haemominutum” A TRAVÉS DE PCR EN GATOS DE LA COMUNA DE
CHILLÁN
MEMORIA DE TÍTULO PRESENTADA A
LA FACULTAD DE MEDICINA
VETERINARIA PARA OPTAR AL
TITULO DE MÉDICO VETERINARIO.
ALEJANDRO JAVIER CRUZ ZULETA
CHILLÁN – CHILE
2005
U N I V E R S I D A D D E C O N C E P C I O N
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
Departamento de Ciencias Clínicas
DETECCIÓN DE Mycoplasma haemofelis y “Candidatus Mycoplasma
haemominutum” A TRAVÉS DE PCR EN GATOS DE LA COMUNA DE
CHILLÁN
Por
ALEJANDRO JAVIER CRUZ ZULETA
MEMORIA DE TÍTULO PRESENTADA A
LA FACULTAD DE MEDICINA
VETERINARIA PARA OPTAR AL
TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO.
CHILLÁN – CHILE
2005
II
DETERMINACIÓN DE Mycoplasma haemofelis Y “Candidatus Mycoplasma
haemominutum” A TRAVÉS DE PCR EN GATOS DE LA COMUNA DE
CHILLÁN.
Profesor Patrocinante ___________________________
Victoria Merino Muñoz
Profesor Asociado
Bioquímico
Magister en Ciencias
Profesor Guía ___________________________
Armando Islas Letelier
Profesor Titular
Médico Veterinario
Magister en Ciencias
Profesor Guía ___________________________
Rodrigo Tardón Brito
Profesor Instructor
Médico Veterinario
Profesor Guía ___________________________
Pablo Rivera Ramírez
Profesor Asistente
Médico Veterinario
DVM
III
Profesor Guía ___________________________
Álvaro Ruiz Garrido
Profesor Asistente
Médico Veterinario
Ph.D.
Director Departamento ___________________________
Ciencias Clínicas Guillermo Mora Riveros
Profesor Asociado
Médico Veterinario
Magister en Ciencias
IV
RECONOCIMIENTOS
Proyecto financiado por DIUC 202.151.013-1.0
V
TABLA DE CONTENIDOS
CAPITULOS PÁGINA
I INTRODUCCION ................................................................................. 3
II MATERIALES Y MÉTODOS............................................................... 17
III RESULTADOS .................................................................................. 20
IV DISCUSIÓN .................................................................................. 26
V CONCLUSIONES............................................................................... 31
VI REFERENCIAS ................................................................................. 32
VII ANEXO .................................................................................. 39
VI
INDICE DE TABLAS
TABLA Nº PÁGINA
En el Texto
1 Comparación entre los resultados del PCR, para ambas
especies de hemoplasmas felinos y los grupos de gatos
sospechosos............................................................................ 20
2 Comparación entre los resultados del PCR, para ambas
especies de hemoplasmas felinos y el volumen globular……. 24
3 Comparación entre los resultados del PCR, para ambas
especies de hemoplasmas felinos y el frotis sanguíneo………. 25
4 Comparación entre los porcentajes de los resultados del PCR y
el frotis sanguíneo, para ambas especies de hemoplasmas
felinos, con los grupos de gatos sospechosos…………………. 25
VII
INDICE DE FIGURAS
FIGURA Nº PÁGINA
En el Texto
1 Electroforetograma de ADN de Mycoplasma haemofelis ........ 21
2 Electroforetograma de ADN de “Candidatus Mycoplasma
haemominutum”....................................................................... 22
3 Electroforetograma comparando ADN de Mycoplasma
haemofelis con “Candidatus Micoplasma haemominutum” .... 23
En el Anexo
1A Frotis sanguíneo de eritrocitos que contienen hemoplasmas
felinos .................................................................................. 39
2A Micrografía electrónica de hemoplasma sobre la superficie de
un eritrocito.............................................................................. 39
3A Micrografía de transmisión electrónica de Mycoplasma
haemofelis................................................................................ 39
4A Frotis sanguíneo de eritrocitos que contienen hemoplasmas
felinos y cuerpos de Howell-Jolly............................................. 39
RESUMEN
DETECCIÓN DE Mycoplasma haemofelis Y “Candidatus Mycoplasma
haemominutum” A TRAVÉS DE PCR EN GATOS DE LA COMUNA DE
CHILLÁN.
DETECTION OF Mycoplasma haemofelis AND “Candidatus Mycoplasma
haemominutum” BY PCR ASSAY IN CATS OF CHILLÁN COMMUNE.
El objetivo del presente estudio fue la implementación y el uso de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para detectar si las especies de micoplasmas
hemotrópicos felinos (FHM), denominadas Mycoplasma haemofelis y “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”, existen en gatos naturalmente infectados de la
comuna de Chillán y determinar si hay relación con los signos clínicos. Para ello
se extrajo el ADN de 30 muestras sanguíneas, 28 desde gatos sospechosos y 2
desde gatos controles. Según los resultados, se detectó que un 13,3% (4/30) fue
positivo al PCR, de estos un 3,3% (1/30) fue positivo a Mycoplasma haemofelis,
un 10% (3/30) a “Candidatus Mycoplasma haemominutum” y ninguno con ambas
especies. Sólo un 10,7% (3/28) de las muestras diagnosticadas con FHM al frotis,
fue positiva al PCR. Del total de los gatos anémicos (4/30), un 25% (1/4) fue
positivo a Mycoplasma haemofelis, en contraste, de los gatos no anémicos (26/30)
un 11,5% (3/26), fueron positivos a “Candidatus Mycoplasma haemominutum”. Así
Mycoplasma haemofelis parece ser más patogénica que “Candidatus Mycoplasma
haemominutum”, aunque no se encontró significancia estadística. Este es el
primer estudio en Chile, que reporta el diagnóstico con PCR de ambas especies
de hemoplasmas en gatos.
Palabras claves: Haemobartonella felis, Mycoplasma haemofelis, “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”, micoplasmas hemotrópicos felinos, PCR.
2
SUMMARY
The objective of this study was the implementation and use of the polymerase
chain reaction (PCR) in order to detect if species of Feline Hemotrophic
Mycoplasma (FHM), named Mycoplasma haemofelis and “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”, exist in naturally infected cats from Chillán
commune and to determine if they are related to the clinical signs. For it the DNA
of 30 blood samples was extracted, 28 from suspect cats and 2 from control cats.
According to the results, detected that 13.3% (4/30) were positive to the PCR
assay, of these 3.3% (1/30) was positive to Mycoplasma haemofelis, 10% (3/30) to
"Candidatus Mycoplasma haemominutum" and none with both species. Only
10.7% (3/28) of the samples diagnosed with FHM to cytological examination were
positive to the PCR. Of the total of the anemic cats (4/30), 25% (1/4) was positive
to Mycoplasma haemofelis, in resistance, the nonanemic cats (26/30) 11.5%
(3/26), were positive to "Candidatus Mycoplasma haemominutum". Thus
Mycoplasma haemofelis seems to be more pathogenic than "Candidatus
Mycoplasma haemominutum", although was not found statistical significance. This
it is the first study in Chile that reports the diagnosis with PCR of both species of
hemoplasmas in cats.
Keywords: Haemobartonella felis, Mycoplasma haemofelis, “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”, Feline Hemotropic Mycoplasma, PCR.
3
I. INTRODUCCIÓN
Reseña histórica
La hemobartonelosis felina, o anemia infecciosa felina (FIA), es una enfermedad
bacteriana de los gatos domésticos que puede estar asociada con el desarrollo de
una anemia hemolítica severa (Sykes, 2003). La primera documentación de un
organismo epi-eritrocítico desde un gato anémico fue hecha en Sudáfrica y debido
a su semejanza a Eperythrozoon spp fue nombrado Eperythrozoon felis, aunque
no se realizó ningún otro estudio, posteriormente fue reconocido en los Estados
Unidos (Flint y Moss, 1953). El nombre de Haemobartonella felis fue sugerido
(Flint y McKelvie, 1955), ya que en contraste con Eperythrozoon spp,
Haemobartonella spp se adhiere firmemente al eritrocito y raramente se encuentra
libre en el plasma (Kreier y Gothe, 1976).
Etiología
Haemobartonella felis es una bacteria hemotrópica parásita, sin pared celular,
pleomórfica e incultivable (Tasker y Lappin, 2002). La carencia de pared celular es
en gran medida responsable de la tinción gram negativa y la nula susceptibilidad
frente a ciertos fármacos antibacterianos. Mide menos de 1 mm de diámetro
(Messick, 2003). Hay pequeños gránulos y algunas estructuras filamentosas que
se encuentran en su citoplasma. Estos hemoparásitos se adhieren, pero no
penetran la superficie del eritrocito (Figura 1A). Se encuentran en depresiones
bajas y profundas sobre la superficie eritrocítica (Figura 2A), con 15 a 25 nm de
separación entre el parásito y la membrana. Delicadas fibrillas parecen extenderse
desde el parásito (Figura 3A) para anclarlo a la célula huésped (Messick, 2004).
Dos cepas o variedades de Haemobartonella felis han sido descritas, comparadas
y determinadas genéticamente en gatos, la variedad de mayor tamaño se
denominó H. felis OH, y fue aislada en los estados de Florida y Ohio , en 1989 y
1996 respectivamente, y la de menor tamaño se denominó H. felis CA,
proporcionadas por la Universidad de Davis, California (Rikihisa et al, 1997).
4
Reclasificación. Una considerable confusión sobre la verdadera naturaleza de
Haemobartonella spp y Eperythrozoon spp ha persistido sobre los últimos 50 años.
Hasta hace poco tiempo, estas bacterias hemotrópicas eran clasificadas como
miembros de la familia Anaplasmataceae, del orden Ricketssiales, basado en su
pequeño tamaño, reacción gram negativa y aparente parasitismo obligatorio del
eritrocito. La supuesta transmisión vía artrópodos chupadores de sangre también
aportaba a esta clasificación. Sin embargo, debido a la carencia de pared celular y
flagelos, se sospechaba de una relación cercana a los Micoplasmas (Messick,
2003).
Recientemente, el análisis filogenético del gen 16S rRNA de cepas de
Haemobartonella felis mostró que H. felis Ohio (OH) y H. felis California (CA) son
sólo un 85% similares. Al comparar las secuencias con las de Eperythrozoon spp
se encontró una similitud que iba del 84 al 92%, siendo la variante California la
más relacionada con Eperythrozoon suis. La Haemobartonella spp y E. suis
formaron un grupo distinto relacionado cercanamente con Mycoplasma spp
(semejanza del 79 al 83%) comparado con Anaplasma marginale (semejanza del
72 al 75%). Debido a esto se sugirió que Haemobartonella spp fuera reclasificada
en el mismo género que la familia Mycoplasmataceae (Rikihisa et al, 1997).
Al igual que otro estudio filogenético que se realizó con Mycoplasma fastidiusum,
determinándose que formaba el linaje más emparentado con las bacterias
hemotrópicas: Haemobartonella spp y Eperythrozoon spp. Estos datos soportaban
fuertemente la idea de que estos hemoparásitos fueran reclasificados para reflejar
su afiliación filogenética real (Johansson et al, 1999).
Sobre la base de esta relación molecular y características fenotípicas como:
tamaño pequeño del parásito y su genoma, carencia de pared celular y flagelos,
resistencia a la penicilina y sus análogos y susceptibilidad a las tetraciclinas, los
géneros Haemobartonella y Eperythrozoon fueron removidos desde el orden
Ricketssiales (Neimark et al, 2001, 2002). Así fueron reubicados en la clase
Mollicutes en el género Mycoplasma (Foley et al, 2001; Neimark et al, 2001, 2002;
Messick et al, 2002), formando un nuevo grupo de hemoparásitos con una
5
capacidad patogénica antes desconocida en los Micoplasmas (Neimark et al,
2001).
Los nombres también han cambiado, así la Haemobartonella felis variante OH se
transfirió al género Mycoplasma como Mycoplasma haemofelis (Neimark et al,
2001, 2002) a su vez, Haemobartonella felis variante CA fue designada como
“Candidatus Mycoplasma haemominutum”, la designación de “Candidatus” fue
dada porque es incultivable in vitro y se mantiene pasando entre gatos in vivo
(Foley y Pedersen, 2001).
Debido a que estos microorganismos no tienen relación con Bartonella, y porque
hay otras causas infecciosas de anemia en gatos, como Cytauxzoon felis, Babesia
felis, y leucemia viral felina, se sugiere que el término “Hemobartonelosis felina” y
“anemia infecciosa felina” sean abandonados y reemplazados por “Micoplasmosis
hemotrópica felina” (FHM). De aquí en adelante, se les denominará como
micoplasmas hemotrópicos. El nombre trivial de “hemoplasmas” también ha sido
sugerido para estos microorganismos (Neimark et al, 2001).
Transmisión
Los hemoplasmas felinos se transmiten horizontalmente vía sanguínea, ya sea
debido al comportamiento, vía iatrogénica o por artrópodos hematófagos como las
pulgas. También se transmite verticalmente vía materna (Biberstein y Zee, 1994).
Esta enfermedad no presenta diferencia en cuanto a las razas, pero respecto al
sexo parece ser mayor en los machos de 1 a 3 años de edad, debido
probablemente por su estilo de vida más agresivo y callejero que las hembras
(Jensen et al, 2001).
Estudios preliminares muestran una transmisión experimental de “Candidatus
Mycoplasma haemominutum” desde gatos infestados a Ctenocephalides felis
(pulga del gato) y la presencia de ADN de “Cand. M. haemominutum” en huevos,
larvas y fecas de pulgas infectadas (Woods et al, 2005). Recientemente se
demostró que pulgas infectadas con M. haemofelis, pueden transmitir el parásito y
provocar enfermedad en gatos susceptibles (Lappin et al, 2003). En otro estudio,
hecho con pulgas, se encontró que un 43% de ellas estaba infectada con
6
hemoplasmas, correspondiendo, en todos los casos, a “Cand. M. haemominutum”
(Shaw et al, 2004).
Transmisión cruzada. El gen 16S rRNA de M. haemofelis es homólogo en un
99% con M. haemocanis, incluso algunos aislados de M. haemofelis son más
similares a M. haemocanis que a otros aislados de M. haemofelis, por lo que se
sugiere que son el mismo organismo infectando a diferentes especies de animales
(Brinson et al, 2001; Birkenheuer et al, 2002). Un primer reporte se realizó
identificando “Cand. M. haemominutum” desde pulgas de gatos (Ctenocephalides
felis) infestando a perros (Shaw et al, 2004). En otro estudio un micoplasma que
se aisló desde un perro esplecnotomizado, al análisis filogenético mostró un 98%
de similitud con “Candidatus M. haemominutum”, y sólo un 77% con M. haemofelis
y M. haemocanis (Sykes et al, 2004).
Patogenia
La patogénesis de FHM se ha dividido en cuatro fases: preparasítica, aguda, de
recuperación y de portador (Alleman et al, 1999). Luego de la inoculación
experimental con M. haemofelis, hay un período variable de 2 a 34 días
(comúnmente de 2 a 3 semanas) antes del inicio agudo de los signos clínicos, lo
cual corresponde a la fase preparásitica (Foley et al, 1998; Westfall et al, 2001).
Se observó también, la reaparición intermitente del hemoparásito en gatos
infectados crónicamente, con recaídas de anemia (Foley et al, 1998).
M. haemofelis puede desaparecer rápidamente desde los eritrocitos y luego
reaparecer, correlacionado con la rápida disminución del volumen globular. Este
fenómeno involucra rápidas fluctuaciones en la parasitemia que va desde un 90%
a ningún eritrocito infectado, esto puede ocurrir en menos de una hora, debido
posiblemente a que el hemoparásito tiene la capacidad de cambiar sus antígenos
de superficie resultando en una falta de adherencia, permitiendo así su liberación
desde el eritrocito. Esta falta de adherencia temporal, contribuiría a la
sobrevivencia de M. haemofelis y al desarrollo del estado de portador. El retorno
de esta capacidad puede ayudar en la iniciación de un nuevo ciclo de infección, de
7
tal modo que facilitaría la transmisión por vía de vectores hematófagos (Messick et
al, 2003).
Las dos especies que han sido reconocidas en el gato, también presentan
diferencias en su patogenicidad (Foley et al, 1998), Mycoplasma haemofelis, es
aparentemente más patogénica, mientras que “Candidatus M. haemominutum”
parece tener una baja virulencia (Jensen et al, 2001). Esta diferencia en la
patogenicidad puede depender de la dosis de hemoparásitos o de la ruta de
infección (Messick, 2004).
Puede haber predisposición a infección aguda por edad, enfermedad concurrente,
inmunosupresión o esplecnotomía, M. haemofelis causa anemia hemolítica severa
en gatos no esplecnotomizados (Messick, 2004). La formación de crioaglutininas
también se ha reportado en gatos con FHM (Zulty y Kociba, 1990).
Aunque M. haemofelis puede ser causa primaria de enfermedad, una anemia
hemolítica severa debido a enfermedades mieloproliferativas puede estar
relacionada con “Cand. M. haemominutum” en concomitancia con retrovirus, tal
como la inmunodeficiencia viral felina (FIV) y la leucemia viral felina (FeLV) u otras
enfermedades debilitantes (George et al, 2002; Harrus et al, 2002).
Recientemente se documentó el caso de un gato con linfoma, que era FeLV
negativo, en el cual se encontró anemia asociada a “Cand. M. haemominutum”
(De Lorimier y Messick, 2004).
La existencia de infección crónica muestra niveles bajos o transitorios de
hemoparásitos en el frotis sanguíneo, lo que resulta en un difícil diagnóstico.
La infección crónica con M. haemofelis también puede promover la transformación
neoplásica de los células hematopoyéticas en gatos FeLV positivos, sin embargo,
no se puede asumir que esta infección tenga o no consecuencias (Messick, 2003).
Hay que considerar también, que recientemente se ha demostrado que existen 75
genes específicos para Mycoplasma haemofelis, uno de los cuales codifica para la
enzima superoxido dismutasa (SOD), que parece ser única entre las demás
variedades de Micoplasmas (Berent y Messick, 2003).
Es posible que la infección con un tipo de hemoplasma felino pueda exacerbar la
enfermedad provocada por otro. Por ejemplo, los gatos crónicamente infectados
8
con “Cand. M. haemominutum” al ser inoculados con M. haemofelis, parecen
experimentar una enfermedad más severa y prolongada que en gatos inoculados
con M. haemofelis solamente (Westfall et al, 2001). La inoculación de un gato
portador de M. haemofelis con “Cand. M. haemominutum” no generó enfermedad.
Desafortunadamente, la inhabilidad para estandarizar el número de hemoparásitos
en inoculaciones experimentales, confunde las comparaciones de la severidad de
la enfermedad, el cual podría reflejar los efectos dosis dependiente (Sykes, 2003).
Respuesta inmune. La inmunidad a los micoplasmas hemotrópicos felinos no es
del todo conocida, pero se ha visto que los gatos en fase de recuperación pueden
ser susceptibles a reinfección (Flint et al, 1959). Se ha demostrado que los gatos
infectados con M. haemofelis no producen anticuerpos en reacción cruzada con
“Cand. M. haemominutum” (Foley et al, 1998), mientras que los gatos infectados
con “Cand. M. haemominutum” desarrollan anticuerpos que presentan una leve
reacción cruzada con M. haemofelis. En un estudio, la infección con “Cand. M.
haemominutum” protegió a los gatos contra M. haemofelis (Foley y Pedersen,
2001). Sin embargo, la infección con ambas especies a la vez ha sido
documentada experimental y naturalmente (Jensen et al, 2001; Westfall et al,
2001). La respuesta inmune de M. haemofelis se ha evaluado, identificando cinco
antígenos principales con masa molecular de 14, 45, 47, 52 y 150 kDa. Los más
inmunodominantes son el 14, 52 y el de 150 kDa, los cuales se denominan como
antígenos 1, 2 y 3 respectivamente. La potencial utilidad de estos antígenos para
el diagnóstico o inmunización debe ser investigada (Alleman et al, 1999).
9
Signos clínicos
La infección aguda con M. haemofelis se asocia con una parasitemia masiva de
los eritrocitos, causando una anemia hemolítica severa y a veces fatal. Se ha visto
que genera signos clínicos como letargia, anorexia, fiebre, además de la anemia
en gatos infectados natural y experimentalmente. Sin embargo, la pirexia es
intermitente y marcada cuando el número de hemoparásitos es alto en la sangre.
Ocasionalmente se observa esplenomegalia e ictericia, las cuales son
principalmente causadas por la hemólisis extravascular. La anemia es típicamente
regenerativa, mostrando anisocitosis y policromasia con un número incrementado
de reticulocitos. Pero, la severidad de la anemia depende del estado de infección,
y el volumen globular puede caer a menos del 20% en el pick de la parasitemia
(Berent et al, 1998; Messick et al, 1998).
La infección con M. haemofelis puede igualmente causar enfermedad en gatos
inmunocompetentes. Son signos comunes la depresión, inapetencia y
deshidratación, y algunos gatos muestran pérdida de peso. La anemia se
manifiesta en signos como debilidad, mucosas pálidas, taquipnea, taquicardia y
ocasionalmente síncope. Otras anormalidades pueden incluir murmullos
cardíacos. Algunos gatos pueden estar febriles y los moribundos con hipotermia
(Sykes, 2003).
En gatos saludables que se infectaron experimentalmente con “Cand. M.
haemominutum”, desarrollaron mínimos signos clínicos de enfermedad aguda y
cambios hematológicos insignificantes, traducidos en que la disminución del
volumen globular durante el curso de la infección, nunca fue inferior al rango
normal para el gato, aún así ocasionalmente algunos microorganismos fueron
detectados en los eritrocitos (Foley et al, 1998).
También se ha visto anemia no regenerativa, debido a que no había transcurrido
el tiempo suficiente para instaurar una respuesta regenerativa. En otros la anemia
es no regenerativa como resultado de la infección recurrente con FeLV, aunque
una anemia no regenerativa macrocítica y normocítica ha sido documentado en
gatos FeLV negativos infectados con FMH (Bobade, et al, 1988; VanSteenhouse
et al, 1995).
10
El recuento de los leucocitos puede ser normal, elevado o bajo. Las plaquetas
pueden estar incrementadas (Holzworth, 1956). El análisis bioquímico del suero
puede revelar niveles incrementados de alanino amino transferasa (ALT) y como
consecuencia de la hipoxia, hiperbilirrubinemia, azotemia pre renal e
hiperproteinemia en algunos gatos (Sykes, 2003).
Diagnóstico
Observación del frotis sanguíneo. El método más comúnmente usado para el
diagnóstico definitivo de micoplasmas hemotrópicos felinos es la identificación del
microorganismo sobre la superficie del eritrocito por examen microscópico de
frotis sanguíneos de buena calidad. Puede utilizarse diferentes variedades de la
tinción de Romanowsky, incluyendo Giemsa, May-Grunwald-Giemsa, Wright y
Wright-Giemsa (Tasker y Lappin, 2003).
El hemoparásito es típicamente encontrado alrededor de la superficie del eritrocito,
solo, en pares, o en cadenas cuando hay infección aguda, muy de vez en cuando
puede estar libre (Tasker y Lappin, 2003). En los frotis sanguíneos, la forma
grande es pleomórfica, puede variar de cocos a pequeños anillos y bastones, y a
veces en cadenas cortas de tres o seis organismos. Se comprobó recientemente,
mediante hibridización in situ, que estas estructuras correspondían a ADN de
Mycoplasma haemofelis (Berent et al, 2000). La forma pequeña aparece como
cocos de 0,3 mm de diámetro, aunque ambas formas no siempre pueden ser
distinguidas confiando sólo en el frotis sanguíneo (Tasker, 2002).
La preparación de múltiples frotis desde sangre fresca en un periodo de 24 horas
luego de la recolección, puede incrementar la oportunidad de obtener resultados
positivos. Altas concentraciones de EDTA pueden separar el hemoparásito de la
superficie del eritrocito dentro de un par de horas, haciendo la identificación
extremadamente difícil. Por lo tanto, parece prudente, preparar las muestras
inmediatamente luego de la recolección sin anticoagulante, o usando heparina, la
cual no tiene el efecto del EDTA (Alleman et al, 1999).
11
Serología. Los resultados de la prueba de Western immunoblott, mostraron que
algunos antígenos de hemoplasmas felinos son reconocidos luego de 14 días post
infección (Alleman et al, 1999). En un estudio con gatos inoculados
experimentalmente con ambas especies, los anticuerpos se detectaron
usualmente por inmunofluorescencia indirecta a los 21 días post infección y se
mantuvo por lo menos 6 meses, después que la enfermedad clínica se había
resuelto. Los anticuerpos se pueden detectar tanto en gatos infectados
subclínicamente como en gatos anémicos, así un resultado positivo no es
equivalente con la presencia de la enfermedad. El suero generado contra una
especie de micoplasma hemotrópico felino no detectó la presencia de la otra
especie, sugiriendo que existe la variación antigénica (Foley et al, 1998), ahora
esto puede jugar un rol en el desarrollo de parasitemia cíclica en gatos infectados.
Si una prueba de anticuerpo pudiera ser desarrollada para detectar sólo
anticuerpos contra la especie más patógena, podría tener un valor diagnóstico.
Las pruebas serológicas no están actualmente disponibles comercialmente
(Tasker y Lappin, 2003).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Que la enfermedad es causada
por hemoplasmas felinos, se basaba en una presunción, ya que la prueba
definitiva de que eran los agentes causales no había sido establecida, sobre todo
por la inhabilidad de cultivar el microorganismo y la presencia de portadores
asintomáticos (Berent et al, 2000).
Históricamente el diagnóstico se basa en la visualización de la bacteria sobre los
eritrocitos. La parasitemia transitoria en infección aguda y los episodios cíclicos en
gatos portadores complican el diagnóstico de la enfermedad. La verdadera
naturaleza del organismo y la prevalencia de la enfermedad se ha discutido,
porque hasta hace poco no se podía diagnosticar certeramente (Berent et al,
1998; Foley et al, 1998; Messick et al, 1998).
La necesidad de una prueba diagnóstica eficiente y confiable condujo a la
secuenciación de los genes 16S rRNA y al desarrollo de una prueba de PCR
12
especie específica (Rikihisa et al, 1997; Berent et al, 1998; Foley et al, 1998;
Messick et al, 1998).
El PCR ha sido usado para correlacionar la parasitemia con la enfermedad en
gatos infectados experimentalmente con M. haemofelis (Berent et al, 1998;
Messick et al, 1998).
Esta prueba es una poderosa y sensitiva técnica molecular que permite que un
pequeño número de fragmentos específico de ADN se amplifique
exponencialmente a niveles detectables. Tan sólo se necesitan 52
microorganismos en la sangre para detectarse vía PCR (Cooper et al, 1999).
El PCR se utiliza para amplificar directamente secuencias específicas de ADN en
una mezcla compleja, cuando se conocen los extremos de la secuencia. Este
método de amplificación tiene numerosas aplicaciones en investigación básica,
pruebas genéticas humanas y medicina forense. El ADN genómico se digiere con
una enzima de restricción hasta formar grandes fragmentos y luego se
desnaturaliza por calor a hebras simples. Al ADN desnaturalizado se le agregan
con exceso, dos oligonucleótidos sintéticos complementarios en los extremos
3´del segmento de ADN buscado y se disminuye la temperatura hasta 50-60 °C. El
ADN genómico permanece desnaturalizado, dado que las hebras
complementarias se encuentran en una concentración demasiado baja para
hallarse entre sí durante el período de incubación, pero los oligonucleótidos
específicos, en concentración muy elevada, se hibridan con las secuencias
complementarias del ADN genómico. Entonces, los oligonucleótidos hibridados
sirven como iniciadores para la síntesis de las cadenas de ADN, que comienzan
por el agregado de desoxinucleótidos y de una ADN polimerasa resistente a la
temperatura, como la proveniente de Thermus aquaticus (una bacteria que vive en
fuentes termales). Esta enzima denominada Taq polimerasa, es capaz de
extender los iniciadores a temperaturas de hasta 72 °C. Cuando se completa la
síntesis, toda la mezcla se vuelve a calentar (hasta 95 °C) para fusionar los dúplex
de ADN recién formados. Cuando se vuelve a disminuir la temperatura tiene lugar
una segunda ronda de síntesis, porque aún hay exceso de iniciador. Mediante
ciclos repetidos de síntesis (enfriado) y fusión (calentamiento) se amplifica
13
rápidamente la secuencia buscada. En cada ronda se duplica la cantidad de
copias de la secuencia entre los sitios de iniciador; en consecuencia, la cantidad
de secuencia buscada aumenta en forma exponencial (Lodish et al, 2002).
Así, en resumen el PCR es un proceso que consta de 3 pasos que forman un
ciclo, el que se repite un número determinado de veces, este proceso se lleva a
cabo en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna
las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el número
apropiado de ciclos (usualmente 30-40 ciclos). Un ciclo de PCR consiste en los
siguientes pasos:
1- Desnaturalización: se realiza por medio de calor (usualmente mayor a 90°C)
separa la doble hebra de ADN en 2 hebras sencillas rompiendo los enlaces
hidrógeno que une a las bases, mientras que los enlaces entre la desoxirribosa y
los grupos fosfatos permanecen intactos.
2- Unión (alineación): unión del partidor al objetivo, los partidores son secuencias
sintéticas cortas de ADN de una sola hebra que consisten de 20-30 bases. Son
específicos y delimitan la región del genoma del organismo de interés. Se incluyen
dos partidores en la reacción de la PCR, cada uno complementario de una de las
hebras de ADN que se separaron durante la desnaturalización. Usualmente, este
proceso se lleva a cabo entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y de la
secuencia de bases de los partidores. Esto permite la unión específica de los
partidores a su hebra complementaria.
3- Extensión: una vez que los partidores se unieron a sus secuencias
complementarias, se eleva la temperatura a 72 ° C y la enzima Taq ADN
polimerasa se usa para replicar las hebras de ADN. La Taq polimerasa comienza
el proceso de extensión en dirección 5’ a 3’ agregando los nucleótidos
correspondientes, obteniéndose la hebra complementaria de ADN.
Al final del primer ciclo de la PCR, hay dos dobles hebras de ADN idénticas a la
original, cada nueva hebra producida se denomina Amplicón.
Este ciclo de tres pasos (desnaturalización, alineamiento y extensión) puede ahora
repetirse muchas veces. Conforme la PCR continúa, se crean primero dos, cuatro,
ocho, y así sucesivas copias (n= número de ciclos), obteniéndose después de 30
14
ciclos 1.073.741.824 copias. Este proceso de la PCR también es llamado
amplificación debido a que la secuencia objetivo es copiada una y otra vez con el
objeto de hacer millones de copias. Ahora ya hay suficiente material genético para
detectar la presencia y la cantidad del patógeno (Roche Chile ltda, 2005).
Recientemente se ha desarrollado una prueba de PCR que puede detectar y
distinguir ambas especies de hemoplasmas felinos a la vez (Jensen et al, 2001).
El PCR mostró ser más sensitivo que la observación de frotis sanguíneo para la
detección de hemoplasmas felinos, según varios estudios. Uno de estos encontró
un 37,5 % positivo al frotis luego de la infección experimental, comparado con el
100% de resultados positivos con el PCR (Westfall et al, 2001). Además se ha
demostrado en un estudio realizado en Estados Unidos que un 19, 5% de gatos
normales y expuestos naturalmente (Jensen et al, 2001) y un 10% de gatos sanos
en un estudio en Reino Unido (Tasker et al, 2001) fueron positivos para FMH vía
PCR.
Actualmente se utiliza también el PCR en tiempo real (real-time PCR), el análisis
es rápido y sensible y es utilizado con éxito para supervisar la cinética in vivo de
los gatos infectados experimentalmente con cada especie. (Tasker et al, 2003a).
Tratamiento
Los micoplasmas hemotrópicos felinos son sensibles a tetraciclinas, la cual inhibe
la síntesis de proteína en procariontes. Tetraciclinas y oxitetraciclinas pueden
inducir pirexia en gatos y requiere tres dosis diarias, lo cual puede ser un problema
(Wilkinson, 1968). El derivado de tetraciclina preferido es la doxociclina, debido a
pocos efectos secundarios y a dosis menos frecuentes. La dosis recomendada es
de 5-10 mg/kg una vez al día. La terapia debe continuarse por 14 a 21 días
dependiendo de la respuesta al tratamiento. El PCR ha demostrado que aunque
las tetraciclinas son efectivas para el tratamiento de la anemia, no elimina el
agente causal (Berent et al, 1998; Foley et al, 1998). El macrólido azitromicina,
que se usa para el tratamiento de diversos tipos de micoplasmas asociados a
síndromes en humanos, no funciona en gatos (Westfall et al, 2001).
15
Un reciente estudio comprobó que enrofloxacino, una fluoroquinolona, es efectivo
en el tratamiento de la infección por micoplasmosis hemotrópica en gatos a dosis
de 5-10 mg/kg una vez al día (Dowers et al, 2002).
Un estudio realizado por Tasker et al (2004), utilizando real-time PCR, evaluó a
doxiciclina y enrofloxacino, comprobando la efectividad de ambos para reducir la
cantidad de micoplasmas hemotrópicos felinos.
Como la anemia inducida por hemoplasmas felinos, puede ser inmunomediada, se
indican los glucocorticoides en el tratamiento (VanSteenhouse et al, 1995).
Algunos autores recomiendan el uso de glucocorticoides sólo si en el inicio la
anemia es aguda y/o se presenta autoaglutinación (Carney y England, 1993). La
dosis recomendada de prednisolona es 2 mg/kg una vez al día, junto a terapia
antibiótica, con dosis decreciente sobre las 3 semanas. El valor de este
tratamiento no se ha evaluado cabalmente, sin embargo, los gatos con FMH
experimentalmente inducida, tienen respuesta a los derivados de tetraciclinas (con
o sin tratamiento de soporte) sin el uso de glucocorticoides (Berent et al, 1998;
Foley et al, 1998).
Cuidados de soporte incluyendo la transfusión de sangre entera pueden requerirse
en gatos con anemia severa. Los gatos toleran bien la anemia, pero si la anemia
es grave (hematocrito < 12%) o si el PCV ha caído rápidamente, la transfusión
puede ser necesaria. Las transfusiones de sangre felina sólo deben realizarse con
pruebas de cruzamiento del donante, para evitar reacciones adversas. Desde que
se sabe que la enfermedad se puede transmitir inoculando sangre infectada,
parece sabio recomendar un cuidadoso control de la infestación por pulgas para
disminuir los riegos de un gato de adquirir hemoplasmosis felina (Tasker y Lappin,
2002).
16
Hipótesis
H1: Las muestras sanguíneas extraídas desde gatos de la comuna de Chillán,
tienen una o ambas especies de micoplasmas hemotrópicos felinos.
H0: Las muestras sanguíneas extraídas desde gatos de la comuna de Chillán, no
tienen especies de micoplasmas hemotrópicos felinos.
Objetivo general
Detectar la presencia de especies de micoplasmas hemotrópicos felinos:
Mycoplasma haemofelis y “Candidatus Mycoplasma haemominutum” desde las
muestras sanguíneas de gatos con o sin signos clínicos de FMH en la comuna de
Chillán utilizando la técnica molecular del PCR.
Objetivos específicos:
1. Implementar la técnica del PCR para la detección de gatos infectados con
micoplasmas hemotrópicos felinos.
2. Determinar la relación entre los diagnósticos preliminares (frotis
sanguíneos) de hemoplasmosis felina con los resultados del PCR.
3. Determinar el porcentaje de gatos posiblemente infectados con
hemoplasmas felinos del total de muestras analizadas.
4. Relacionar el volumen globular con ambas especies de micoplasmas
hemotrópicos felinos.
17
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras sanguíneas
En el periodo que va entre Mayo del 2003 a Octubre del 2004, se obtuvieron 30
muestras de sangre de 1 ml cada una aproximadamente, en tubos con EDTA, de
gatos de la ciudad de Chillán, la mayoría desde el Hospital Clínico Veterinario de
la Universidad de Concepción, de otras clínicas y de dueños de gatos que
aceptaron participar en este estudio, en estos dos últimos las muestras se
transportaron refrigeradas hasta el departamento de Ciencias Clínicas. Antes de la
colección de las muestras, se determinó en los gatos el color de las mucosas,
estado de reacción al medio.
Volumen globular
En el laboratorio se determinó el volumen globular (VG), según lo descrito por
Harvey et al (2000), utilizando una centrífuga para microhematocrito (Boeco H-24,
Germany), y se expresó en porcentajes. Los gatos con VG > 24% fueron
considerados dentro del rango normal (24 a 45%), y con VG £ 24% fueron
considerados anémicos.
Examen citológico
Se hicieron los frotis sanguíneos con tinción de Giemsa (Chandler et al, 1990), se
observó el hemoparásito (100x en aceite de inmersión) para clasificarlos en gatos
con y sin evidencia citológica, es decir, frotis positivos y negativos a micoplasmas
respectivamente.
Clasificación. Los gatos con signos clínicos como mucosas pálidas o ictéricas,
letargia, anemia y frotis positivo o ambas se consideraron sospechosos de estar
infectados con FMH, los que no presentaban estos signos fueron clasificados
como grupo no sospechoso.
18
Extracción de ADN
Se utilizó 0,5 mL de sangre entera por muestra, siguiendo un protocolo de
extracción como el que se indica en el producto comercial DNAzol BD Reagent
de Invitrogen, para obtener el templado final de ADN, con la salvedad de que se
dispuso de agua ultra pura (libre de ARNasas y ADNasas) para la elusión final.
PCR
Los iniciadores (primers) que se utilizaron como blancos para el gen ribosomal
(rRNA) 16S dan 170 pares de bases (bp) como producto para Mycoplasma
haemofelis y 193 bp para “Candidatus Mycoplasma haemominutum”, estos fueron:
5´®3´ - ACG AAA GTC TGA TGG AGC AAT A y 5´¬3´ ACG CCC AAT AAA TCC
GGA* TAA T (los mismos que fueron diseñados y usados por Jensen et al, (2001).
Los primers fueron encargados a Invitrogen. Se comenzó preparando la mezcla
maestra (master mix) y se repartió en tubos que contenían 20 mL de mezcla final
de: 20 mM de buffer PCR pH 8,3; 3,5 mM de MgCl2 ; 0,3 mM de mezcla de
dNTP´s; 0,1 mM de cada primer; 1U de Taq polimerasa y agua ultra pura estéril en
cantidad suficiente para alcanzar el volumen final (20 mL). Luego se agregó 1 mL
de templado de ADN, uno por cada tubo.
La amplificación se realizó en un termociclador (MJ Research, Peltier Termal
Cycler PTC-200), con un protocolo de tiempo como se indica a continuación: 10
minutos de incubación a 20° C seguidos por 2 minutos de desnaturalización a 95°
C, luego 45 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95° C, 1 minuto de
alineación a 60° C, 30 segundos de extensión a 72° C, luego 7 minutos a 72° C y
finalmente se mantuvo a 4° C hasta el momento de la electroforesis. Esta se
realizó en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, por un tiempo de
20 minutos a 120 V. Se identificaron los controles positivos desde los mismos
templados de ADN aislados, también se usó un control negativo (agua ultra pura)
para monitorear contaminación. La identificación de los productos del PCR
(amplicones), tanto para M. haemofelis como para “Cand. M. haemominutum” se
hizo por comparación de tamaño con el control positivo y la escala de ADN
19
marcador de 50 bp (Invitrogen) en un Transiluminador de rayos UV (Modelo 15,
UVP), luego se fotografió los resultados.
Análisis estadístico
Sobre la base de los datos proporcionados por el PCR, estos se dividieron en los
siguientes grupos: gatos PCR positivos, dentro de éste, PCR M. haemofelis
positivos y PCR “Cand. M. haemominutum” positivos. Luego se compararon con
los gatos sospechosos de estar infectados y con los no sospechosos, después con
los resultados del volumen globular, vale decir, gatos anémicos y no anémicos y
por último con los resultados del frotis sanguíneo. Se utilizó el programa Epi Info
versión 3.3.2, año 2005 para la prueba del c2. Sin embargo, debido a los
resultados, se usó una corrección denominada Test exacto de Fisher, que debe
ser considerado cuando las cifras numéricas resultantes son menores que cinco
(5). El grado de significancia se definió en el valor P < 0,05.
20
III. RESULTADOS
Detección de hemoplasmas felinos a través de PCR
El PCR fue realizado con el ADN extraído desde 30 muestras sanguíneas; 28 de
las cuáles provenían de gatos sospechosos y 2 desde los gatos no sospechosos.
Estos resultados (Tabla 1), muestran un 3,3% (1/30) positivo a Mycoplasma
haemofelis, un 10% (3/30) positivo a “Candidatus” Mycoplasma haemominutum” y
ningún gato infectado con ambas especies; determinándose así un 13,3% (4/30)
de gatos positivos a FMH. Del grupo de los sospechosos se encontró que un
10,7% (3/28) fue positivo, y de estos, un 3,6% (1/28) lo era para M. haemofelis, y
un 7,1% (2/28) para “Candidatus M. haemominutum”. Sin embargo, no se encontró
diferencia estadísticamente significativa (P > 0,05).
Tabla 1. Comparación entre los resultados del PCR, para ambas especies de
hemoplasmas felinos con los grupos de gatos sospechosos (n=28) y no
sospechosos (n=2).
N° de gatos M. haemofelis (%)
“Candidatus M.
haemominutum” (%)
Total (%)
Sospechosos (28) 1 (3,6) 2 (7,1) 3 (10,7)
No sospechosos (2) 0 (0) 1 (50) 1 (50)
Total (30) 1 (3,3) 3 (10) 4 (13,3)
Valor P > 0,05.
En las Figura 1 se observa la banda de ADN de 170 bp que correspondería a
Mycoplasma haemofelis, en la Figura 2 la de ADN de 193 bp que correspondería a
“Candidatus Mycoplasma haemominutum” y en la Figura 3 la comparación entre
ambas bandas de ADN.
21
bp
350 -
200 -
150 -
100 -
A B C D E F G H I
- 170
Figura 1. Electroforetograma en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de
etidio, que muestra el producto amplificado por PCR de templados de ADN
extraídos desde sangre de gatos de Chillán. A- Escala de bases marcador (50
bp), B, C, D, E, F y G son muestras negativas a PCR para micoplasmas
hemotrópicos felinos, H- Mycoplasma haemofelis (170 bp), I- Control negativo.
22
200 -
100 -
350 -
bp
A B C D E F G
- 193
Figura 2. Electroforetograma en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de
etidio, que muestra el producto amplificado por PCR de templados de ADN
extraídos desde sangre de gatos de Chillán. A- Escala de bases marcador (50 bp),
B, C y D son muestras negativas a PCR para micoplasmas hemotrópicos felinos,
E- “Candidatus Mycoplasma haemominutum”, F- Control negativo, G- Control
positivo “Candidatus Mycoplasma haemominutum” (193 bp).
23
bp
200 -
150 -
100 -
350 -
A B C D E F G H I
- 193
- 170
Figura 3. Electroforetograma en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de
etidio, que muestra el producto amplificado por PCR de templados de ADN
extraídos desde sangre de gatos de Chillán comparando Mycoplasma haemofelis
y “Candidadtus Mycoplasma haemominutum”. A- Escala de bases marcador (50
bp), B, D, E, F y G son muestras negativas a PCR para micoplasmas
hemotrópicos felinos, C- Mycoplasma haemofelis (170 bp), H- Control negativo e I-
“Candidatus Mycoplasma haemominutum” (193 bp).
24
Resultados del volumen globular
Se obtuvo el hematocrito, previo al PCR, de las 30 muestras sanguíneas, de las
cuales 4 gatos (13,3%; 4/30) resultaron anémicos. De estos hay un 25% (1/4)
positivo a M. haemofelis. De los gatos no anémicos hay un 11,5% (3/26)
infectados con “Candidatus” M. haemominutum” (Tabla 2).
Al comparar estadísticamente los resultados se observa que no hay diferencia
significativa (P > 0,05), entre la presencia de ambas especies de Micoplasmas
hemotrópicos felinos y el volumen globular en los gatos de este estudio.
Tabla 2. Comparación entre los resultados del PCR, para ambas especies de
hemoplasmas felinos, y el volumen globular (rango normal: > 24 a 45%).
Volumen globular (n°) M. haemofelis (%)
“Candidatus” M.
haemominutum” (%)
Total (%)
£ 24% (4) 1 (25) 0 (0) 1 (25)
> 24% (26) 0 (0) 3 (11,5) 3 (11,5)
Total (30) 1 (3,3) 3 (10) 4 (13,3)
Valor P > 0,05.
Resultados del frotis sanguíneo
Se examinaron al microscopio, los frotis sanguíneos de todas las muestras antes
del PCR, 28 de estas (93,3%; 28/30) evidenciaron estructuras similares a
hemoparásitos en los eritrocitos y en 2 frotis (6,7%; 2/30) no se observaron tales
estructuras (Tabla 3). Al comparar los resultados obtenidos al examen citológico
con el resultado del PCR se observa que no hay diferencia estadísticamente
significativa (P > 0,05).
25
Tabla 3. Comparación entre los resultados del PCR, para ambas especies de
hemoplasmas felinos y el frotis sanguíneo.
Frotis
sanguíneo (n°)
M. haemofelis (%)
“Candidatus M.
haemominutum” (%)
Total (%)
Positivo (28) 1 (3,6) 2 (7,1) 3 (10,7)
Negativo (2) 0 (0) 1 (50) 1 (50)
Total (30) 1 (3,3) 3 (10) 4 (13,3)
Valor P > 0,05.
Un 10,7% (3/28) de los gatos sospechosos fue positivo tanto para el frotis
sanguíneo como para el PCR, además los gatos anémicos sólo se ubicaron dentro
del grupo de los sospechosos. Hay un gato no sospechoso (50%; 1/2) que resultó
positivo al PCR y negativo al examen citológico (Tabla 4).
Tabla 4. Comparación entre los porcentajes de los resultados del PCR y el frotis
sanguíneo, para ambas especies de hemoplasmas felinos, con los grupos de
gatos sospechosos (n=28) y controles (n=2).
Resultados (Frotis, PCR) Sosp (%) No sosp (%) N° de gatos (%)
Frotis (+) y PCR M. haemofelis (+) 1(3,6) 0 (0) 1 (3,3)
Frotis (+) y PCR M. haemominutum (+) 2 (7,1) 0 (0) 2 (6,7)
Frotis (+) y PCR (+) 3 (10,7) 0 (0) 3 (10)
Frotis (-) y PCR M. haemofelis (+) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Frotis (-) y PCR M. haemominutum (+) 0 (0) 1 (50) 1 (3,3)
Frotis (-) y PCR (+) 0 (0) 1 (50) 1 (3,3)
Frotis (-) y PCR (-) 0 (0) 1 (50) 1 (3,3)
Frotis (+) y PCR (-) 25 (89,3) 0 (0) 25 (83,3)
Total 28 (100) 2 (100) 30 (100)
Sosp= sospechoso, No sosp= no sospechoso, M. haemominutum= “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”.
26
IV. DISCUSIÓN
El presente trabajo es el primer reporte de diagnóstico de micoplasmas
hemotrópicos felinos a través de PCR realizado en Chile, cuyos resultados indican
que los gatos muestreados de la comuna de Chillán presentan en bajo porcentaje
ambas especies.
Como todas las pruebas diagnósticas, la interpretación de los resultados necesita
ser considerados a la luz de la información disponible del paciente, incluyendo la
anamnesis, hallazgos en el examen clínico y resultados de otras pruebas. Aunque
el PCR es muy útil, no está exento de limitaciones. Por ejemplo, su extrema
sensibilidad es también su gran limitación, un resultado falso positivo puede ocurrir
por la contaminación durante la recolección de las muestras sanguíneas o durante
el curso del desarrollo del PCR. Es importante que en el laboratorio se tomen
medidas relevantes para eliminar la contaminación y así asegurar que los
resultados positivos sean realmente positivos y no reflejo de la contaminación. La
extrema sensibilidad del PCR es un gran obstáculo para su uso rutinario como
prueba diagnóstica, ya que la contaminación con bacterias en cualquier paso de
este, puede resultar en una reacción falso positiva. Así, para la mejor detección se
utilizan tejidos no epiteliales, sangre y otros que puedan ser obtenidos
asépticamente. Por lo tanto, para reducir los falsos positivos, se acostumbra usar
controles negativos, de tal manera que si se detecta algún producto sobre éste,
debe ser considerado como potencial contaminación. Esta sensibilidad también
puede resultar en falsos negativos, que se dan en caso de que existan inhibidores
de la reacción, los que pueden incluir proteínas tal como la hemoglobina,
ADNasas que degraden el material genético extraído o problemas técnicos.
Realizar el PCR sobre muestras inapropiadas también puede causar falsos
negativos. Una teoría al respecto señala que pueden surgir cambios en la
secuencia de nucleótidos que imposibilite la unión del iniciador durante la etapa de
alineación, con lo que no podrá ser sintetizada una nueva hebra de ADN (Sellon,
2003).
27
En este estudio se determinó que un 13,3% fueron positivos al PCR para especies
de hemoplamas felinos, un 3,3% fue positivo para Mycoplasma haemofelis y un
10% para “Candidatus Mycoplasma haemominutum”. Comparando estos
resultados con el grupo sospechoso se determinó un 3,6% positivos a M.
haemofelis y un 10,7% positivos a “Candidatus M. haemominutum”.
Estos resultados son similares a un estudio con PCR hecho por Jensen et al
(2001), donde describe un 19,5% de gatos infectados con H. felis OH (M.
haemofelis) que aparentemente es más patogénica que H. felis CA (“Cand. M.
haemominutum”) debido a que un porcentaje significativo de los gatos
sospechosos tenían H. felis OH o ambas especies, no así los gatos controles.
Al considerar el volumen globular, se encontró un 13,3% por debajo del rango
normal para la especie, y de estos un 25% fue positivo al PCR que correspondió a
M. haemofelis. En contraposición un 86,7% resultó no anémico, y de estos un
11,5% fue positivo para “Candidatus M. haemominutum”, esto sugeriría, en este
estudio en particular, que la anemia severa está más relacionada con M.
haemofelis, y una ausencia de anemia se relaciona más con “Candidatus M.
haemominutum”, coincidiendo con un estudio realizado por Messick (2003), donde
reportó que alrededor del 25% de los gatos anémicos de Estados Unidos estaban
infectados con micoplasmas hemotrópicos y que usualmente involucraba a M.
haemofelis, sin embargo, en los gatos no anémicos infectados fue más común
“Cand. M. haemominutum”.
Foley et al (1998), asocia a M. haemofelis, con depresión, fiebre y anemia, y a
“Cand. M. haemominutum”, con síntomas leves o no observados. Jensen et al
(2001), encontró una diferencia significativa entre gatos infectados con M.
haemofelis o ambas especies y gatos anémicos, no así con gatos no anémicos.
Un estudio realizado en Japón por Watanabe et al (2003), empleando un nuevo
tipo de PCR de secuencia específica, denominado SS-PCR, el cual mostró que
más gatos con anemia moderada a severa estaban infectados con H. felis OH (M.
haemofelis). En tanto Lobetti et al (2004) en Sudáfrica, encontró que los gatos
PCR positivos para M. haemofelis mostraban anemia regenerativa y macrocítica,
además de monocitosis y trombocitopenia. En Canadá, Kewish et al (2004)
28
encontró que un 72% de gatos con anemia regenerativa fue positivo al PCR, un
66% para M. haemofelis y un 6% para “Cand. M. haemominutum”.
En Inglaterra, otro estudio con PCR, arrojó un 16,9% para FHM, un 1,4% para M
haemofelis y un 0,2% para ambas, aunque no se encontró relación entre el PCR y
las variables hematológicas medidas (Tasker et al, 2003b).
En este estudio, los gatos positivos a “Cand. M. haemominutum” no presentaron
anemia, esta baja o nula patogenicidad podría deberse a que no se determinó la
existencia de un agente patógeno concomitante, ya que no era el objetivo de este
estudio, considerando que recientes publicaciones describen que la coinfección de
“Cand. M. haemominutum” con Leucemia viral felina (FeLV) predispondría a
enfermedades mieloproliferativas y anemia severa (George et al, 2002), así como
también en ausencia de FeLV con linfoma en gatos seniles (De Lorimier y Tasker,
2004). La diferencia en la patogenicidad puede deberse a la divergente evolución
por parte de ambas especies (Tasker y Lappin, 2002).
Los resultados positivos no necesariamente significan que el agente aislado sea
la causa de la enfermedad. Asimismo, si no existen signos clínicos podría deberse
a que el agente esté causando una infección latente (Sellon, 2003).
Un PCR positivo debería ser interpretado en concordancia con la especie
identificada, los hallazgos hematológicos y los signos clínicos reportados (Tasker y
Lappin, 2002).
Sin embargo, al análisis estadístico, de este estudio en particular, no se encontró
una diferencia significativa, tanto para los grupos de gatos sospechosos y
controles, como para los anémicos y no anémicos con el resultado del PCR.
Con los resultados del frotis sanguíneo, se mostró un 93,3% de gatos con
estructuras similares a hemoparásitos en los eritrocitos, y de éstos un 10,7%
resultaron positivos al PCR, un 3,6% para M. haemofelis y un 7,1% para “Cand. M.
haemominutum”, en cambio, un 6,7% resultaron con frotis negativos, y de éstos,
un 50% fue PCR positivo para “Cand. M. haemominutum”, lo que indica que la
mitad de ellos resultó como falso negativo al frotis, sin embargo, debido al bajo
número de gatos controles, esto no puede considerarse concluyente.
29
Un alto porcentaje de frotis positivo también se encontró en trabajos realizados por
Lobetti y Tasker (2004), donde describen que un 100% de las muestras se
diagnosticaron con infección por hemoplasmas, y que después del PCR, un 32,1%
fue positivo para “Cand. M. haemominutum” un 6,4% fue positivo para M.
haemofelis y un 6,4% para ambas especies.
Los diagnósticos falsos positivos pueden determinarse cuando los artefactos
causan una fijación o secado incorrecto y estas manchas se confunden con el
microorganismo, por esta razón debe utilizarse una solución de teñido hecha en el
momento. Este precipitado se encuentra comúnmente sobre el plano de
observación de los eritrocitos, es más amplio y más densamente teñido que los
hemoparásitos. También puede existir humedad que se adhiere a las células
sanguíneas del frotis y se observan como artefactos refráctiles, estos tienden a
tener bordes irregulares y aparecen descoloridos cuando se observan los
eritrocitos. Además estos hemoparásitos deben distinguirse de otras inclusiones
eritrocíticas felinas como los cuerpos de Howell-Jolly (Figura 4A), que son
remanentes nucleares eritrocíticos, que pueden ser diferenciados de los
hemoplasmas felinos, por su mayor tamaño (alrededor de 1-2 mm de diámetro), y
de los cuerpos de Pappenheimer que son agregados de hierro acumulado y
aparecen como pequeños gránulos azules ligeramente teñidos (Tasker y Lappin,
2003). Se ha reportado que los métodos de Orange de acridina e
inmunofluorescencia directa son más sensitivos que el método estándar de
Romanowsky para demostrar la presencia de este hemoparásito (Berent et al,
1998). Sin embargo, ambas técnicas son limitadas porque se necesita de un
microscopio de fluorescencia (Tasker y Lappin, 2003).
Se sabe que la elección de los iniciadores es un factor crítico en el PCR (Sellon,
2003), aunque los iniciadores utilizados para el PCR de este estudio, son especieespecíficos,
sería necesario una secuenciación de los templados de ADN
extraídos desde las muestras sanguíneas, con la finalidad de demostrar la
identidad genética del hemoparásito en cuestión, al igual que estudios hechos en
Inglaterra (Tasker et al, 2001), donde la especie aislada mostró una homología
con “Candidatus Mycoplasma haemominutum” , asimismo en Australia (Clark et al,
30
2002), la especie aislada mostró una similitud del 100% con Mycoplasma
haemofelis. Otros estudios con PCR a nivel mundial, fueron comparados por
Tasker et al (2003c), quienes analizaron filogenéticamente las secuencias de
genes extraídos desde África, Asia y Europa, mostrando un 100% de similitud con
los especies aisladas en los Estados Unidos.
No se puede descartar la idea de que podría tratarse de una nueva especie, así
como una reciente publicación en Suiza, donde se reporta una tercera especie de
hemoplasma felino aislado desde un gato con anemia hemolítica severa a través
de real-time PCR, esta especie, al realizar el análisis filogenético mostró mas
relación con micoplasmas hemotrópicos de roedores como Mycoplasma coccoides
y Mycoplasma haemomuris (Willi et al, 2005).
Otro análisis propuesto sería la conjunción del PCR con otra prueba molecular
como lo es el análisis RFLP (Restriction fragment length polymorphism), esta
técnica se basa en el uso de enzimas de restricción específicas, que cortan
fragmentos de diferente extensión del templado de ADN y que al compararlos vía
electroforesis con otros templados pueden mostrar regiones o fragmentos
diferentes, característica conocida como polimorfismo (Sellon, 2003). Esto
facilitaría una identificación más estricta para ambas especies, Mycoplasma
haemofelis y “Candidatus Mycoplasma haemominutum”, tal como lo realizó
Criado-Fornelio et al (2003) en España, en donde se aplicó un seminested PCRRFLP,
resultando en un 30% positivos a hemoplasmas felinos, luego se secuenció
estos amplicones y se encontró un 66,6% positivo a M. haemofelis y un 33,3%
positivo a “Cand. M. haemominutum”.
31
V. CONCLUSIONES
1. Se implementó la técnica de PCR para detectar las especies de
micoplasmas hemotrópicos felinos, Mycoplasma haemofelis y “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”.
2. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los
resultados del frotis sanguíneo y la prueba de PCR.
3. Se encontró un 13, 3% de gatos positivos al PCR, un 10% a “Candidatus
Mycoplasma haemominutum”, y un 3,3% a Mycoplasma haemofelis, sin
embargo, no se determinó ambas especies a la vez.
4. En cuanto al volumen globular, los gatos anémicos sólo resultaron positivos
a Mycoplasma haemofelis en un 25%, en contraste, de los gatos no
anémicos, sólo resultaron positivos a “Candidatus Mycoplasma
haemominutum” en un 10,7%.
32
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