- Aislamiento de Mycoplasma felis apartir de gatos con enfermedad respiratoria
1 Laboratorio de Diagnóstico e Investigaciones Bacteriológicas, 2 Laboratorio de Diagnóstico e Investigaciones Bacteriológicas, 3 Cátedra de Microbiología, 4 Cátedra de Pequeños Animales. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de La Plata, 5 Laboratorio de Diagnóstico e Investigaciones Bacteriológicas; Cátedra de Microbiología
Se aisló Mycoplasma felis a partir de gatos con signos de conjuntivitis y de enfermedad respiratoria. Los hisopados nasales y conjuntivales fueron sembrados en medio Hayflick modificado (HM) durante 3 días observándose en algunos de los tubos turbidez, los cuales fueron repicados en H.M. sólido durante 48 horas. Se observaron colonias morfológicamente compatibles con el Género Mycoplasma, con formación de film & spot. La caracterización de Género se realizó mediante pruebas bioquímicas, la identificación serológica mediante las siguientes pruebas: Inhibición del Crecimiento (IC) y Epiinmunofluorescencia (EIFI) utilizando suero anti-M. felis CO y la determinación del perfil proteico mediante la técnica SDS-PAGE confrontándolo con el de la cepa patrón. Varios autores han aislado Mycoplasma felis en 20% de gatos sanos y en 100% de gatos con signos clínicos de la enfermedad. Los resultados de este estudio evidenciaron la presencia de Mycoplasma felis solamente en los animales que mostraron signos de conjuntivitis y enfermedades de las vías respiratorias altas. El aislamiento de Mycoplasma felis en gatos con estos signos es de importancia en la clínica, debido a que los antibióticos frecuentemente usados no son efectivos frente a micoplasmas.
Palabras clave: Mycoplasma felis, enfermedad respiratoria.
Abstract
Mycloplasma felis was isolated from cats with respiratory signs and conjunctivitis. Nasal and conjunctival samples were inoculated in Hayf ick modified (HM) broth for 3 days. Tubes showing turbidity were subcultured in solid HM for 48 hours. Colonies morphologically compatibles with Mycoplasma genus were observed with film and spot. The genus was identified based on biochemical properties and serology conducted by growth inhibition and epiimmunof uoressence using anti M. felis CO sera. The protein profile determination was made using the SDS-PAGE technique compared with a standard strain.
Several authors have isolated Mycoplasma felis in 20% of healthy cats and in 100% of cats with clinical signs of the disease.
The results of the present study showed that Mycoplasma felis would be detected only in those animales showing conjuctivitis and upper respiratory tract disease.
The isolation of Mycoplasma felis from cats showing these signs is of clinical importance because the antibiotic therapy used most frequently is not effective against Mycoplasmas.
Key words: Mycoplasma felis, respiratory disease.
Introducción
Si bien la patogenicidad de los micoplasmas en gatos no está bien definida, éstos participan en una variedad de enfermedades felinas tales como afecciones respiratorias, conjuntivitis y artritis. La inoculación experimental de Mycoplasma felis y M. gateae en gatos produjo conjuntivitis y compromiso de vías respiratorias, las cuales se tradujeron en afecciones crónicas (Campbell y col. 1973; Rosendal, 1979). También estas cepas fueron aisladas de gatos inmunocomprometidos que mostraron signos clínicos de poliartritis. Los microorganismos del Género Mycoplasma, poseen particularidades por las cuales se hace imposible su aislamiento empleando métodos bacteriológicos de rutina. Los medios de cultivos deben ser enriquecidos con colesterol y NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) y la observación de las colonias se lleva a cabo por medio de lupa estereoscópica. La identificación definitiva de las especies se realiza por medio de pruebas serológicas tales como la inhibición del Crecimiento y Epi-inmunofluorescencia.
El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de microorganismos del Género Mycoplasma, a partir de gatos que presentaban conjuntivitis y afección en vías respiratorias superiores.
Materiales y métodos
Toma y procesamiento de las muestras
Las muestras se obtuvieron de 8 gatos mestizos, 6 machos y 2 hembras, de edades entre 18 meses y 3 años. Todos los machos presentaban conjuntivitis y enfermedad respiratoria de las vías superiores, en tanto que las 2 hembras se encontraban clínicamente sanas. Las muestras fueron obtenidas a través de hisopados conjuntivales y nasales por medio de hisopos (Falcon 2069, Vacutainer Systems. USA) embebidos en medio Hayflick modificado (HM) (Freundt, 1983). El material obtenido fue transportado hasta el laboratorio en tubos de hemólisis conteniendo 2 ml de HM a 4°C.
Las muestras fueron sometidas a agitación por medio de un agitador (vórtex), se centrifugaron a 7.500 g durante 10 min. Del sobrenadante obtenido se tomaron 200 ml que fueron inoculados en 2 ml de HM, e incubados a 37°C durante 3 días. Los cultivos en los que se observó turbidez, fueron inoculados en medio HM con el agregado de 1,3% de agar Noble, y se los incubó a 37°C. A partir de las 48 horas de incubación, las placas se observaron diariamente con lupa de 40 aumentos. En aquellas placas en las que se visualizaron colonias con características del Género Mycoplasma se procedió al donado en medio sólido, y a la filtración a través de membranas de 0,45 nm (Millipore USA). Las cepas obtenidas fueron inoculadas simultáneamente en medio libre de suero equino.
Caracterización bioquímica de las cepas aisladas
Las siguientes pruebas bioquímicas fueron utilizadas para la caracterización bioquímica de las cepas aisladas: fermentación de la glucosa (FG) (Razin, 1983), hidrólisis de la arginina (HA) (Barile, 1983), producción de fosfatasa (PF) (Bradbury, 1983), reducción del tetrazolio (RT) (Senterfit, 1983 (b)), producción de 'film spot' (FS) (Freundt, 1983) y se corroboró la capacidad de desarrollo en presencia de digitonina (PD), (Tully, 1983).
Caracterización serológica de las cepas aisladas
Se llevaron a cabo las pruebas de Inhibición del Crecimiento (IC) (Wallace, 1983) y Epi-inmunofluorescencia (EIFI) de colonias en bloques de agar (Gardella y col., 1983). Se usaron las cepas de referencia CO Mycoplasma felis y MART M. gateae, ambas cedidas gentilmente por el Instituto de Sanidad Animal, Tsukuba, Japón. Los antisueros fueron realizados en conejo (Senterfif, 1983, a).
Electroforesis proteica
Se llevó a cabo utilizando la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) (Laemmly, 1970). Se usó una concentración de acrilamida del 12,5% y en el gel concentrador del 4%. El buffer de muestra se realizó según la técnica de Mouches y Bové (1983). La corrida se realizó con un voltaje continuo de 100 V, con el miliamperaje discontinuo, en un minigel de 9 x 7 cm durante 60 minutos. Como método de coloración proteica se usó Azul de Coomasie.
Resultados y discusión
Se observó turbidez en medio HM solamente en las muestras que provenían de gatos que presentaban signos clínicos de conjuntivitis y afecciones respiratorias altas. El resultado de la donación de las mismas evidenció la presencia de colonias características del Género Mycoplasmas en HM sólido. La observación se llevó a cabo al cuarto día de incubación a 37°C en atmósfera aeróbica. Las cepas aisladas no se desarrollaron en medios sin suero equino y en presencia de digitonina.
Bioquímicamente las cepas aisladas se comportaron en forma similar a la cepa CO M. felis (Cuadro 1).
CUADRO 1. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LAS CEPAS DE REFERENCIA M. FELLS CO, M. GATEAE MART Y DE LAS CEPAS AISLADAS| cepas | glucosa | arginina | tetrazolio | fosfatasa | film & spot | digitonina |
| M. felis CO | + | - | - | + | + | - |
| M. gateae | - | + | - | - | - | - |
| Mart |
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| Cepas | + | - | - | + | + | - |
| aisladas |
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La caracterización serológica mediante las pruebas de IC y EIFI, evidenció que las cepas aisladas fueron inhibidas por los sueros específicos y produjeron fluorescencia específica cuando se usó suero hiperinmune anti-M. felis CO.
Los perfiles proteicos de las cepas aisladas concordaron casi en su totalidad con el perfil proteico de la cepa M. felis CO. (Fig. 1).
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| Figura 1. Patrón electroforético en SDS- PAGE de cepas de M. felis aisladas a partir de gatos. |
Las cepas aisladas fueron clasificadas como Mycoplasma felis.
Discusión
Varios autores han aislado M. felis de gatos sanos (20%) y en gatos con signos clínicos de la enfermedad (100%) (Brown, y col., 1990; Blackmore y Hill. 1973; Rosendal, 1979).
Los resultados obtenidos en este estudio evidenciaron la presencia de M. felis solamente en animales que mostraban conjuntivitis y afecciones respiratorias de las vías superiores. En animales clínicamente sanos no se aisló M. felis. Sin embargo el número de animales analizados en este trabajo no es suficiente para responsabilizar al microorganismo de la producción de cuadros patológicos. El aislamiento de M. felis en gatos con signos clínicos podría indicar un poder patógeno potencial (Campbell y col., 1973). No obstante, esto ha sido pobremente definido y, si bien se ha aislado de procesos patológicos en conjuntiva, fosas nasales, tráquea, pulmón y articulaciones (Campbell y col., 1973; Rosendal, 1979), algunos autores consideran al M. felis como parte de los microorganismos normales de los gatos.
La metodología empleada para el aislamiento de microplasmas puede considerarse confiable y de fácil realización. Según la bibliografía consultada, en Argentina, M. felis no ha sido aislado a partir de gatos con anterioridad al presente trabajo. El aislamiento de M. felis en gatos con signos clínicos puede considerarse como de importancia para veterinarios clínicos, ya que en estos casos los antibióticos con mecanismos de acción ejercida en la pared bacteriana (penicilinas, ampicilinas, entre otros) no son activos frente a M. felis.
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