lunes, 7 de noviembre de 2011

DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS EN LECHE POR RING TEST Y ELISA. López, Best y Morales

Archivos de medicina veterinaria


Arch. med. vet. v.30 n.1 Valdivia 1998

Diagnóstico de brucelosis bovina en leche por el
Ring Test y ELISA en lecherías de la
provincia de Ñuble (VIII Región)*

J. LOPEZ1, M.V. M. Sc.; A. BEST1, M.V.; C. MORALES1, M.V.

1Laboratorio de Microbiología, Departamento de Patología Animal, Facultad de Medicina Veterinaria,
Universidad de Concepción, Campus Chillán, Casilla 537, Chillán, Chile.

SUMMARY

Bovine brucellosis diagnosis in milk by Ring Test and Elisa in dairy farms
of Ñuble (VIII Region, Chile)

ELISA and Ring Test were compared as diagnostic tests for bovine brucellosis in bulk tank refrigerated milk from 60 dairies in the Ñuble Province, VIII Region, Chile, from November to December. Samples were stratified according to the number of cows in the farm. Diagnosis obtained from both methods gave similar results: 18 positive and 42 negative. The difference was established in 5 samples (8.3%) that were classified as weak positive to the Ring Test and confirmed as positives by ELISA. Furthermore, it was determined that there was 30% prevalence of bovine brucellosis in dairies with refrigerated tanks in the Ñuble province. The ELISA proved to be a reliable diagnostic test of bovine brucellosis in bulk milk.

Palabras claves: ELISA, leche, prevalencia.

Key words: ELISA, milk, prevalence.

INTRODUCCION

La brucelosis es una enfermedad infectocon-tagiosa, aguda o crónica, que afecta tanto a los animales como al hombre, causada por bacterias del género Brucella. Se reconocen actualmente seis especies: B. melitensis, B. abortus, B. suis y B. neotomae del grupo S y B. ovis y B. canis del grupo R (Corbel y Brinley-Morgan, 1984). Las cepas de Brucella de una misma especie difieren en algunas características, lo que ha permitido clasificarlas en biotipos para estudios epidemio-lógicos (Meyer, 1990). Las pérdidas económicas, expresadas en la disminución de la productividad en el rebaño bovino, se resumen en una menor producción de terneros por abortos, infertilidad en vaquillas, aumento del lapso interparto, menor producción de leche, alta tasa de reemplazos y pérdidas de peso en canales de carne (Nicoletti, 1994).

El último estudio de prevalencia nacional en Chile desde la IV a la X Región en el año 1991, fue de un 2.4%. La baja disminución de la prevalencia, en comparación al año 1982 (2.9%), ha decidido al Ministerio de Agricultura aplicar el programa de erradicación de la enfermedad (Vera, 1996).

Actualmente para el diagnóstico de la brucelosis bovina existen diversos métodos de diagnóstico, que varían en sensibilidad y especificidad (MacMillan, 1990; Díaz y Blasco, 1994). De éstos, los más utilizados en suero sanguíneo son Seroaglutinación Estándar (SAE), Fijación del Complemento (FC), Rosa Bengala (RB) y Rivanol (Riv). En leche, el más utilizado es el Ring test (RT). Ultimamente se han incorporado métodos inmunoenzimáticos o ELISA, tanto en suero sanguíneo como en leche (Nielsen y col., 1988, 1989; Nielsen, 1990). El RT es un método satisfactorio y poco costoso para inspección de rebaños lecheros en la detección de brucelosis; sin embargo, la principal limitación es el factor de dilución que ocurre en los grandes rebaños lecheros con grandes cantidades de leche que se almacenan en los estanques de recolección y las reacciones falsas positivas como resultado de vacunaciones con cepa 19, período de lactancia, condiciones ambientales e infecciones no específicas (Nicoletti, 1994). Todos los isotipos de anticuerpos en la leche (IgA, IgM, IgG1 e IgG2) pueden tomar parte en el RT positivo, pero la presencia de IgA en aquellas reacciones positivas, con o sin otro isotipo, indica que éste es el principal isótopo involucrado en la reacción junto a IgM (Sutra y col., 1986; Díaz y Blasco, 1994). En 1992, Durand y col. compararon los resultados del RT con los obtenidos por métodos serológicos, concluyendo en la necesidad de incorporar una prueba más sensible que pueda ser utilizada en volúmenes mayores de leche, ya que un gran número de muestras negativas al RT fueron serológicamente positivas a Fijación de Complemento. Heck y col. (1980) compararon los resultados de ELISA en leche y suero sanguíneo de un mismo animal. Ellos indicaron que sólo una muestra resultó negativa en leche y positiva en suero, indicando una alta correlación entre el test de ELISA en leche con los diagnósticos serológicos. Por otro lado, Thoen y col. (1983) concluyen que ELISA en leche es más específico e igualmente sensible que el RT. Boraker y col. (1981) demostraron una alta correlación entre el ELISA en leche con los cultivos bacteriológicos. Sin embargo, Bercovich y Taaijke (1990) señalan que aunque el ELISA es una prueba altamente específica, puede fallar algunas veces en detectar Ac contra Brucella en estanques que contengan leche de una única vaca infectada (con baja concentración de IgG1). Por otro lado, Kerkhofs y col. (1989) obtuvieron una especificidad para ELISA en leche y RT de 99.9% y 99%, respectivamente, y una sensibilidad de 98.6% para ELISA y 56% para el RT.

El presente trabajo tiene como objetivo determinar la eficiencia de la prueba ELISA en el diagnóstico de la brucelosis bovina en leche a partir de estanques enfriadores, comparándola con la prueba del RT y la determinación de la prevalencia predial en los principales planteles lecheros de la provincia de Ñuble, Chile.

MATERIAL Y METODOS

El estudio fue realizado con 60 muestras correspondientes a 60 predios lecheros de la provincia de Ñuble (VIII Región de Chile). Las muestras fueron recolectadas durante los meses de noviembre y diciembre de 1995, meses que corresponden a la mayor recepción de leche por parte de las plantas lecheras, representado por el mayor número de animales que se encuentran en producción (ODEPA, 1995). Los predios fueron clasificados, según el número de animales en lactancia al momento de la toma de muestra, en tres grupos: estrato A (menos de 50 vacas) con 17 predios, estrato B (entre 50 y 100 vacas) 27 predios y estrato C (entre 100 y 150 vacas) con 16 predios. Se recolectaron 50 ml de leche en frascos de plástico estériles, previa agitación en el estanque de frío durante 10 minutos, y mantenidos en refrigeración a 4° C por 24 horas.

Para la prueba del Ring Test, el antígeno utilizado se obtuvo desde el Instituto de Microbiología de la Universidad Austral de Chile. Para la realización de la prueba fueron extraídos del frío, tanto las muestras como el antígeno, hasta alcanzar la temperatura ambiental. Se depositó 1 ml de leche en un tubo Khan y se agregaron 33 µl de antígeno mezclado por inversión varias veces e incubado a 37° Celsius durante 1 h. Las muestras fueron leídas, clasificándose como positivas, positivas débiles y negativas como lo descrito en MacMillan (1990). Para la prueba de ELISA se realizó como lo descrito por el fabricante del kit Chekit® Brucellotest de Hoescht que utiliza microplacas previamente sensibilizadas con el antígeno inactivado, monofásico de B. abortus. Se depositaron 200 µl de las muestras de leche en cada uno de los pocillos de la microplaca por duplicado. Como controles positivos y negativos se utilizaron los proporcionados por el kit, 200 µl y diluidos 1:2 y fueron incubados por 90 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. Luego de la fase de lavado, se depositaron 200 µl de conjugado monoclonal Anti-IgG peroxidasa bovino diluido 1:200 en cada uno de los pocillos e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente del segundo lavado, se agregaron 200 µl del cromógeno proporcionado por el kit. Los resultados fueron leídos en un espectrofotómetro a 405 nm (Dynatech®). Las Densidades Opticas (DO) de las muestras problemas en duplicado fueron promediadas y corregidas por sustracción de la DO del control negativo, estas fueron divididas por las DO de los controles positivos por 100. Se consideraron muestras positivas sobre 100%, positivas débiles o dudosas, entre 70% y 100% y negativas, bajo 70%.

RESULTADOS Y DISCUSION

Del total de predios en estudio, 28.33% corresponden al estrato A (menos de 50 vacas en lactancia), 45% al estrato B (entre 50 y 100 vacas) y 26.67% al estrato C (entre 100 y 150 vacas). Existe un número de animales que no fue muestreado en cada predio, ya que no se encontraban en período de lactancia al momento del estudio. Este sería un inconveniente que presentarían estas pruebas diagnósticas de "screening", ya que excluyen animales en estado avanzado de gestación (período seco), vaquillas preñadas, terneras y machos (Nicoletti, 1994). Por ello, se recomienda su uso a intervalos de tiempo permitiendo, por una parte, un diagnóstico seguro, y por otro lado, un mejor control del curso de la infección en el ganado. Los predios en este estudio se encontraban en programas de erradicación de brucelosis bovina, utilizando la vacunación de terneras con Cepa 19 entre los 3 y 8 meses de edad. La vacunación de ganado adulto con Cepa 19 en dosis reducida no fue realizada en ninguno de los rebaños en estudio, descartando así la posibilidad de encontrar anticuerpos de origen vacinal en la leche, los cuales podrían ser los responsables de algunas de las reacciones positivas, ya que estos anticuerpos originados en respuesta a esta modalidad de vacunación permanecen altos al menos durante un año, interfiriendo en el diagnóstico ya sea en suero sanguíneo o leche (Nicoletti, 1990).

Tabla 1

Diagnóstico de brucelosis bovina por Ring Test y ELISA en leche según número de vacas en lactancia.

Bovine brucellosis diagnosis in milk by Ring Test and ELISA according to number of milk production cows.

Muestra
(n)
Estrato

A
B
C
RT
ELISA
RT ELISA RT ELISA

Positivo 1 5 6 6 4 5
Positivo débil 4 0 1 1 2 1
Negativo 12 12 20 20 10 10

Total 17 27 16

Los resultados obtenidos por el RT y ELISA en los distintos estratos lecheros son presentados en la tabla 1. Se observa que el mayor número de reacciones positivas se encuentra en aquellos predios que poseen entre 50 y 100 vacas en lactancia (estrato B); esto puede ser atribuido al mayor número de muestras que corresponden a este estrato y que fueron utilizadas en el estudio (45%). Se midieron los resultados obtenidos por ambas técnicas de diagnóstico mediante la comparación de proporciones. La concordancia entre las técnicas ELISA y RT, en la detección de la infección por Brucella abortus (tabla 2), se puede apreciar un completo acuerdo en las 60 muestras, correspondiendo a 18 muestras positivas y 42 muestras negativas para ambos métodos. La diferencia entre ambos métodos se estableció en los diagnósticos de muestras positivas débiles por el RT (n=5, 8.3%), siendo confirmadas positivas por el método de ELISA, apareciendo este último como un excelente método para detectar anticuerpos contra Brucella abortus en leche bovina. Boraker y col. (1981) obtuvieron leches negativas al RT y positivas al ELISA (contrastando con los resultados obtenidos en este estudio), atribuyendo una mayor especificidad a este último. Por otro lado, todas las muestras clasificadas como positivas por el RT lo fueron también al ELISA. Kerkhofs y col. (1989, 1990), en un estudio sobre un total de 1.200 predios lecheros en Francia, obtuvieron una sensibilidad de un 22% mayor para el ELISA en relación a los resultados entregados por el RT, atribuyendo una mayor capacidad diagnóstica al primero. Por otro lado, Díaz y Blasco (1994) mencionan como factores determinantes en un Ring Test positivo, al nivel de excreción de anticuerpos en la leche y a la cantidad de grasa de ésta, entre otros factores. El ELISA no depende de factores propios de la leche, sino que directamente con el nivel de anticuerpos que ella presente. Esto le otorga mayor capacidad propia para desarrollar sus diagnósticos. Además la lectura de los resultados no es realizada a simple vista por un operario, sino por un lector automático, lo que podría influir en la interpretación final de la reacción.

Para obtener una visión acerca del nivel de infección por Brucella abortus en los predios lecheros de la provincia de Ñuble que enfrían su leche, es que se determinó la prevalencia predial de la enfermedad usando los resultados de ambas técnicas diagnósticas (tabla 2). El resultado fue de 30% para ambos métodos. Cabe señalar que el resultado obtenido aquí estaría por sobre la realidad regional manejada por el S.A.G. que alcanzaría a un 22% de prevalencia predial (Vera, 1996). Esto indicaría que la enfermedad se encuentra presente aún en muchos rebaños, ocasionando pérdidas a los productores, siendo necesaria la implementación de nuevas medidas destinadas al control de esta importante enfermedad zoonótica. Adicionalmente, las prevalencias para cada estrato lechero usando los resultados del RT y del ELISA (tabla 3) resultaron en un 29.4%, 25.9% y un 37.5% para los estratos A, B y C, respectivamente.

Los porcentajes de positividad por estrato muestran al estrato C (entre 100 y 150 vacas en lactancia) como aquel que alcanza el mayor porcentaje de predios positivos para ambos métodos. En estos predios, el manejo preventivo para el control de la brucelosis bovina se complica, ya que se requiere de infraestructura necesaria como maternidades que permitan el cambio de cama o bien la desinfección del piso, pudiendo eliminar alguna posible contaminación con Brucella abortus luego del parto (Nicoletti, 1994).

Tabla 2

Concordancia entre los métodos ELISA y Ring Test en el diagnóstico de la
brucelosis bovina en leche.

Concordance between ELISA and Ring Test methods in bovine brucellosis
diagnosis in milk.

Resultado Número de muestras %

ELISA+/RT+ 18 30
ELISA-/RT- 42 70
ELISA+/RT- 0 0
ELISA-/RT+ 0 0

Total 60 100

Tabla 3

Prevalencia de brucelosis bovina según número de vacas en lactancia determinado
por Ring Test y ELISA en leche.

Prevalence of bovine brucellosis according to number of milk producing cows determined by
ELISA and Ring Test in milk.

Estrato Muestras
positivas
(n)
Muestras
negativas
(n)
Total de
muestras
(n)
Prevalencia
%

A 5 12 17 29.4
B 7 20 27 25.9
C 6 10 16 37.5

RESUMEN

Se utilizaron los métodos de ELISA y Ring Test en leche para diagnosticar brucelosis bovina en estanques de recolección en frío a 60 predios lecheros de la provincia de Ñuble, VIII Región de Chile, durante los meses de noviembre y diciembre de 1995. Estos fueron estratificados en relación al número de vacas en producción de leche. Los resultados obtenidos por ambos métodos fueron similares, 18 muestras positivas y 42 negativas. La diferencia se estableció en 5 muestras (8.3%) que fueron clasificadas como positivas débiles al Ring Test y confirmadas como positivas por ELISA. Se determinó que la prevalencia predial de brucelosis bovina fue de un 30% en predios lecheros con estanque enfriador en la provincia de Ñuble. El método de ELISA resultó ser una prueba confiable para diagnosticar brucelosis bovina en leches colectivas.
____________________________________
Aceptado: 03.09.97.
* DIUC 96.152.005-1.0.

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