martes, 20 de marzo de 2012

ESTUDIOS DE MYCOPLASMA EN ANIMALES DE CHILE (1967 - 2000) Patricio Berríos Etchegaray. 2012

         Mycoplasma y bacterias semejantes  han sido clasificados en el filo Firmicutes que consta de
         bacterias Gram positivas como   Clostridium, Lactobacillus y Streptococcus. Los miembros de  
         Mollicutes  actualmente están organizados en cuatro órdenes: Acholeplasmatales, 
        Anaeroplasmatales, Entomoplasmatales  y  Mycoplasmatales. El orden Mycoplasmatales contiene
        una sola familia,  Mycoplasmatacea, que contiene dos géneros: Mycoplasma y   Ureaplasma.

         Primeros estudios sobre mycoplasmosis en Chile

Los estudios iniciales sobre mycoplasmosis en animales en Chile se remontan al año 1967 y se realizaron en el laboratorio de investigación de la Cátedra de Enfermedades Infecciosas de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile dirigido por el Dr Emiliano Armijo Rojo y por la tecnóloga alemana Sra Lotti Bürger A.

Considerando que la llamada "Enfermedad Crónica Respiratoria era causada por Mycoplasma gallisepticum, el primer trabajo sobre mycoplasmas aviares se realizó entre 1967 y 1969 como tesis de Erika Gesche Robert: "Estudio microbiológico de aves afectadas de Complejo Respiratorio Crónico", dirigida por el Dr Germán Berkhoff M. Para ello se estudiaron 34 muestras de trozos de tráquea y exudado traqueal, además de sacos aéreos y exudados. Obteniéndose 16 muestras positivas  con un total de 21 cepas de mycoplasmas desde las muestras de tráquea (70%). La detección de mycoplasmas  coincidió con aislamiento viral (virus laringotraqueitis infecciosa aviar y virus de la Enfermedad de Newcastle),  y aislamientos de Pasteurella multocida y Haemophillus gallinarum (Gesche, 1968).


En 1975 se investigó la presencia de mycoplasma en 29 muestras de aves obteniéndose 20 aislamientos primarios; de las 12 cepas de origen aviar, 8 de ellas correspondieron a Mycoplasma gallinarum y 4 a Mycoplasma gallisepticum (Martínez, 1975).

El proyecto inicial de investigación sobre mycoplasmas fue realizado en la Cátedra de Microbiología de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile y se refirió a "Aislamiento y tipificación de mycoplasmas de origen bovino". Proyecto SA-B4 (1969-1970). Comisión de Investigación. Facultad de Ciencias Pecuarias y Medicina Veterinaria. Universidad de Chile. Investigador responsable: Patricio Berríos E.

 El primer trabajo publicado sobre mycoplasmas en bovinos se refirió a la detección de mycoplasmas en
el tracto genital de ganado bovino de la zona Central de Chile, en un 41,7% de muestras de semen. 
Se aisló M. bovigenitalium semejante a la "cepa P" patógena y  M. agalactiae var bovis  (Berríos y Cruz, 1969).

Posteriormente a estos hallazgos se aisló mycoplasmas de diferentes muestras de origen bovino  tales como
 exudado vaginal, fetos abortados, exudado nasal y pulmones.

Estudios sobre aborto bovino asociado a mycoplasmas. En bovinos se describían dos tipos seroló-
gicos de mycoplasmas designados como "P" patogénico, y "S" saprofítico (Edward, 1950). Las cepas
 "P" fueron aisladas de animales con cervicitis, salpingitis y vaginitis. La cepa "P" corresponde a M. 
bovigenitaliun, y la cepa "S"  es el M. laidlawii que no requiere suero para su aislamiento ni 
de medios enriquecidos.

Se analizaron 30 muestras de fetos abortados utilizando el feto entero o solamente el estómago.
 Los fetos tenían entre 2 y 6 meses de edad, hijos de vacas de 5 años y tercer parto; estas 
vacas no tenían antecedentes de abortos anteriores o de enfermedades genitales. Las muestras 
de los fetos de las madres fueron negativas a enfermedasdes que suelen producir aborto.


Se aislaron 3 cepas de mycoplasmas. No producían "film and spot". No crecían en medios sin suero. A 22º C
 no crecen y a 30º C lo hacían lentamente. Producían hemolisis alfa de eritrocitos de equinos o bovinos. 
Fermentaban la glucosa y fructuosa pero no la lactosa.  No eran saprofíticas, pero no fue posible determinar 
si eran patógenas y causar aborto o vulvovaginitis granular. Una de las cepas (AB20) se envío al 
"Wellcome Research Lab" en Inglaterra y no pudo ser clasificada dentro de las especies conocidas 
provenientes de bovinos  (Jarpa, M., P. Berríos, C. Amwandter, J. Bobrick. 1971).

En 1974 se estudiaron 30 cepas de mycoplamas aisladas de semen bovino, descartándose inicialmente que fueran formas L.  Diversas características tales como producción de "film and spot", crecimiento en medios sin suero, requerimientos de temperatura (22, 28 y 30º C), hemolisis de eritrocitos de equino, de gallina, cobayos, ovino y conejo, así como la fermentación de hidratos de carbono: glucosa, lactosa, fructuosa, maltosa sacarosa, galactosa y manita, coincidieron con las principales características descritas para Mycoplasma bovigenitalium. Dos cepas fueron tipificadas como M. agalactiae.  Como controles se utilizaron cepas ya caracterizadas: M. bovigenitalium, M. laidlawii y M. gallisepticum (National Institute of Health. Bethesda USA). Otras cepas fueron la cepa "Uretra" de origen humano (B. Gilabert), una cepa (3507) proveniente de gallinas con Complejo Respiratorio Crónico, y otra (cepa 4997) de un perro afectado con distemper o moquillo canino. Todas las cepas fueron clonadas al menos dos veces antes de su estudio.   El tamaño de las colonias osciló entre 150  y 700 micras.  Sólo las cepas de M. bovigenitalium produjeron "film and spot". Sólo la cepa M. laidlawii creció en medio sin suero. Todas las cepas en estudio crecieron a 20 y 28º C, sólo la cepa  M. laidlawii creció a 22º  C. Todas las cepas produjeron hemolisis de eritrocitos. Ninguna cepa fermentó la lactosa, galactosa y mannita. Las cepas de M. bovigenitalium no fermentaron los hidratos de carbono. Los sueros anti mycoplasmas reaccionaron solamente solamente frente al antìgeno homólogo, presentando entre 2 y 4 bandas de precipitación. Las 30 cepas en estudio sólo reaccionaron frente al suero anti M. bovigenitalium (Berríos y Sánchez, 1974).

En 1975 se estudiaron 36 muestras de semen bovino, obteniéndose 24 aislamientos primarios, de las cuales 8 se identificaron como Mycoplasma bovigenitalium y el resto como Mycoplasma sp.  Los resultados de los estudios culturales de las cepas en estudio fueron concordantes con los anteriormente realizados  por Berríos y Sánchez,1974 (Martínez, 1975).

En 1976, se describe el hallazgo de 9 aislamientos primarios de Mycoplasma spp desde un total de 50 muestras de exudado vaginal de  266 vacas con vulvovaginitis infecciosa  bovina (Herrera, 1976).

En el mismo año se investiga la presencia de Mycoplasma en afecciones del tracto respiratorio en ovinos. Para ello se estudiaron 50 muestras de secreción bronquial obteniéndose 31 aislamientos de mycoplasma, y 50 muestras de pulmón con 33 aislamientos de mycoplasmas, de los cuales 8 se identificaron como Mycoplasma ovipneumoniae (Zúñiga, 1976).

En 1977 se realiza un estudio sobre mycoplasmas en el tracto genital del toro, en 75 muestras de vesículas seminales se obtuvieron colonias de mycoplasma en 8 de ellas luego de 2 y 8 pasajes en medios de cultivos, corespondiendo a hallazgos anatomopatológico principalmente a leve aumento del tejido conjuntivo intersticial, y a fibrosis del tejido intersticial y a estasis venosa. En 15 muestras de cola de epididimo se detectaron 7 aislamientos primarios de mycoplasmas luego de 1 a 4 pasajes en medios de cultivos. En 9 muestras de vesículas seminales se obtuvieron resultados positivos a mycoplasmas. De 4 cepas aisladas 2 correspondieron a Mycoplasma bovigenitalium y 2 a Acholeplasma laidlawii (Creuz, 1977).

 En 1977 se investigó la presencia de mycoplasma en 40 muestras de secreción uterina de vacas afectadas de algún grado de metritis obteniéndose 9 aislamientos primarios de mycoplasmas. De una de las muestras positivas se aisló dos tipos de diferentes de mycoplasmas. En total se identificaron 4 cepas como Mycoplasma bovigenitaliun, 5 como Mycoplasma laidlawii y una como Acholeplasma laidlawii.

Con respecto al antibiograma realizado, las cepas descritas fueron sensibles principalmente a oxitetraciclina y tetraciclina. Una cepa fue resistente a todos los antibióticos utilizados (Lagos, 1977).

En perros provenientes de la región Metropolitana se detectó la presencia de Mycoplasma spp en procesos broncopulmonares recidivantes afectados de distemper canino (Abalos y Berríos, 1980.

En un estudio realizado en cerdos desde 20 animales se obtuvo un total de 37 aislamientos de mycoplasmas. De 25 muestras pulmonares de cerdos que presentaban lesiones de neumonía enzoótica se aislaron 36 cepas de mycoplasmas. Al teñirse  las colonias por el método de Dienes  adquirieron una coloración azul verdosa. Con el método de fijación en agua caliente, después de la coloración con Giemsa, las colonias exhibían innumerables microorganismos pleomórficos elementales ubicados entre finos filamentos ramificados, descritos en la literatura como mycoplasmas. En la prueba de reducción del cloruro de Tetrazolio, 27 cepas lo redujeron, 4 cepas de Mycoplasma hyorhinis lo hicieron débilmente, mientras que 22 cepas de M. hiorhinis y una cepa de Acholeplasma sp lo redujeron en forma neta. Cuarenta y seis cepas (30 cepas de M. hyponeuoniae y 16 de M. flocculare  no redujeron el cloruro de Tetrazolio. La identificación mediante antisueros específicos indicó que 30 cepas correspondían a M. hypopneumonia, 16 a M. flocculare y 26 a M. hyorhinisM. hyponeumoniae se aisló en una muestra de exudado nasal y en 7 pulmones con lesiones de neumonia enzoótica, mientras que no se aisló desde los cerdos que presentaban pulmones aparentemente sanos. M. flocculare se aisló desde exudado nasal, exudado traqueal y pulmón. En pulmones aparentemente sanos se aislaron 3 cepas de M. flocculare. Cuatro cepas de M. hyorhinis se aislaron desde cerdos con lesiones de neuminia enzoótica, y 7 cepas desde aninales con pulmones aparentemente sanos. Estadísticamente se determinó que solamente M. hipopneumoniae presentaba una relación altamente significativa (p < 0,001) entre su aislamiento desde pulmones y la presencia de lesiones (Alvarado, 1980).


En un estudio realizado en cervix y semen de equinos, en 80 muestras del cervix de yeguas se obtuvieron 16 positivas a mycoplasma (20%) y de los 19 potros 9 fueron positivos (47%) (Scheidegger, 1980).  Al estudiar la relación entre la presencia de mycoplasmas con cuadros de reabsorción embrionaria, se encontraon 10 yeguas positivas en un total de 28;  siete de ellas presentaron cuadros de reabsorción embrionaria, y una abortó a los 7 meses de gestación, mientras que en la 18 yeguas negativas solo 2 presentaron reabsorción embrionaria. Los 3 potros sementales del haras fueron positivos a mycoplasmas.  En las pruebas bioquímicas realizadas con las cepas de mycoplasma obtenidas se detectó que todas fueron capaces de utilizar glucosa bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas, además todas fueron negativas en su capacidad para hidrolizar arginina y urea. Se observó reducción del cloruro de Tetrazolio y reducción del azul de Metileno en dos cepas. Todas las cepas redujeron el telurito de potasio. No se detectó hidrolisis de esculina. Todas las cepas en estudio  tuvieron una actividad  fosfatasa positiva y producían hemolisi de eritrocitos ovinos. Con el fin de realizar pruebas serológicas se prepararon antisueros inmunizando conejos con las cepas M. genitalium y A. laidlaii, los que mediante la prueba de inmunofluorescencia presentaron títulos entre 80 y 160.  Mediante la prueba de inhibición del desarrollo por antisueros específicos 15 cepas aisladas de cervix y 8 de semen fueron tipificadas como M. equigenitalium, y las restantes como A. laidlawii al ser inhibidas por el antisuero específico. Los resutados obtenidos al emplear la técnica de inmunofluoresencia con colonias de mycoplasmas fijadas en agua caliente coincidieron totalmente con los obtenidos con la prueba de inhibición del desarrollo. No se observó reacciones cruzadas entre los antisueros específicos y las cepas heterólogas. las colonias de mycoplasmas teñidas con el antisuero homólogo conjugado presentaban una típica fluorescencia amarillo verdosa, mientras que las colonias teñidas con un antisuero heterólogo presentaban una leve autofluorescencia de color azul morado. El análísis estadístico reveló diferencias significativas en cuanto a reabsorciones entre el grup de yeguas positivas a mycoplasma y el grupo de yeguas negativas. No se detectaron diferencias significativas entre las características del semen del grupo de potros positivos a mycoplasmas y el grupo de potros negativos. No se detectó asociación entre la presencia de mycoplasmas y el aislamiento de bacterias patógenas  (Scheidegger y Berríos, 1982).


Meneses (1984) realiza una investigación dirigida por la Dra Marta Rivas R. sobre mycoplasma y ureaplasma en vesículas seminales y prepucio de toros de matadero, reportando  55 muestras positivas a Mycoplasmatales de los géneros Mycoplasma y Acholeplasma provenientes de 64 muestras de raspado prepucial de toros, y 41 muestras positivas a u-reaplasma.  De 64 muestras de vesículas seminales de toros se obtuvo 15 muestras positivas a mycoplasmas, sin aislarse ureoplasmas. De las 69 cepas aisladas, 22  crecieron en medio sólido sin suero, porque no dependen de colesterol para su desarrollo, por lo cual se las ubica en la familia Acholeplasmataceae. En la prueba de inhibición del desarrollo frente a un suero homólogo se obtuvo que 21 cepas correspondían a M. bovigenitalium, 4 cepas a M. bovis y 12 a A. laidlawii. En la prueba de inmunodifusión doble se tipificaron 16 cepas como M. bovigenitalium, 7 como M. bovis y 9 como A. laidlawii.

Durante el mes de julio de 1997 se realizaron exámenes bacteriológicos para el aislamiento de mycoplasmas en 71 muestras de leche de estanque provenientes de rebaños lecheros del sur de Chile. Además, se cultivaron 53 muestras compuestas de leche de vacas con mastitis clínica o con elevado recuento de células somáticas. Los aislamientos de Mycoplasma se identificaron a nivel de especie mediante una prueba indirecta de inmunoperoxidasa. Mycoplasma bovis se aisló en 5 rebaños y Acholeplasma laidlawii en dos rebaños. De las muestras individuales de vaca solo una resultó positiva a A. laidlawii, siendo las 52 restantes negativas a mycoplasma. Esta es la primera comunicación sobre aislamiento de mycoplasmas de leche de vacas en Chile (Sickles,  Kruze y González, 2000).

Anexo: Estudios de mycoplasmas en Argentina:

Aislamiento de Mycoplasma equigenitalium de útero de yeguas con problemas reproductivos (Trabajo realizado en La Plata, Argentina) Se tomaron muestras de 16 yeguas destinadas a la reproducción en haras, que se encontraban en etapa de anestro y presentaban problemas reproductivos. Seis fueron extraídas de animales normales que actuaron como testigos. De las 16 yeguas estudiadas, se observó colonias típicas del género Mycoplasma, en una sola de ellas (6,25%). En las muestras de animales testigos no se observó desarrollo de Mycoplasmas. Luego de su donado y forma paralela con la cepa de referencia T-37 se realizaron las siguientes pruebas: Fermentación de la glucosa. Hidrólisis de la arginina. Reducción del 2,3,5 thiphenil tetrazolium, actividad de fosfatasa, observación de la producción de 'Film and Spot', técnica de inmunofluorescencia directa en bloques de agar y electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. En todas las técnicas realizadas, la cepa de referencia T-37 y la aislada, mostraron idénticos resultados por lo que esta última fue caracterizada como Mycoplasma equigenitalium. La posibilidad de implicar al M. equigenitalium como responsable de infertilidad en equinos a partir de este hallazgo sólo es presuntiva debido a su baja incidencia con respecto a animales sin patología (diferencia no significativa: chi cuadrado > 0,05), quizá este microorganismo sea un patógeno oportunista o sólo produzca manifestaciones de subfertilidad en casos esporádicos (Copes  et al, 1995.


En un estudio realizado en La Plata Argentina en 1997 se evidenció la presencia de Mycoplasma felis solamente en animales que mostraron signos de conjuntivitis y enfermedades de las vías respiratorias altas. En animales clínicamente sanos no se aisló M. felis (Copes et al, 1997).

Se  estudia la presencia de la infección por M. suis en la Argentina y estimar la sensibilidad (S) y la especificidad (E) de las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del agente. Se recolectó sangre de 282 cerdos pertenecientes a 38 granjas. El estudio pudo confirmar la presencia de M. suis en Argentina y la habilidad diagnóstica de  PCR para la detección de la bacteria (Pereyra,  Pérez,  Messik et al. 2011).


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         Pecuarias y Médico Veterinarias. Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad de Chile.
                                                                 



 

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