y Abel Vásquez V.

Glicoproteína del virus rábico: Estructura, inmunogenicidad y rol en la patogenia
Andrés Ross B., Myriam Favi C. y Abel Vásquez V.

Rev Chil Infect 2008; 25 (Supl): S 14-S 18

Rabies virus glycoprotein: Structure, immunogenicity and pathogenic role
Rabies glycoprotein is the only exposed protein which is inserted in the viral lipidic envelope. This 65-67 kda protein is a N-glycosilated transmembrane protein forming trimers on the viral surface. It has been identified as the major pathogenicity determinant, playing a role in the budding, viral axonal transport during infection, apoptosis and immune evasion. It is also the major antigen responsible for the protective immune response and it is been used in commercial recombinant vaccines. Its structure, antigenicity and pathogenic role have been well studied, identifying main antigenic sites that have the responsibility for virulence, cellular receptors attachment and epitope acquisition.
Key words: Rabies, glycoprotein, structure, antigenic sites, pathogenic role.
Palabras clave: virus rábico, glicoproteína, estructura, sitios antigénicos, rol patogénico


Introducción

El virus rábico es un virus ARN de hebra simple, de polaridad negativa y con un tamaño entre 11 y 15 kb. Pertenece a la familia de los Rhabdovirus, género Lyssavirus. Este género consiste en una colección de virus genéticamente relacionados, los que se han adaptado para replicar en el sistema nervioso (SN) de mamíferos

Se creía que sólo una especie viral era la responsable de causar enfermedad hasta
que se demostró la existencia de al menos seis nuevos genotipos pertenecientes a este género: virus del murciélago australiano, virus Mokola, virus del murciélago Lagos, Duvenage y virus del murciélago europeo tipo 1 y 2, todos los cuales producen una encefalitis clínicamente indistinguible de la rabia clásica y letal, a excepción del virus del murciélago Lagos.

El virión posee cuatro proteínas estructurales y una ARN polimerasa. La nucleocápside está formada por el ácido nucleico asociado a tres proteínas: N o nucleoproteína, P o fosfoproteína y L o ARN polimerasa ARN dependiente. La glicoproteína G (Gp-G) del virus rábico es la principal responsable de la patogenicidad viral así como también el antígeno responsable de la inducción de anticuerpos neutralizantes, los que neutralizan la infección in vitro y protegen contra la infección experimental; así mismo participa en la invasión, transporte y diseminación viral en el tejido infectado.

Estructura. En todos los rhabdovirus la Gp-G corresponde a una proteína trans-membrana tipo I N glicosilada, la cual forma trímeros de proyecciones (peplómeros) en la superficie viral. Aunque esta proteína es conservada en todos los Rhabdovirus, los distintos géneros comparten un bajo nivel de identidad en la secuencia aminoacídica. Se ha observado una notable conservación de los sitios de glicosilación, dominios antigénicos mayores y de los residuos de cisteína en los puentes di-sulfuro; su localización es única para cada género pero absolutamente conservada dentro del mismo, señalando con esto que los elementos centrales de la estructura de la Gp-G de los Rhabdovirus son conservados.
La Gp-G del virus rábico es una molécula de 65 a 67 kda, que forma aproximadamente 400 proyecciones de peplómeros en la envoltura viral, extendiéndose a 8,3 nm de la membrana lipídica. Está compuesta de 505 aminoácidos, aproximadamente, y posee de dos a cuatro sitios potenciales de N-glicosilación, de los cuales sólo uno o dos son dependientes de la cepa viral, e importantes en el correcto plegamiento de la proteí-
na.
Al analizar la estructura del gen de la proteína G . del virus rábico, los primeros 19 aminoácidos del extremo amino-terminal codificados por esta secuencia representan, probablemente, un péptido señal ya que son predominantemente hidrofóbicos y son posteriormente removidos de la estructura proteica. Un dominio hidrofóbico ininterrumpido de 22 aminoácidos es propuesto como el segmento trans-membrana, el que es fundamental en el correcto plegamiento del ecto-dominio. Desde este último extremo, se extiende una s cuencia de 44 aminoácidos, la que se señala como un
dominio hidrofílico citoplasmático, que interactuaría fuertemente con la proteína de la matriz viral (M) y las proteínas de la nucleocápside.
La Gp-G adquiere tres estados diferentes, ello involucra un re-arreglo estructural pH inducido, que modifica la capacidad fusogénica viral, determinando la exposición del dominio de fusión, el que interactúa y desestabiliza las membranas participantes, mecanismo por el cual la nucleocápside es liberada de la vesícula endocítica al citoplasma celular

Los tres estados corresponden a: estado nativo (N), detectado en la superficie viral a pH 7, responsable de la unión a receptores; estado hidrofóbico activado (A), el cual interacciona con la membrana; y conformación fusogénica inactiva (I), siendo cada uno de estos cambios estructurales totalmente reversibles al ajustar el pH.
Entre los pH 6,0 y 5,6 ocurren cambios de conformación dramáticos que involucran la pérdida de la estructura secundaria y terciaria. Bajo pH 6,7 el virus rábico
se vuelve más hidrofóbico permitiendo la interacción con la membrana, es óptimo para la fusión un pH 6,3. Esta última conformación es considerada el estado A.
Con pH de fusión, los sitios contenidos en el segmento del ecto-dominio que compromete los aminoácidos 103-179 se han identificado como los segmentos que
interaccionan de manera hidrofóbica con la membrana plasmática, estando en este segmento los aminoácidos histidina148 e histidina149, los que, al protonarse a un pH
ácido, producen el reordenamiento de la Gp-G, necesario para la interacción y fusión de membranas.
Se sugiere que el plegamiento de la proteína presenta un t1/2cercano a 20 minutos, con una eficiencia de 70 a 80%, produciéndose una interacción con chaperonas
del retículo endoplásmico. La adquisición de la estructura de los sitio antigénicos II y III sería un evento tardío en el plegamiento proteico, comparado a lo que
ocurriría en los otros segmentos de la proteína que se pliegan rápidamente
Se han establecido comparaciones entre la secuencia aminoacídica de la Gp-G . rábica, específicamente referentes al sitio antigénico II, con neurotoxinas curaromiméticas del veneno de serpiente, ambos ligandos potenciales del nACh-R. La
más grande similitud entre ambas ocurre en los residuos que se unen al nACh-R y los aminoácidos 189- 200 de la Gp-G rábica.

Rol en la patogenia. Esta proteína es responsable de la invasión al SN mediante la adhesión del virus rábico a receptores celulares como el receptor nicotínico
de acetilcolina moléculas de adhesión celular neuronales (CD56) y el receptor de neurotrofinas p 75 (NTRp75), los cuales median la endocitosis mediada por receptores, mecanismo por el cual el virus ingresa a la célula. Al ser la única proteína viral expuesta, es obvia y ha sido demostrada su participación en la fusión de membranas, mecanismo por el cual la nucleocápside es liberada de la vesícula endocítica al citoplasma celular. Asociado a esto, la Gp-G del virus rábico interacciona con la nucleocápside mediante su asociación con la proteína M, permitiendo una eficiente yemación de la progenie viral. Si bien el flujo axoplásmico viral se ha demostrado
ocurrir a través de la interacción de la fosfoproteína con la subunidad LC8 de la cadena liviana de dineina (un componente del complejo de transporte citoplasmático axonal), este transporte puede también ocurrir prescindiendo del sitio de unión de la fosfoproteína a la subunidad LC8

Así mismo, se ha demostrado que la sola presencia de la Gp-G rábica es capaz de otorgar neurotropismo a vectores lentivirales, involucrando a esta proteína en el transporte axoplásmico viral .
La apoptosis celular se reconoce como el principal mecanismo lesivo celular mediado por la Gp-G, siendo un factor importante en su desencadenamiento la acumulación de glicoproteína en la membrana citoplasmática

Se ha reportado que, en las cepas patógenas de virus rábico, la restricción en la expresión de la GpG contribuye a su patogenicidad. Evidencias in vivo e in vitro sugieren que la expresión de esta proteína es consistentemente inhibida en las neuronas infectadas con cepas patógenas de virus rábico, con lo cual se
evade la activación de la respuesta inmune innata, ya que el proceso de apoptosis desencadena una fuerte respuesta inmune

Evidencia in vitro e in vivo en la detección de ARNm de proteína G y nucleoproteína
del virus rábico en cepas atenuadas y altamente patógenas, han demostrado que los niveles de expresión para ambas moléculas de ARNm es similar, sugiriendo que la represión en la expresión de la Gp-G en cepas patógenas no es producto de una tasa de replicación viral distinta o una regulación de la transcripción a nivel de ARNm para esta molécula, sino de una modificación post-traduccional por degradación
de proteasas.
El desarrollo de mutantes deficientes en Gp-G ha demostrado que estas cepas virales realizan una infección restringida a las neuronas afectadas inicialmente,
sin diseminarse a otras neurona. Así mismo, el patrón de distribución en el SN de distintas cepas virales rábicas está dictado por la Gp-G y la cepa viral de la
cual deriva.

Antigenicidad e inmunogenicidad. La Gp-G del virus rábico es la responsable de la inducción de anticuerpos, los que neutralizan la infección in vitro y protegen contra la infección experimental.
La inmunogenicidad de la Gp-G depende de su conformación tridimensional, estructura secundaria y teriaria de la proteína, la que contribuye a la formación de sitios antigénicos y modificaciones post-transduccionales como la glicosilación de residuos de asparragina ; sin embargo, la utilización de un péptido de glicoproteína ha demostrado ser inmunogénicos.
La estructura antigénica de la Gp-G ha sido determinada con el uso de anticuerpos monoclonales específicos. Un sitio antigénico se define como la sobreposición de varios epítopes. Este es el caso de los sitios antigénicos II y III de la Gp-G del virus rábico. Otros epítopes, llamados anteriormente sitios I, IV, V, VI, G1
y sitio menor, han sido también identificados usando los mismos procedimientos

El sitio antigénico II esta . constituido por los residuos aminoacídicos 34-42 y
198-200 y el análisis de los fragmentos de la proteína ha evidenciado que los péptidos que contienen los aminoácidos 34-42 están unidos mediante puentes disulfuro con los péptidos de los aminoácidos 198-200. Así, se postuló que este sitio antigénico II resulta del plegamiento proteico que acerca dos regiones separadas del la Gp-G. Las mutantes con sustituciones en el sitio antigénico II, particularmente en el aminoácido 198, son menos patogénicas en animales adultos.
Los estudios identifican al sitio antigénico III de la Gp-G, como el mayor determinante de patogenicidad; mutaciones en este sitio reducen la diseminación viral y la unión a receptores celulares, La estructura del sitio antigénico III es distinta al sitio II pues su estructura es lineal, extendiéndose desde los
aminoácidos 330-340. En este sitio, la sola sustitución
del aminoácido arginina333 por glutamina o glicina, afecta la integridad del sitio antigénico y anula, por completo, la patogenicidad y neurovirulencia en el ratón
adulto inmunocompetente, sin importar el sitio de inoculación o dosis viral de desafío. Aunque esta mutación anula la patogenicidad, luego de realizar un pasaje viral por un ratón lactante, una única mutación se observó en el aminoácido asparragina194 a lisina194, lo cual se asoció a un incremento de la patogenicidad,
sin que esto se asociara a reversiones en la mutación glutamina333; sin embargo, otros residuos aminoací- dicos han sido asociados a neurovirulencia; tal es el
caso de los aminoácidos 164-303 en la cepa Nishigahara. Muy cercano a este sitio antigénico III, pero sin sobreponerse, se encuentra el epítope que consta de los
aminoácidos 342-343. Mutaciones en este sitio antigénico también han demostrado reducir la diseminación viral y el reconocimiento de receptores celulares
involucrados en el reconocimiento e internalización viral.
Es así como, hoy en día, la Gp-G del virus rábico es empleada en vacunas recombinantes utilizando vectores virales como virus canary pox (Purevax® Merial,
Inc.) y virus vaccinia (Raboral® Merial, Inc.) y en el desarrollo de vacunas ADN anti-rábicas en ratones, caninos, felinos y primates no humanos. Más aún, la utilidad de esta proteína viral en el diagnóstico rápido de la enfermedad y caracterización de la respuesta inmune vaccinal ha comenzado a ser abordada por distintos grupos de investigación, con el objeto de evitar tratamientos innecesarios tras una potencial
exposición, así como también para la determinación de anticuerpos neutralizantes anti-Gp-G. Los métodos actualmente existente para el diagnóstico tales como
RPC e IFD son costosos, utilizan virus vivo y requieren de mucho tiempo; sin embargo, se ha demostrado que el uso de esta proteína recombinante como antígeno diagnóstico en prueba de ELISA podría minimizar esta problemática

En cuanto a la titulación de anticuerpos neutralizantes, la utilización de esta proteína en el desarrollo de una prueba de ELISA para la detección de anticuerpos anti-Gp-G ha arrojado una sensibilidad y especificidad de 98 y 99%, respectivamente, indicando que esta prueba es tan sensible y específica como la actualmente recomendada por la O M S para la determinación de anticuerpos
neutralizantes, tanto en escenarios pre como postexposición. El rol de esta proteína viral, la única expuesta en la envoltura, en la diseminación e internalización celular viral y en la patogenia, convierten a este antígeno en un excelente candidato para el desarrollo de inmunobiológicos que permitan prevenir y diagnosticar la
enfermedad, así como también caracterizar la respuesta inmune en términos de anticuerpos neutralizantes en circunstancias pre o post-exposición, en un contexto que arroje ventajas comparativas a los métodos actualmente utilizados para tales fines en los ámbitos de seguridad, facilidad y rapidez en la entrega de result ados .
La Sección de Biotecnología e Inmunobiológicos del Instituto de Salud Pública de Chile ha amplificado mediante TR-RPC y clonado en vectores plasmidiales la Gp-G desde un aislado calle cepa L51. Su secuencia de ADN posee 99% de identidad, y 93% de identidad en su secuencia aminoacídica (datos no publicados) respecto de lo reportado en la literatura. Las perspectivas en el uso de este gen clonado nos permiten
proyectar nuestro trabajo en el desarrollo de nuevas alternativas de inmunobiológicos para el virus de la rabia.

Resumen

La glicoproteína del virus rábico es la única proteína viral expuesta, encontrándose inserta en la envoltura lipídica. Esta molécula de 65-67 kda corresponde a una proteína trans-membrana N-glicosilada que se pone en forma de trímeros en la superficie viral. Ha sido identificada como el mayor determinante de patogenicidad, participando además en procesos de yemación, flujo axonal del virion durante la infección, apoptosis y evasión de la respuesta inmune. Es también el principal antígeno inductor de la respuesta inmune protectora siendo utilizado en vacunas recombinantes comerciales. Su estructura, antigenicidad e implicancias en la patogenia han sido bien estudiadas identificándose los principales sitios antigénicos responsables de la patogenicidad, unión a receptores celulares y formación de epitopos.




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